7-aad viability Dye Раствор для выявления жизнеспособных клеток каталожный номер im3422

150 тестов; 3 мл

20 мкл / тест

	Спецификации готового к использованию лизирующего реагента OptiLyse B
Состав	Очищенный 7-амино актиномицин Д, разведенный в буферном растворе 0.008 M фосфат натрия, 0.15М хлорид натрия, pH 7.2, с 1% диметилсульфоксидом (ДМСО)
Объем	3 мл
Количество флаконов	1 флакон
Объем для одного исследования	20 мкл / тест

НАЗНАЧЕНИЕ

Данный реагент предназначен для отделенияф жизнеспособных клеток пробы от мертвых с перфорированной мембраной в методе проточной цитометрии. Реагент используется после окрашивания лейкоцитов флуоресцирующими антителами. «7-AAD» р-р используется только в системах Beckman Coulter, при этом отмывка образца не выполняется при условии использования надлежащим образом откалиброванного проточного цитометра.

Биологические образцы инкубируются с раствором «7-AAD», что приводит к заполнению лейкоцитов с перфорированной мембраной (мертвых клеток) 7-амино актиномицином, что меняет светооптические характеристики этих клеток и дифференцирует их от жизнеспособных лейкоцитов с целой клеточной мембраной.

В пробе должны быть лизированы эритроциты путем инкубации с лизирующим раствором. В дальнейшем лейкоциты анализируются на проточном цитофлуориметре.

Подготовленный образец необходимо хранить при температуре 2 - 8°C, анализ следует выполнять вскоре после подготовки. Отмывка образца не требуется.

Проточный цитометр измеряет светорассеяние и флуоресценцию клеток. Он позволяет выделить интересующую популяцию на диаграмме, отображающей светорассеяние в боковом направлении (Side Scatter или SS) и светорассеяние в прямом направлении под малыми углами (Forward Scatter или FS). Для выбора анализируемых популяций в различных приложениях можно использовать другие двупараметровые диаграммы.

Прибор выполняет также анализ флуоресценции выбранной популяции. Результат представляется в виде процентного содержания положительных клеток от всех клеток выбранной популяции.

Реагент «7-AAD» хранится при температуре 18 - 25°C.

Стабильность нераспечатанного реагента приводится на этикетке флакона.

Стабильность распечатанного реагента 90 дней.

1. 
   Не используйте реагент с истекшим сроком годности.
   
2. 
   Не храните в холодильнике и не замораживайте реагент.
   
3. 
   Воздействие света в ходе инкубации необходимо свести к минимуму.
   
4. 
   Избегайте контаминации микроорганизмами, в противном случае возможно получение недостоверных результатов.
   

5. 
   Все образцы крови следует рассматривать как потенциально инфицированные. При работе с ними необходимо соблюдать все меры предосторожности (в частности, использовать защитные перчатки, халат и очки).
   
6. 
   После завершения работы пробирки с кровью и все одноразовые материалы необходимо поместить в специальные контейнеры для утилизации.
   

Венозную кровь или образцы костного мозга необходимо отобрать в стерильные пробирки с солью EDTA, цитратом декстрозы (ACD) или гепарином в качестве антикоагулянта.

Образцы должны храниться при комнатной температуре (18 – 25°C). Встряхивание образцов не допускается. Перед отбором аликвоты образец следует гомогенизировать, аккуратно перемешав.

Анализ образцов необходимо выполнить в течение 24 часов после отбора.

• 
  Пробирки и материалы для отбора проб. Автоматические пипетки с одноразовыми наконечниками на 20, 100, 500 и 1000 мкл.
  
• 
  Пластиковые пробирки для гемолиза.
  
• 
  Калибровочные частицы: флуоросферы Flow-Set™ (кат. № 6607007).
  
• 
  Специфические флуоресцирующие антитела.
  
• 
  Изотипические контроли.
  
• 
  Буфер (PBS: 0.01 M фосфат натрия; 0.145 M хлорид натрия; pH 7.2).
  
• 
  Реагент для лизиса эритроцитов . Например: Optilyse B (кат. № IM1400).
  
• 
  Центрифуга.
  
• 
  Миксер (вортекс).
  
• 
  Проточный цитофлуориметр.
  

Концентрация лейкоцитов в образце должна быть меньше 10⁴ клеток/мкл (10¹⁰/л). При необходимости разведите образец PBS до концентрации лейкоцитов 5 x 10³ / мкл (5 x 10⁹/л).

Концентрация эритроцитов в образце должна быть меньше 6 x 10⁶/мкл (6 x 10¹²/л), рекомендуется развести образец PBS до концентрации эритроцитов 5 x 10⁶/мкл.

При коррекции концентрации как лейкоцитов, так и эритроцитов необходимо использовать большее разведение. Для анализа в пробирку отбирается 100 мкл как разведенного, так и неразведенного образца.

Подготовка не требуется. Используйте раствор «7-AAD» непосредственно из флакона.

При исследовании любого образца необходимо также проанализировать контрольный образец (исследуемый образец плюс изотипический контроль, соответствующий специфическому окрашиванию).

1. 
   В пробирки для анализа клинических образцов добавьте рекомендованное производителем количество конъюгатов антител, необходимых для окрашивания 5 x 10⁵ лейкоцитов.
   
2. 
   В пробирки для анализа контролей добавьте рекомендованный производителем объем изотипического контроля, необходимый для окрашивания 5 x 10⁵ лейкоцитов.
   
3. 
   В пробирки для анализа образцов и для анализа изотипических контролей добавьте по 100 мкл образца (разведенного или неразведенного). Аккуратно перемешайте на вортексе.
   
4. 
   Инкубируйте в соответствии с указаниями инструкции к используемым антителам.
   
5. 
   Добавьте 0.5 мл реагента OptiLyse B и немедленно перемешайте на вортексе в течение 1 секунды.
   
6. 
   Инкубируйте по меньшей мере 10 минут при комнатной температуре (18 – 25°C) в защищенном от света месте.
   
7. 
   Добавьте 0.5 мл PBS. Перемешайте на вортексе.
   
8. 
   Инкубируйте по меньшей мере 5 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте.
   
9. 
   Проанализируйте образцы в проточном
   цитофлуориметре.
   

10. 
    Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g при комнатной температуре.
    
11. 
    Удалите супернатант аспирацией. Ресуспендируйте осадок клеток в 0.5 или 1 мл PBS с 0.1% раствором формальдегида.
    

Чистота и выход лимфоцитов оценивались в соответствии с рекомендациями Центров по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) (1). Образцы крови 10 здоровых доноров были отобраны с использованием K₃EDTA и помечены смесью моноклональных антител CD45-FITC и CD14-PE, откалиброванных для выполнения безотмывочного окрашивания и лизиса. В следующей таблице приводятся средние значения выхода и чистоты лимфоцитов, а также диапазоны значений:

В один день на одном цитометре определялась средняя интенсивность флуоресценции, СИФ (в процентах) CD45⁺CD14^– лимфоцитов в одном образце (в цельной крови здорового донора). Измерение выполнялось 12 раз. Отмывка после окрашивания и лизиса не использовалась. Полученные результаты суммированы в следующей таблице:

В один день на двух цитометрах определялось процентное содержание и средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) CD45⁺CD14^– лимфоцитов в одном образце (в цельной крови здорового донора). Измерение выполнялось 12 раз. Отмывка после окрашивания и лизиса не использовалась. Полученные результаты суммированы в следующих таблицах:

итометр # 2

1. 
   При неправильной настройке цитофлуориметра, неверной компенсации флуоресценции и неправильном расположении регионов могут быть получены недостоверные результаты.
   
2. 
   Для получения точных и воспроизводимых результатов необходимо соблюдать все приведенные инструкции и следовать нормам лабораторной работы.
   
3. 
   При гиперлейкоцитозе разведите образец PBS так, чтобы получить примерную концентрацию лейкоцитов 5 x 10⁹/л.
   
4. 
   При полиглобулинемии разведите образец PBS так, чтобы получить примерную концентрацию эритроцитов 5 x 10¹²/л.
   
5. 
   Перед использованием необходимо довести температуру реагента «7-AAD» до комнатной (18 - 25 С).
   
6. 
   Визуально проверьте эффективность лизиса. Если образцы мутные, а также в том случае, если на диаграмме светорассеяния заметно необычное распределение, возможно, произошел неполный лизис.
   
7. 
   Эритробласты могут лизироваться не полностью и появляться на диаграмме светорассеяния в зоне лейкоцитов.
   
8. 
   При некоторых заболеваниях, таких как тяжелая почечная недостаточность или гемоглобинопатии, лизис эритроцитов может происходить медленно, не полностью или совсем не происходить. В этом случае перед окрашиванием рекомендуется выделить мононуклеарные клетки в градиенте плотности (например, фикола).
   

В приложении приводится список литературы и примеры диаграмм.

Логотип Beckman Coulter, COULTER, EPICS, EXPO, Flow-Set, IOTest, System II, XL являются зарегистрированными торговыми знаками компании Beckman Coulter Inc.

IMMUNOTECH S.A.

a Beckman Coulter Company

130 avenue de Lattre de Tassigny

B.P. 177 – 13276 Marseille Cedex 9

France