Учебно-методическое пособие Нижний Новгород, 2005

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Кафедра довузовой подготовки

А.Н. Леонтьева

Биосинтез белка

и его регуляция
Учебно-методическое

пособие

Биосинтез белка и его регуляция. Пособие для школьников, абитуриентов, студентов/ Автор кандидат биологических наук, доцент А.Н. Леонтьева − Нижний Новгород, Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского 2005 г.

С учетом новейших достижений биохимии рассмотрена проблема биосинтеза белка и его регуляции.

Пособие предназначено для школьников и абитуриентов, интересующихся проблемами биохимии и молекулярной биологии. Основная цель − расширить кругозор читателя, ознакомить его с современным состоянием наших знаний в области биосинтеза белка и его регуляции, помочь преодолеть различия между школьным и университетским курсами биологии.

Пособие будет полезным учителям средней школы и студентам младших курсов, специализирующимся по биологии.

Нижегородский государственный университет

им. Н.И.Лобачевского, 2005
ВВЕДЕНИЕ

Выяснение механизма биосинтеза белков во всем многообразии их видовой специфичности и биологической активности было одной из крупнейших проблем биохимической науки. Лишь к концу XX столетия были выяснены все основные принципы, на которых основывается этот процесс, и расшифрованы структуры биологических макромолекул, принимающих в нем участие.

В эукариотических клетках для белкового синтеза необходимы около 300 специфических макромолекул, в том числе свыше 70 рибосомных белков, не менее 20 активирующих ферментов, более 10 вспомогательных ферментов и особых белковых факторов, свыше 70 видов транспортных и рибосомных РНК, множество матричных и низкомолекулярных ядерных РНК. В процессах созревания белков участвует не менее 100 дополнительных ферментов. Многие из этих макромолекул собраны в сложные трехмерные структуры и органеллы.

Вскрыты и фундаментальные закономерности, на которых основывается биосинтез белков: биологическое кодирование, принцип комплементарности, сборка биополимеров на матрицах.

Пособие предназначено для и абитуриентов и школьников, интересующихся проблемами биохимии и молекулярной биологии, и студентов младших курсов. Основная цель − ознакомить читателя с современным состоянием наших знаний в области биосинтеза белка и его регуляции, помочь преодолеть различия между школьным курсом биологии и университетским.

1. 
   Молекулярная организация генетического материала клетки
   

Белки синтезируются под прямым контролем генетического материала клетки. Первичная структура всех белков клетки закодирована в молекулах ДНК, составляющих основу хромосом. Ген - это участок ДНК, кодирующий синтез одной молекулы (белка или РНК).

Генетическая информация переписывается с ДНК на мРНК (транскрипция), а затем переводится в аминокислотную последовательность белковой молекулы (трансляция) с помощью рибосом (рис. 1). Образующиеся полипептидные цепи определяют признаки клетки и вместе с тем целого организма. Так происходит экспрессия (проявление) генетической информации.

Рис. 1. Транскрипция и трансляция мРНК прокариот (а); транскрипция, процессинг и трансляция мРНК эукариот (б).

Исследование геномов включает в себя анализ последовательностей нуклеотидов в цепи ДНК. C этой целью используются новые физические, химические, математические методы, специальные машины – роботы, мощные компьютерные программы. Этим заложены основы новой науки − которая получила название геномики.

Число генов варьирует в широких пределах - от 9 у мелкого бактериофага до 25 тысяч у человека (табл. 1).

Таблица 1

Число генов, полученное на основе расчетов или в результате расшифровки последовательностей нуклеотидов в геномах

Общими для всех организмов являются закономерности записи наследственной информации, принципы экспрессии генов в фенотипе – транскрипция и трансляция. Однако организация наследственного материала у прокариот и эукариот имеет свои особенности.

К 2000 году последовательности ДНК просто устроенных бактерий (50-60 видов) и вирусов расшифрованы с точностью до одного нуклеотида. Выделенные из вирусных частиц молекулы ДНК имеют либо линейную, либо кольцевую форму, двух- или одноцепочечную. В клетках прокариот наследственная информация содержится чаще всего в единственной кольцевой молекуле ДНК, которая располагается непосредственно в цитоплазме клетки. Например, ДНК кишечной палочки (E.coli) имеет длину около 1 мм, состоит из 4*10⁶ п.н. и образует 4 300 генов. Большинство последовательностей нуклеотидов уникальны, кодируют белки и РНК.

Эукариоты содержат ДНК в хромосомах ядра. Количество ДНК в эукариотических клетках в десятки, сотни, тысячи раз больше, чем у прокариот.

Так, у человека ДНК состоит из 3,2 - 3,5 млрд нуклеотидов, ее длина в диплоидном наборе составляет 174 см. Структурные гены составляют лишь около 3%. Роль остальных участков не раскрыта, они не транскрибируются и получили название «молчащей» или "эгоистической" ДНК.

Избыточность ДНК эукариот объясняется также прерывистой организацией большинства генов. Кодирующие последовательности экзоны чередуются с не кодирующими – интронами. Количество таких участков варьирует в разных генах. Например, ген овальбумина кур включает 7 нитронов, а ген проколлагена млекопитающих - 50. Эти участки транскрибируются, а затем удаляются из первичного транскрипта по средством сплайсинга (см. ниже).

В хромосомах эукариот ДНК находится в спирализованном состоянии. Выделяют несколько уровней компактизации хроматина. Первый уровень – нуклеосомный. Диспергированный хроматин выглядит в электронном микроскопе как цепочка бусин. Сердцевину нуклеосомы образует белковый кор, состоящий из восьми (по две молекулы каждого вида) простых щелочных белков - гистонов. На белковый кор, имеющий форму шайбы, «накручен» участок ДНК длиной 146 п.н. Свободные участки ДНК, соединяющие нуклеосомы, называют линкерными (связующими), они содержат от 15 до 100 п.н. Отрезок молекулы ДНК длиной около 200 п.н. вместе с белковым кором составляет нуклеосому.

Дальнейшая компактизация хроматина обеспечивается белком гистоном HI. Он соединяется с линкерной ДНК и двумя соседними нуклеосомами, сближает их друг с другом, образуя построенную по типу соленоида структуру, имеющую диаметр 20-30 нм, называемую элементарной фибриллой. Фибрилла укладывается в петли с помощью специальных (негистоновых) белков. Предполагают, что каждая петля является функциональной единицей генома. В результате такой упаковки получается структура диаметрш 100-200 нм, она называется интерфазной хромонемой (рис. 2-4). Отдельные участки хромонемы подвергаются дальнейшей компактизации, соседние петли объединяются в структурные блоки, которые выявляются в интерфазном ядре в виде глыбок хроматина. Эухроматиновые участки хромосом отличаются меньшей плотностью упаковки и могут транскрибироваться, однако для транскрипции необходима декомпактизация хроматина и временное ослабление связи ДНК с гистонами. Гетерохроматиновые участки обладают очень компактной организацией и генетически инертны.

Рис. 2. Хроматиновая фибрилла диаметром 20 - 30 нм. А - соединение соседних нуклеосом с помощью гистона HI; Б — цепочка хроматиновых глыбок, образуемых нуклеосомами и разделенных участками ДНК, свободными от белковых тел; В - возможная модель упаковки ДНК в хроматиновой фибрилле в виде соленоида.

Рис. 3. Петельная структура хроматина – интерфазная хромонема А – хроматиновая фибрилла с присоединенными к ней негистоновыми белками; Б – образование петли на участке хроматиновой фибриллы; В – схема петельной организации участка хромасомы.

Рис. 4. Структурные блоки в организации хроматина. А - петельная структура хроматина; Б - дальнейшая конденсация хроматиновых петель; В - объединение петель, имеющих сходную структуру, в блоки с образованием окончательной формы интерфазной хромосомы.

В разные периоды онтогенеза освобождаются от гистонов и транскрибируются те или иные гены ДНК, отличающиеся в разных клетках, что приводит к развитию организма. Таким образом, геном имеет определенный язык программирования, собственную программу, записанную в ДHK в голографическом виде.

Непосредственное участие в биосинтезе белка принимают молекулы РНК трех видов: транспортная РНК (тРНК), рибосомная РНК (рРНК) и матричная, или информационная PНK (мРНК). Количество РНК в каждой клетке находится в прямой зависимости от количества вырабатываемого белка. Все виды РНК синтезируются непосредственно на ДНК, которая служит матрицей

2.1. Транспортная РНК (тРНК). Важная роль в процессе использования наследственной информации клеткой принадлежит тРНК. Доставляя необходимые аминокислоты к месту сборки пептидных цепей, тРНК выполняет функцию посредника. Каждой аминокислоте соответствуют две или большее число специфических тРНК.

Молекулы тРНК представляют собой полинуклеотидные цепи, состоящие из относительно небольшого числа нуклеотидов − 75 - 95, что соответствует молекулярной массе 24 000 - 31 000 дальтон. В структуре разных тРНК: выявлено много общих черт. Так, во всех тРНК 8 или более, нуклеотидов содержат необычные (модифицированные) азотистые основания, которые представляют собой производные главных оснований. В большинстве тРНК на 5’-конце находится гуанин, а на 3’-конце всех тРНК присутствует последовательность из трех нуклеотидов – ЦЦА.

В результате комплементарного соединения оснований, которые находятся в разных участках полинуклеотидной цени тРНК, она приобретает структуру, напоминающую по форме лист клевера. В ней выделяют четыре главные части, выполняющие различные функции. Центральная антикодоновая ветвь содержит антикодон – специфический триплет нуклеотидов, который комплементарен соответствующему кодону мРНК и может образовывать с ним водородные связи.

На противоположной стороне располагается акцепторный стебель, который присоединяет специфическую для тРНК аминокислоту к последовательности ЦЦA, стоящей на 3’-конце.

Ветвь 1, содержащая минорный нуклеотид дигидроуридин, обеспечивает контакт тРНК с рибосомой, а ветвь 3, содержащая псевдоуридин, - с ферментом АРСазой (рис.5).

Рис. 5. Строение типичной молекулы тРНК

Рис. 6. Трехмерная структура дрожжевой фенилаланиновой тРНК, установленная методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 3 Å. Она напоминает перевернутую латинскую букву L.

Каждая рибосома состоит из двух субчастиц – большой и малой. В эукариотической рибосоме малая субчастица 40S состоит из одной молекулы рРНК и 33-х молекул разных белков, большая - из трех разных молекул рРНК и около 40 белков. Прокариотические рибосомы и рибосомы митохондрий и пластид содержат меньше компонентов и имеют меньшие размеры. Молекулы рРНК выполняют, прежде всего, роль каркасов, на которых в строго определенном порядке крепятся рибосомные белки. Кроме того, рРНК обеспечивает связывание рибосомы с определенной нуклеотидной последовательностью мРНК, благодаря чему устанавливается начало считывания информации при образовании полипептидной цепи. 28S рРНК имеет каталитическую активность, то есть является рибозимом.

Специальные участки (или функциональные центры) рибосомы обеспечивай ее взаимодействие с тРНК. В первом - аминоациальном (А – центре) размещается тРНК, несущая аминокислотный остаток (аминоацил-тРНК). В P-центре (пептидильном) располагается тРНК, нагруженная цепочкой аминокислот, то есть растущим полипептидом. Участки образуются благодаря взаимодействию обеих субчастиц рибосом. В каждый момент биосинтеза белка в центрах рибосомы помещаются два кодона мРНК, которые взаимодействуют с двумя соответствующими им тРНК.

Рибосомные субчастицы имеют замысловатую форму, обеспечивающую выполнение ими их функций. Они "пригнаны" друг к другу, но между ними остается щель. Через щель проходит "прочитанная" молекула мРНК, отсюда же выдвигается новосинтезированная полипептидная цепь (рис. 7).

Существует четкое "разделение труда" между субчастицами рибосомы: малая субчастица отвечает за прием и декодирование генетической информации, то есть выполняет генетические функции, в то время как большая обеспечивает энзиматические реакции в процессе трансляции. Предполагают, что образование пептидной связи (реакция транспептидации) катализируется пептидилтрансферазным центром рибосомы, и основной вклад вносит рРНК.

Рис. 7. Расположение функциональных центров на малой (вверху) и большой (внизу) субчастицах рибосомы. Цепь мРНК связана с малой субчастицей в районе ее "шеи" и протягивается через этот мРНК-связывающий центр в ходе трансляции от 5'-конца (направлен вниз и вправо) к З'-концу (обращен вверх и влево). Две молекулы тРНК занимают А- и Р-участки на малой субчастице, будучи связаны своими антикодонами с двумя смежными кодонами мРНК в районе "шеи" малой субчастицы. Пептидилтрансферазный центр (РТС) расположен в районе "шеи" (в борозде под центральным выступом) большой субчастицы. Когда субчастицы ассоциированы, акцепторные концы двух тРНК с их аминоацильным и пептидильным остатками взаимодействуют с пептидилтрансферазным центром большой субчастицы.

2.3. Матричная РНК (мРНК). Матричная (мРНК) или информационная (иРНК) составляет всего 3 – 5% всей содержащейся в клетке РНК. Она переносит генетическую информацию от ДНК к рибосомам, где служит матрицей для биосинтеза полипептидных цепей. В любой данный момент в клетке присутствует чрезвычайно сложная смесь сотен мРНК, каждая из которых кодирует одну или несколько полипептидных цепей. Большинство мРНК существует в клетке в течение короткого времени, так как распадаются, выполнив свою функцию.

Матричные РНК − это одноцепочечные молекулы caмой разной длины. Минимальная длина определяется размером полипептидной цепи, которую она кодирует. Например, для синтеза белка, состоящего из 100 аминокислотных остатков, требуется мРНК из 300 нуклеотидов, поскольку каждая аминокислота кодируется тройкой нуклеотидов (триплетом). Однако мРНК всегда несколько длиннее, так как содержит ряд дополнительных участков. Так, на 5’-конце имеется некодирующий "лидер" длиной от 25 до 150 оснований. мРНК прокариот обычно кодируют два или большее число полипептидов (их называют полигенными). Такие мРНК содержат межгенные области, или спейсеры, которые разделяют отдельные кодирующие участки и, видимо, помогают регулировать скорость транскрипции.

Эукариотические мРНК обычно являются моногенными. Другое отличие эукариотических мРНК − это наличие в них 5’-концевого “кэпа” (от англ. cap – “шапка”), представляющего собой остаток 7-метилгуанозина, присоединенного посредством трифосфатной связи. Кроме того, на своем 3’-конце они содержат “хвост” из 100-200 последовательно присоединенных остатков А (аденилата). Эти характерные участки присоединяются к первичному транскрипту эукариотической мРНК в ходе процессинга.

Последовательность нуклеотидов ДНК однозначно определяет порядок расположения аминокислот в полипептидной цепи. В то же время химическая природа мономеров (нуклеотиды и аминокислоты) совершенно различна, так что они не могут непосредственно взаимодействовать друг с другом. К тому же в нуклеиновых кислотах содержится всего 4 нуклеотида, а в белке - 20 аминокислот. Поэтому белок можно рассматривать как линейный текст, записанный при помощи алфавита из 20 букв, роль которых играют аминокислоты, который определяется (кодируется) другим текстом, записанным при помощи алфавита из 4-х букв − нуклеотидов молекулы ДНК. Следовательно, для каждой аминокислоты имеется свой кодон.

Простые математические расчеты показывают, что каждая аминокислота кодируется более, чем одним нуклеотидом. Однако сочетаний по 2 нуклеотида 4² = 16 недостаточно для кодирования 20-ти аминокислот. При сочетании нуклеотидов по 3 получается 4³ = 64 кодона, что и реализуется в клетке. "Словарь", при помощи которого в мРНК записана информация о кодируемом ею белке, расшифрован полностью (таблица 2).

Генетический код имеет следующие особенности.

1. Код триплетный, то есть одну аминокислоту определяет тройка нуклеотидов.

2. Код однозначный (специфичный): каждый кодон обозначает только одну, "свою" аминокислоту.

3. Код не имеет “запятых”, то есть отсутствуют сигналы, показывающие конец одного кодона и начало следующего. Поэтому в начале прочтения мРНК должна быть правильно установлена “рамка считывания”. Если в результате воздействия мутагенов произойдет выпадение или встраивание одного нуклеотида, то рамка считывания "сбивается" на один нуклеотид, и все последующие кодоны выйдут из правильной рамки, что приведет к образованию белка с искаженной аминокислотной последовательностью (мутации со сдвигом рамки считывания).
Таблица 2

Генетический код мРНК (подчеркнуты кодоны-терминаторы)

4. Генетический код вырожден, то есть одной аминокислоте может соответствовать более, чем один кодон. Только две аминокислоты – метионин и триптофан имеют по одному кодону. Лейцину и серину соответствует по 6 кодонов, глицину и аланину - по 4, а глутаминовой кислоте, тирозину и гистидину - по 2. Если аминокислота кодируется несколькими кодонами, то в большинстве случаев они различаются по третьей букве, то есть по нуклеотиду на их 3'- конце. Таким образом, специфичность каждого кодона определяется главным образом его первыми двумя нуклеотидами, третий же имеет меньшую специфичность.

5. Генетический код содержит триплеты, обозначающие начало и окончание синтеза белка. АУГ - инициирующий кодон (но во внутреннем положении он кодирует аминокислоту метионин). Терминирующие кодоны - УАГ, УАА, УГА (нонсенс-кодоны) не кодируют ни одну из известных аминокислот, сигнализируют об окончании синтеза белка.

6. Важным свойством генетического кода является его неперекрываемость, то есть независимость отдельных триплетов. Вследствие этого отсутствуют ограничения в последовательности аминокислот в белках.

Неперекрывающийся код

Перекрывакищйся код

1, 2, 3-номера триплетов

Исключение из правила неперекрываемости обнаружено лишь в геномах некоторых вирусов. Это обусловлено малыми размерами их ДНК и в связи с этим экономным использованием ее, так как она должна кодировать несколько белков, обеспечивающих жизнеспособность и размножение вирусных частиц. У этих вирусов используются разные рамки считывания для биосинтеза нескольких белков на одной и той же последовательности нуклеотидов ДНК.

7. Удивительное свойство кода это его универсальность. Кодовые слова одинаковы у человека, животных, растений, многих бактерий. Это служит еще одним доказательством в пользу того, что все живые организмы произошли от единого предка, имевшего генетический код, сохранившйся на протяжении всей биологической эволюции. Благодаря универсальности кода возможна генная инженерия.

Своеобразные "диалекты" генетического кода найдены у митохондрий, хлоропластов, мельчайших бактерий, реснитчатых простейших. У них найдены минорные отклонения в генетическом коде. Например, в ДНК митохондрий человека имеется 4 измененных кодона, а у дрожжевых клеток к этим четырем добавляется еще один. Это позволяет предполагать, что эволюционировали не только живые организмы в целом, но и их генетический код.