Диплом жизнь в Антарктиде как модель для астробиологических исследований

Москва

2014

1. 
   Астробиология
   
2. 
   Почвы Антарктиды и их бактериальные сообщества
   
3. 
   Экспериментальная часть
   
   1. 
      Материалы и методы
      
      1. 
         Образцы антарктических почв
         
      2. 
         Питательные среды, описание и приготовление
         
      3. 
         Определение КОЕ в образцах
         
      4. 
         Определение общей численности прокариот в образцах
         
      5. 
         Выделение чистых культур и их исследование
         
   2. 
      Результаты и обсуждение
      
      1. 
         Учёт общей численности бактерий и КОЕ в образцах
         
      2. 
         Характеристика чистых культур
         

Список литературы

Астробиоло́гия (экзобиоло́гия) — наука, предметом которой является изучение происхождения, эволюции и распространения жизни во Вселенной. Людей давно интересует вопрос, существует ли жизнь на других планетах. В нашей стране первая книга, посвященная астробиологии вышла в 1953 году (Тихов Г.А., Астробиология, 1953). За последние 10-20 лет астробиология превратилась в самостоятельную отрасль биологии, по ней каждый год проходят научные международные конференции, и даже появился специальный научный журнал «Astrobiology». Астробиология основывается на достижениях других естественных наук: физики, химии, астрономии, биологии, экологии, планетологии, географии и геологии. Для исследований в области астробиологии учёные моделируют условия, схожие с внеземными, ведут исследования на космических станциях и на других планетах и космических телах солнечной системы, а также изучают жизнь, которая существует в суровых условиях на Земле. Целями астробиологии является поиск пригодной для жизни среды обитания, как в Солнечной системе, так и за её пределами, исследования происхождения и раннего развития жизни на Земле, а также исследования потенциальных возможностей адаптации жизни к сложным условиям на Земле и в космосе.

В настоящее время почвы и подпочвенные отложения Антарктиды рассматриваются как наиболее перспективные природные среды для изучения эволюции и сохранения жизни в экстремальных земных условиях, сходных с внеземными, например, обнаруженными на Марсе. Это связано с наличием повышенной солнечной радиации на этом материке в сочетании с низкими отрицательными температурами (в центральной части материка средние температуры зимних месяцев от −60 до −75 °С, летних от −30 до −50 °С; на побережье зимой от −8 до −35 °С, летом 0—5 °С) и недостатком влаги, что создает серьезные сложности для развития и жизнедеятельности живых организмов. Обнаружено, что наиболее жизнеспособными в таких суровых условиях являются микроорганизмы, и, прежде всего, бактерии. В экстремальных условиях почвенные бактерии вырабатывают различные стратегии переживания, оставаясь жизнеспособными. Это позволяет предполагать способность многих земных бактерий длительно выдерживать космические условия в естественной гетерогенной минеральной среде, какой является почва.

Важной задачей микробиологических исследований в Антарктиде является выделение чистых культур бактерий и изучение свойств обитателей различных типов экстремально холодных экосистем этого материка с целью последующего исследования их адаптивных особенностей и их использования в межпланетных экспериментах.

Целью моей работы является изучение жизнеспособных бактерий из образцов почв ранее не исследованных влажных долин Восточной Антарктиды, отобранных в 2012 году в районе станции Молодежная, 57 –ой Российской Антарктической экспедицией.

Мной были поставлены следующие задачи:

1. 
   Изучить информацию о почвах Антарктиды и их бактериальных сообществах и о важности их исследований для астробиологии.
   
2. 
   Освоить методы изучения бактерий в почвах, выделения и исследования чистых бактериальных культур.
   
3. 
   Определить общее количество бактерий и число КОЕ (количество образующих колонии бактерий) в почвенных образцах.
   
4. 
   Выделить чистые бактериальные культуры из почвенных образцов, описать их морфологию и исследовать с помощью светового микроскопа.
   

1. 
   Образцы антарктических почв
   

Особенностью почв данного района является их формирование внутри скал в результате взаимодействия сообществ организмов с минералами породы, которые находят здесь свою экологическую нишу. К таким организмам относятся прежде всего водоросли и бактерии, развитие которых на дневной поверхности пород в значительной степени угнетается из-за внешних стрессовых воздействий - недостатка влаги, УФ- излучения, сильного ветра и низких температур. Такие сообщества называются эндолитными, а формируемые ими почвы, соответственно, эндолитными почвами. Подобные наземные экосистемы являются наименее изученными и интересными с точки зрения заселения живыми организмами экстремальных местообитаний и сохранения их активности в таких условиях. (Рис.1)

В работе основное внимание было уделено изучению гетеротрофных бактерий, разлагающих органическое вещество, продуцируемое первыми поселенцами на скалах и, таким образом, участвующих в формировании антарктических почв. Согласно опубликованным ранее данным, данная группа бактерий имеет наиболее высокие показатели сохранения жизнеспособности в антарктических почвах

Для выделения гетеротрофных бактерий использовали общепринятые методы:

- определение числа колоний образующих клеток, или единиц в 1 г образца почвы (число КОЕ на 1 г), что дает представление о количестве жизнеспособных культивируемых штаммов бактерий;

- определение общего числа клеток бактерий в образцах, выявляемых микроскопическим методом с окрашиванием клеток флюоресцирующими красителями.

Использование обоих методов позволяет определить степень заселенности изучаемых антарктических почв бактериями, и выявить корреляцию между общим числом бактерий в образцах почв, и тем числом клеток, которые сохраняют жизнеспособность и могут восстанавливать свой рост в предложенных благоприятных для развития условиях.

2. 
   Питательные среды, описание и приготовление
   

3. 
   Определение КОЕ в образцах
   

КОЕ = n*V₁/V₂, где

n – среднее число колоний на чашке

V₁ – объем исходной суспензии (10 мл)

V₂ –объём, высеянный на чашку (0,1 мл)

4. 
   Определение общей численности прокариот в образцах
   

Почвенную суспензию (1:10) переносили в мерный цилиндр на 100 мл и обрабатывали ультразвуком на диспергаторе УЗДН-1 в течение 2 минут в режиме 0,44 А, 15 Гц. Перед приготовлением препаратов колбу энергично встряхивали. Суспензию наносили микропипеткой на тщательно обезжиренное предметное стекло (0,01 мл на препарат) и равномерно распределяли петлей на площади 4 см² . Предварительно начертили расположение препаратов в натуральную величину на бумаге, на которую в дальнейшем выкладывали предметные стекла для приготовления препаратов.

Препараты высушивали на воздухе при комнатной температуре. Затем, после фиксации легким нагреванием на пламени газовой горелки, окрашивали препараты водным раствором акридина оранжевого (разведение 1: 10 000; 2-4 мин).

Избыток акридина оранжевого удаляли в процессе промывки, для чего стекла погружали на 10 мин в кювету с водопроводной водой. Окрашенные препараты высушивали при комнатной температуре.

Для микроскопии на препарат наносили каплю воды и покрывали обезжиренным покровным стеклом. Лишнюю воду удаляли фильтровальной бумагой. Подсчет бактериальных клеток проводился с использованием люминесцентного микроскопа «Axioscope 2+» ZEIZZ, Германия (объектив х10, масляная иммерсия). Для каждого образца подсчитывали клетки в 30 полях зрения и подсчитывали среднее число клеток, наблюдаемых в поле зрения. Количество бактериальных клеток, содержащихся в 1 г почвы, вычисляла по формуле:

N=S₁*a*n/V*S₂*m, где

N – количество клеток в 1 г почвы,

S_{1 –} площадь препарата (4²*10⁸ мкм²)

а – среднее количество клеток в поле зрения

n – показатель разведения бактериальной смеси (10²)

V – объём капли наносимой на стекло (0,01 мл)

S2 – площадь поля зрения микроскопа (39740,625 мкм²)

m – масса образца (2 г)

5. 
   Выделение чистых культур и их исследование
   

А. Б.

2. 
   Результаты и обсуждение
   

1. 
   Учёт общей численности бактерий и КОЕ в образцах
   

По фенотипу разнообразие выросших колоний самым богатым оказался образец МЛ-6: 4 типа колоний (рис. 6в). В образце МЛ-4 обнаружили два типа колоний, а в образце MN-5 – всего один (рис. 6а и 6б).

А

Б

В

Рисунок 6. Фотографии колоний, выросших из образцов

Определение общей численности образцов проводилось методом прямого счета бактериальных клеток, окрашенных акридином оранжевым с помощью флюоресцентного микроскопа.

В исследованных образцах эндолитной почвы общая численность на три порядка была выше КОЕ, определенного при посеве на TSA (таблица 2) и составляла приблизительно 1,5*10⁸ во всех образцах.

Поле зрения	Образец
	МЛ-4	MN-5	МЛ-6
1	4	1	2
2	5	4	3
3	3	5	2
4	1	1	1
5	2	2	5
6	2	4	3
7	3	3	6
8	2	3	1
9	5	1	5
10	4	1	3
11	7	3	6
12	5	0	2
13	3	4	4
14	3	2	2
15	1	3	1
16	5	6	2
17	6	4	3
18	3	5	4
19	4	1	5
20	1	1	4
21	3	2	1
22	2	3	2
23	0	7	1
24	4	0	2
25	1	1	1
26	2	8	1
27	4	4	3
28	0	7	2
29	3	4	1
30	2	3	4
Среднее значение	3	3,1	2,73
Количество клеток на 1 грамм образца	1,51*108	1,56*108	1,37*108

Следует отметить, что число бактерий в исследуемой почве, определенное методами как посева, так и прямого счета, в профиле изученной эндолитной почвы (10⁵ кл на 1 г почвы) в целом сопоставимы с опубликованными ранее показателями для антарктических почв (Соина с соавт., 2012).

2. 
   Характеристика чистых культур
   

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отмечалась практическое одинаковое число КОЕ вниз по профилю антарктической почвы, в отличие от хорошо сформированных горизонтов почв умеренного климата. (таблица 1). Это может объясняться особенностями перераспределением клеток при замораживании- оттаивании почвы, а также переходом клеток в некультивируемое состояние в отдельных горизонтах формирующееся почвы.

1. 
   Количество жизнеспособных гетеротрофных бактерий в образцах не исследованной ранее почвы из района Холмов Тала Восточной Антарктиды сопоставимо с показателями, определяемыми в ранее исследованных образцах антарктических и арктических почв, а также антарктических мерзлых осадках.
   
2. 
   Обнаружено, что показатели числа потенциально жизнеспособных клеток, определяемых микроскопическим методом, на три порядка превышают число КОЕ, и всего на один порядок меньше данного показателя, обычно определяемого в почвах умеренных зон. Это свидетельствует о высокой степени заселенности бактериями изученных образцов антарктической почвы.
   
3. 
   Отмечена незначительная неравномерность в распределении числа КОЕ и общего числа клеток в профиле почвы, что может объясняться особенностями распределения клеток в процессе промораживания и оттаивания почвы.
   
4. 
   Выделенные из почвы культуры были разнообразны по морфологическим и культуральным признакам и могут быть включены в коллекцию культур для модельных астробиологических экспериментов.
   

1. 
   Тихов Г.А. Астробиология – Молодая Гвардия, 1953
   
2. 
   Горячкин С. В., Гиличинский Д. А., Мергелов Н. С., Конюшков Д. Е., Лупачев А. В., Абрамов А. А., Долгих А. В., Зазовская Э. П. Почвы Антарктиды: первые итоги, проблемы и перспективы исследований. Геохимия ландшафтов и география почв (к 100-летию М.А.Глазовской), 2012.
   
3. 
   Мергелов Н. С. Почвы влажных долин в оазисах Ларсеманн и Вестфолль (Земля Принцессы Елизаветы, Восточная Антарктида) Почвоведение. - 2014.
   
4. 
   Кудинова А.Г., Лысак Л.В., Лапыгина Е.В., Соина В.С., Мергелов Н.С. Разнообразие и жизнеспособность прокариот в примитивных почвах оазиса Ларсеманн (Восточна Антарктида). Известия РАН, Серия Биологическая, 2015, №1
   
5. 
   Кудинова А.Г., Лысак Л.В., Соина В.С., Мергелов Н.С., Долгих А.В., Шоркунов И.Г. Бактериальные сообщества в почвах криптогамных пустошей Восточной Антарктиды (Оазисы Ласермана и Холмы Талла). Микробиология, 2015
   
6. 
   Асеева И. В., Бабьева И. П., Бызов Б. А., Гузев В. С., Добровольская Т. Г., Звягинцев Д. Г., Зенова Г. М., Кожевин П. А., Кураков А. В., Лысак Л. В., Марфенина О. Е., Мирчинг Т. Г., Полянская Л. М., Паников Н. С., Скворцова И. Н., Степанов А. Л., Умаров М. М. Методы почвенной микробиологии и биохимии – издательство московского университета, 1991