Приложение 7 (обязательное)

Приложение 9 (обязательное)

Метод определения общих колиформных бактерий в сточных водах

К общим колиформным бактериям (ОКБ) относят грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, способные расти на дифференциальных лактозных средах (типа Эндо), ферментирующие лактозу до образования альдегида, кислоты и газа при температуре 37 °С в течение 24 часов. Общие колиформные бактерии определяют методом прямого посева на среду Эндо точно отмеренных объёмов воды и методом мембранной фильтрации с последующим выращиванием посева при температуре 37 °С в течение 18-24 часов и подсчётом образующих альдегид колоний.

Определение ОКБ титрационным методом не рекомендуется вследствие низкой точности получаемых результатов, большого объёма работы при 2 или 3 рядовом посеве.

Условия отбора пробы, транспортировки и хранения, подготовка посуды, питательных сред, приготовление разведений должны соответствовать методическим указаниям по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоёмов и питьевой воды.

2.1. Готовят ряд десятикратных разведений пробы сточной воды.

Объёмы для посева и число разведений устанавливают в каждом конкретном случае исходя из предполагаемого уровня загрязнения с таким расчётом, чтобы получить на чашках изолированные колонии ОКБ в количестве, при котором имеет место минимальная ошибка метода - от 10 до 50 КОЕ на чашку.

2.2. Из каждого выбранного разведения делают посев параллельно на две чашки Эндо, предварительно подсушенные, внося по 0,5 мл или по 0,1 мл на каждую из двух чашек. При посеве 0,5 мл внесённый объём распределяют по всей поверхности чашки покачиванием или стеклянным шпателем, после чего подсушивают. При отсутствии специального аппарата для подсушивания, чашки с посевами помещают приоткрытыми в термостат до полного испарения воды, после чего переворачивают вверх дном. При посеве 0,1 мл посевы растирают шпателем до полного впитывания воды, переворачивают вверх дном и ставят в термостат.

2.3. При исследовании обеззараженной воды, когда допустимое содержание ОКБ в стоках не более 100 КОЕ/100 мл используют один из двух методов: прямого посева или мембранной фильтрации по МУ 2285-81. Прямым посевом делают высев на 4 чашки по 0,5 мл из неразведённой пробы воды. Через мембранный фильтр профильтровывают 1 мл, 2,5 мл и 5 мл.

При контроле обеззараженных стоков, когда норматив не более 10 КОЕ/100 мл ОКБ, работают методом мембранной фильтрации и профильтровывают 10 мл, 25 мл и 50 мл исследуемой воды. Фильтры помещают на среду Эндо.

2.4. Посевы инкубируют 24 (± 2) часа при температуре 37 (± 1) °С.
3. Учёт результатов

Подсчитывают выросшие на поверхности среды Эндо колонии, характерные для общих колиформных бактерий, ферментирующих лактозу и образующих альдегид: красные и тёмно-красные с металлическим блеском и без него, слизистые розовые с тёмно-малиновым центром. Наличие альдегида можно проверить по отпечатку на среде, если петлёй отодвинуть подозрительную колонию.

В сомнительных случаях, чтобы подтвердить принадлежность колоний к ОКБ, необходимо убедиться в способности ферментировать лактозу до кислоты и газа. С этой целью делают посев на полужидкую среду с лактозой или СИБ-лактозу и инкубируют посев при температуре 37 °С 4-6 часов. При образовании кислоты и газа дают положительный ответ. Если среда не изменила цвета или при наличии только кислоты, посевы ставят обратно в термостат и окончательно учитывают результат через 24 часа.

При необходимости исключить оксидазоположительную микрофлору выполняют оксидазный тест. При прямом посеве накапывают реактив на подозрительные колонии, либо наносят часть колонии штрихом на полоску фильтровальной бумаги, смоченную оксидазным реактивом, или СИБ-оксидазу.

Если необходимо проверить оксидазную реакцию колоний, выросших на мембранных фильтрах, то фильтр накладывают на диск фильтровальной бумаги, обильно смоченной реактивом. Все изменившие цвет колонии (оксидазоположительные) из учёта исключают.

Приготовление реактива и техника выполнения реакции по МУК 10.05.045.03.

Для подсчёта выбирают чашки, посеянные из одного разведения, на которых выросло от 10 до 50 изолированных колоний. На них подсчитывают число колоний, отнесённых к общим колиформным бактериям, полученное число суммируют.

Если сделан посев 2-х 0,5 мл, то сумма колоний соответствует числу колиформ в разведении. Полученную сумму пересчитывают на объём 100 мл с учётом разведения.

Пример: При посеве из 5-го разведения 2-х объёмов по 0,5 мл на одной чашке получены 16, на другой 20 колоний ОКБ. Тогда 16 + 20 = 36:10-⁵ ´ 100 = 3,6 10⁸ КОЕ/100 мл ОКБ.

Пример: При посеве 2-х объёмов по 0,1 мл из 5-го разведения на одной чашке получены 22 колонии, на другой - 28 колоний. Тогда 22+28=50: 2×10⁶ ´ 100 = 2,5 10⁸ КОЕ/100 мл ОКБ.

Допускается учёт результата, но с отметкой в протоколе:

если на чашках выросли менее 10 или более 50 колоний;

если на одной чашке сливной рост, подсчёт выполнен на другой чашке из этого разведения.

При подсчёте результата ОКБ в обеззараженной воде суммируют все колонии ОКБ, выросшие на чашках или фильтрах, где получены изолированные колонии, и вычисляют результат по формуле:

Х = (а×100):V,

где Х - число ОКБ в 100 мл;

При этом объём, где нет роста колоний, так же учитывают.

При необходимости получения информации о численности бактерий - показателей свежего фекального загрязнения, можно продолжить анализ и подтвердить среди выросших тёмно-красных с металлическим блеском колоний число термотолерантных путём посева 10-14 колоний в прогретую до температуры 44 °С среду с лактозой с последующей инкубацией при температуре 44 ± 0,5 °С (по ИСО 9308-1 1990 г. и МУК 10.05.045.03).