Электрофоретическая схема детекции продуктов реакции
жүктеу/скачать 444 Kb.
|
119435 Москва, ул.Малая Пироговская, д.1, стр.3  
МЕТОДИКА проведения исследования клинического материала (биоптат слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки) на наличие ДНК Хеликобактер пилори методом ПЦР ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ СХЕМА ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ с использованием наборов реагентов: ХЕЛИКОПОЛ (Helicobacter pylori) ХЕЛИКОПОЛ CA (Helicobacter pylori генотип cagA) ХЕЛИКОПОЛ VA (Helicobacter pylori генотип vacA) ХЕЛИКОПОЛ BA(Helicobacter pylori генотип babA) ХЕЛИКОПОЛ IA (Helicobacter pylori генотип ice A) выделение ДНК из биопроб - «Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ» МОСКВА 2008 г. ___________________________________________________________________________________ ПРИНЦИП РАБОТЫ МЕТОДА В основе метода лежит выявление специфического фрагмента ДНК микроорганизма путем накопления (амплификации) копий данного фрагмента (ДНК-мишени) в процессе синтеза новых цепей ДНК. Полимеразная цепная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозид-трифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок - праймеров, определяющих границы амплифицируе-мого участка ДНК-мишени. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94оC происходит разделение цепей ДНК, затем при 57-62оС - присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72оC протекает синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймера в направлении 5’-3'. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 35 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для его детекции с помощью электрофореза. Проведение ПЦР-анализа включает 3 лабораторных этапа: 1. обработка клинических проб (выделение ДНК); 2. постановка реакции ПЦР (амплификация); 3. детекция продуктов амплификации (в данной методике - электрофоретическое разделение продуктов в агарозном геле).
Требования к проведению работ с патогенными микроорганизмами изложены в Санитарных правилах СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами"1999г. НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ и РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ 1 этап - выделение ДНК из биопроб: - ламинарный бокс 2 класса защиты; - твердотельный термостат для пробирок 1,5 мл типа Эппендорф, поддерживающий температуру до 99оС; - высокоскоростная центрифуга для пробирок 1,5 мл 8-12 тыс.об/мин; - центрифуга для пробирок 50 мл 1,5-3тыс.об/мин; - микроцетрифуга-вортекс 1,5-3тыс.об/мин (или вортекс); - пипетки-дозаторы переменного объема ( 5-50; 20-200; 100-1000 мкл); - вакуумный аспиратор (насос) с колбой-ловушкой; - штатив для хранения пробирок 1,5 мл; - штатив для пробирок 1,5 мл «рабочее место»; - одноразовые наконечники для дозаторов до 200 мкл и до 1000 мкл; - холодильник с морозильной камерой для хранения клинического материала; - одноразовые перчатки; - комплект «Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ» 2 этап - проведение ПЦР (амплификация): - ПЦР-бокс с УФ-лампой; - программируемый термостат амплификатор); - микроцентрифуга-вортекс 1,5-3тыс.об/мин; - пипетка-дозатор переменного объема 5 - 50 мкл для работы с биопробами; - пипетки-дозаторы переменного объема ( 0,5 - 10; 5-50; 20-200; 100-1000 мкл) для приготовления рабочей смеси реагентов ; - одноразовые полипропиленовые микропробирки 0,5 мл (или 0,2 мл) для амплификации; - одноразовые наконечники до 200 мкл и до 1000 мкл для приготовления рабочей смеси реагентов ; - одноразовые наконечники с фильтром (аэрозольным барьером) до 100 или до 200 мкл для биопроб; - штатив для пробирок 0,5 мл (или 0,2 мл) «рабочее место»; - штативы для наконечников 200 мкл; - одноразовые перчатки; - емкость для сброса использованных наконечников; - холодильник с морозильной камерой для хранения исходных реагентов; - комплект реагентов для проведения ПЦР (индивидуален для каждого возбудителя);
- камера для горизонтального электрофореза; - источник постоянного тока с напряжением не менее 150 В; - УФ-трансиллюминатор; - СВЧ-печь для плавления агарозы; - технические весы для взвешивания агарозы; - аквадистиллятор; - видеосистема для документирования гель-электрофореграмм со светозащитным кабинетом или тубусом, подключенная к персональному компьютеру; - пипетка-дозатор переменного объема 5 - 50 мкл для нанесения образцов на гель; - пипетка-дозатор переменного объема 100-1000 мкл; - одноразовые наконечники до 200 мкл для нанесения образцов; - одноразовые наконечники до 1000 мкл; - штатив для пробирок 0,5 мл (или 0,2 мл) «рабочее место»; - агароза, раствор бромистого этидия, 50хТАЕ буфер для приготовления геля и проведения электрофореза (или готовый комплект реагентов для электрофоретической детекции); - пластиковая емкость большого объема для дезактивации буфера и гелей;
СОСТАВ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ для ПЦР В состав набора реагентов входят три комплекта : 1. Комплект для пробоподготовки (выделения ДНК) « Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ» (кат № 020104 ) (на 50 образцов): 1. Лизирующий раствор..................................................... 5 мл 2. Раствор I 25 мл 3. Раствор II 10 мл 3. Раствор III 100 мл 4. Cорбент 1 мл 5. ТЕ буфер 2.5 мл 2. Комплекты для проведения ПЦР (амплификации) Рассчитаны на проведение анализа 50 исследуемых образцов, 5 положительных контрольных образцов и 5 отрицательных контрольных образцов. ХЕЛИКОПОЛ (кат № 010111): Реакционная смесь 150 мкл Taq-полимераза (5 ед/мкл) 15 мкл Разбавитель 1 мл Минеральное масло 1 мл ДНК контрольная H.pylori 25 мкл ХЕЛИКОПОЛ СА (кат № 010113): ПЦР-буфер 180 мкл Раствор дНТФ 180 мкл MgCl2 150 мкл Смесь праймеров cagA 120 мкл Tag-полимераза (5ед/мкл) 15 мкл Контрольная ДНК cagA 25 мкл Вода деионизованная 1 мл Минеральное масло 1 мл
ПЦР-буфер 540 мкл Раствор дНТФ 540 мкл MgCl2 450 мкл Смесь праймеров vacA s1/s2 120 мкл Смесь праймеров vacA m1 120 мкл Смесь праймеров vacA m2 .120 мкл Tag-полимераза (5ед/мкл) 40 мкл Контрольная ДНК vacA s1/s2 (K1) 25 мкл Контрольная ДНК vacA m1 (K2) 25 мкл Контрольная ДНК vacA m2 (K3) 25 мкл Вода деионизованная 3 мл Минеральное масло .3 мл
ПЦР-буфер 180 мкл Раствор дНТФ 180 мкл MgCl2 150 мкл Смесь праймеров babA 120 мкл Tag-полимераза (5ед/мкл) 15 мкл Контрольная ДНК babA 25 мкл Вода деионизованная 1 мл Минеральное масло 1 мл
ПЦР-буфер 360 мкл Раствор дНТФ 360 мкл MgCl2 300 мкл Смесь праймеров iceA1 120 мкл Смесь праймеров iceA2 120 мкл Tag-полимераза (5ед/мкл) 27 мкл Контрольная ДНК iceA1 (K1) 25 мкл Контрольная ДНК iceA2 (K2) 25 мкл Вода деионизованная 2 мл Минеральное масло 2 мл
Для детекции продуктов амплификации можно использовать как готовые комплекты, так и отдельные реагенты. Готовые комплекты: Комплект №1 (кат №030106) (на 100 –150 образцов) агароза-2х2г, 50хТАЕ буфер-25 мл, раствор бромистого этидия-30мкл Комплект №2 (кат №030107) (на 120 образцов) 2% агарозный гель (40 лунок) –3шт, 50хТАЕ буфер-25 мл Отдельные реагенты: - Агароза (100г/уп; 2г/уп) (кат №030101) - Раствор бромистого этидия (1мл/уп) (кат №030104) - 50хТАЕ буфер (200 мл/уп; 120мл/уп) (кат №030102) - 2% агарозный гель для электрофореза ( 40 лунок)(1шт/уп; 5шт/уп)(кат №030108)
Исследуемый биопсийный материал опускается в стерильную сухую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл. Пробу доставить в лабораторию в течение 2-х часов (в термосе со льдом) для выделения ДНК или заморозить и хранить при температуре – 20°C не более 2 недель.
Водную фазу (супернатант) использовать в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации. Водную фазу снятую с сорбента можно хранить при температуре -20оС в течение 6 месяцев.
Разбавитель 17,5 мкл, Реакционная смесь 32,5 мкл, Taq-полимераза 0,2мкл Рекомендуется готовить смесь реагентов не менее чем на 5 реакций для достоверной дозировки объема фермента ХЕЛИКОПОЛ СА: Вода деионизованная 14,3 мкл ПЦР-буфер 3 мкл Раствор дНТФ 3 мкл MgCl2 2,5 мкл Смесь праймеров cagA 2 мкл Tag-полимераза (5ед/мкл) .0,2 мкл
Вода деионизованная .14,3 мкл ПЦР-буфер 3 мкл Раствор дНТФ 3 мкл MgCl2 2,5 мкл Смесь праймеров 2 мкл Tag-полимераза (5ед/мкл) 0,2 мкл
Вода деионизованная 14,3 мкл ПЦР-буфер 3 мкл Раствор дНТФ 3 мкл MgCl2 2,5 мкл Смесь праймеров babA 2 мкл Tag-полимераза (5ед/мкл) 0,2 мкл
Вода деионизованная 14,3 мкл ПЦР-буфер 3 мкл Раствор дНТФ 3 мкл MgCl2 2,5 мкл Смесь праймеров iceA1 либо iceA2 2 мкл Tag-полимераза (5ед/мкл) 0,2 мкл
3.5. Добавить по 20 мкл амплификационной смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации (для ХЕДИКОПОЛ СА, VA, BA и IA—по 25 мкл). 3.6. Добавить во все пробирки по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла. 3.7. Внести 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы (см п. выделение ДНК) в соответствующую пробирку с амплификационной смесью для проведения амплификации под слой масла. 3.8. Внести в пробирки для положительных контрольных образцов по 5 мкл соответствующего положительного контрольного образца ДНК из состава набора, а в пробирку для отрицательного контрольного образца – 5 мкл разбавителя или деионизованной воды из состава набора. 3.9. Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 2250 – 4000g (1,5 –3000 об/мин) при комнатной температуре (+18 – 25оС) на микроцентрифуге-вортексе. 3.10. Перенести пробирки в прогретый до температуры +93оС программируемый термостат (амплификатор) и провести амплификацию по следующим программам: 
Для амплификатора Терцик: режим регулирования – точный; объем реакционной смеси – 40 мкл 4 ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ Разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза 4.1. Залить в аппарат для электрофореза ТАЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ в 50 раз. 4.2. К 2,0 г агарозы добавить 2 мл 50х ТАЕ буфера и 100 мл дистиллированной воды. 4.3. Приготовленную смесь расплавить на электрической плите или в СВЧ-печи. Добавить к 100 мл расплавленной агарозы 10 мкл 1% раствора бромистого этидия. Перемешать. 4.4. Охладить расплавленную агарозу до температуры 50-60оС и залить в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов установить на планшет гребенку, используя зажим типа «бульдог». После застывания агарозы осторожно вынуть гребенку из геля и перенести планшет с гелем в камеру для проведения электрофореза. 4.5.Нанести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата в последовательности соответствующей нумерации проб. Нанести положительные и отрицательные контроли. 4.6. Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и задать напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/См геля. Провести электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль за электрофоретическим разделением осуществляется визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна пройти от старта 1,5-2см. Визуализация результатов электрофореза 4.7. Вынуть гель из формы и перенести его на стекло УФ-трансиллюминатора. ВНИМАНИЕ! С гелем агарозы следует работать в перчатках. Бромистый этидий является сильным мутагеном. 4.8. Включить трансиллюминатор и проанализировать результаты анализа. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм. 5. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ 5.1. В отрицательном контрольном образце (К-) полосы должны отсутствовать. Появление полосы на уровне положительного контроля свидетельствует о контаминации (загрязнении) компонентов набора. 5.2. В положительных контрольных образцах (К+) должна выявляться одна полоса, соответствующая ПК. 5.3. Анализируемые пробы: отсутствие полосы оранжево-красного цвета строго на уровне положительного контроля (ПК) свидетельствует об отсутствии ДНК искомого возбудителя в анализируемой пробе; наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю – о присутствии ДНК искомого возбудителя в анализируемой пробе. 5.4. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтра. Размер фрагментов ДНК
6. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ и ТРАНСПОРТИРОВКИ РЕАГЕНТОВ 6.1. Комплект «Набор для выделения ДНК из биоптата» должен храниться при +2...+8оС в течение всего срока годности (6 месяцев с даты производства). Допускается хранение и транспортировка этого комплекта при комнатной температуре не более 2 суток. 6.2. Комплекты для проведения ПЦР должны храниться при температуре минус 18-25оС в течение всего срока годности (6 месяцев с даты производства). Допускается хранение и транспортировка этого комплекта при температуре не выше 0оС не более 1,5 суток. 6.4. Комплект для электрофоретической детекции №1, агароза, 50хТАЕ-буфер и раствор бромистого этидия может храниться при комнатной температуре в течение всего срока годности (указан на этикетке). 6.5. Комплект для электрофоретической детекции №2 и готовые агарозные гели должны храниться при +2...+8оС в течение всего срока годности (6 месяцев с даты производства). Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение методики проведения исследования. По вопросам, касающимся качества наборов реагентов, обращаться в НПФ «ЛИТЕХ» по адресу: 119435 г.Москва, ул.Малая Пироговская, д.1, стр.3, т./ф. (495) 589-14-03 жүктеу/скачать 444 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ЕЛИКОПОЛ СA, IA, VA
абор