Учебно-методическое пособие к лабораторным занятиям Красноярск сфу 2011 ббк 28. 072 М 545

Министерство образования и науки Российской Федерации

Сибирский федеральный университет

МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Учебно-методическое пособие к лабораторным занятиям

Красноярск

СФУ

2011

ББК 28.072

М 545

Составитель О.А.Гусейнов

М 545 Методы биохимических исследований: методические указания к лабораторным занятиям. – Красноярск: Сибирский федеральный университет, 2011. – 48 с.
В пособии представлены лабораторные работы по следующим темам биохимических исследований: изучение свойств буферных растворов, гель-фильтрация, разделение белков, электрофорез, изучение оптических свойств ДНК, выделение ДНК, рестриктный анализ ДНК и полимеразная цепная реакция.

Предназначено для студентов специальности 020208.65 – «Биохимия».

Предложенные методы биохимических исследований также могут быть использованы преподавателями высшей школы при проведении лабораторных занятий.

УДК 577.1

ББК 28.072

© Сибирский

федеральный университет, 2011

ВВЕДЕНИЕ

В курсе «Методы биохимических исследований» изучаются теоретические и практические основы биохимических методов исследований с фокусом на последние достижения науки, современные методы исследования, использование современного лабораторного оборудования. Курс предназначен для студентов четвертого курса очной формы обучения направления 020200 – биология.

Главная цель практикума – ознакомление с важнейшими принципами и методическими приемами экспериментальной биохимии.

Предлагаемые в настоящем методическом пособии лабораторные работы будут содействовать глубокому усвоению студентами учебного материала, формированию навыков самостоятельной работы в биохимической лаборатории (рассчитать концентрации необходимых растворов, приготовить их и проверить правильность приготовления; эксплуатировать современную аппаратуру и оборудование для выполнения научно-исследовательских лабораторных биологических работ), освоению разнообразных методов исследования. Особое внимание обращается на правильность выполнения биохимического анализа.

• 
  основные методологические принципы научного исследования;
  
• 
  принципы работы с современным биохимическим лабораторным оборудованием;
  

• 
  работать с биологическим материалом;
  
• 
  оценивать и обрабатывать полученные экспериментальные результаты;
  
• 
  выбирать оптимальные методы достижения поставленных целей;
  

• 
  приемами и навыками работы с современным биохимическим оборудованием;
  
• 
  способами и технологиями защиты от вредных факторов профессиональной среды.
  

При подготовке к выполнению лабораторной работы необходимо проработать соответствующий теме занятия лекционный материал и теоретический материал, содержащийся в настоящем пособии.

Отчеты о выполнении лабораторных работ студенты оформляют в отдельной рабочей тетради. Перед началом работы записывают тему занятия, указывают цель работы и принцип используемого метода, подготавливают таблицы для записи результатов. Все записи в таблицах или рисунки выполняют в лаборатории. Необходимые расчеты приводят в рабочей тетради. По полученным результатам записывают выводы или заключение. Они должны соответствовать поставленной в начале занятий цели работы.
ПРАВИЛА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Запрещается входить в лабораторию в верхней одежде. Следует работать только в специальном халате и бахилах.

Опыты с ядовитыми и вредными веществами должны проводиться в вытяжном шкафу. Наливать или насыпать реактивы следует только над столом. Не следует оставлять открытыми банки с реактивами.

Пролитые или рассыпанные реактивы нужно немедленно удалить со стола. Пролитые концентрированные кислоты следует убрать с помощью резиновой груши. Облитое место необходимо облить раствором соды и вытереть тряпкой.

При работе с органическими растворителями нельзя определять вещество по запаху, так как может произойти отравление их парами. Наполнение пипеток растворами необходимо производить только при помощи груши. Следует внимательно следить за тем, чтобы реактивы не попадали на лицо, руки и одежду. Нельзя ходить по лаборатории с емкостями с концентрированными кислотами в руках, необходимо наливать их только в определенном, отведенном для этого месте.

Нельзя загрязнять реактивы во время работы (не путать пробки от склянок, содержащих разные реактивы; избыток взятого реактива не выливать обратно в склянку; пользуясь пипеткой, набирать каждый реактив только предназначенной для этого пипеткой, ни в коем случае не путать их).

В случае попадания на кожу концентрированной кислоты облитое место нужно промыть большим количеством воды, а затем разбавленным раствором соды. При попадании растворов щелочей на кожу пораженное место следует обмыть сначала разбавленной уксусной или борной кислотой, а потом водой.

Работа 1. Изучение буферных растворов.

Краткие теоретические сведения.

В нормальных условиях осмотическое давление внутриклеточной и внеклеточной жидкостей одинаково. Однако концентрации в них отдельных электролитов заметно различаются. Так содержание катионов Na+, K+, Ca²+, Mg²+ в плазме крови составляет в среднем 142, 4, 2,5, 1 моль/л; а содержание анионов Cl^–, HCO^3–, HPO₄^2–, SO₄^2– соответственно 102, 25, 1, 0,5 моль/л.

Благодаря непрерывной активности натриево-калиевой АТФазы в клеточной мембране ионы Na⁺, преобладающие во внеклеточной жидкости, внутри клетки присутствуют в низкой концентрации, а K⁺ – в высокой. Внутриклеточная концентрация магния, хотя и заметно ниже, чем K⁺, также значительна. Среди анионов Cl^– и HCO₃^– преобладают вне клетки, а ионы фосфата – внутри.

Как в плазме, так и в клетках, катионы и анионы находятся в равновесных концентрациях; соответственно положительные и отрицательные заряды взаимно компенсируются. Поливалентные белки вносят значительный вклад в равновесие зарядов. При значениях рН, характерных для жидкостей организма, белки находятся в форме полианионов в среднем с 10 отрицательными зарядами на молекулу. Различное распределение одно- и поливалентных электролитов приводит к тому, что плотность электрического заряда внутри клетки примерно на 20 % выше, чем во внеклеточной жидкости, хотя осмотические концентрации в обеих средах одинаковы.

Свободные ионы водорода связываются буферными системами: 40 % всех высвобождаемых протонов нейтрализует главная внеклеточная буферная система угольной кислоты и гидрокарбоната натрия, а 60 % – внутриклеточные буферные системы. Буферные системы – это первая защитная линия в противодействии тенденции роста концентрации протонов в клетках и во внутренней среде, который является фактором апоптоза и цитолиза. Для поддержания нормального кислотно-основного состояния необходимо выведение протонов из форм их временного связывания во внешнюю среду.

Кислотно-основное состояние характеризуют величины четырех его параметров:

– концентрация протонов во внеклеточной жидкости ([H⁺]);

– содержание в ней бикарбонатного аниона ([HCO₃^–]);

– напряжение углекислого газа в артериальной крови (РаСО₂);

– анионный пробел плазмы.

Число анионов всегда равно числу катионов как в клетках, так и во внеклеточной жидкости. Если из величины содержания во внеклеточной жидкости и жидкой части плазмы их главного одновалентного катиона ([Na⁺]) вычесть общее содержание в них главных одновалентных анионов, хлоридного ([Cl^–]) и бикарбонатного ([HCO₃^–]), то мы получим значение анионного пробела плазмы (АПП).

Цель работы. Изучение основных свойств буферных растворов искусственного и природного происхождения.

Задачи работы:

приготовить стандартный ацетатный буфер, измерить его рН и сравнить с расчетным;

исследовать влияние разбавления, а также действия кислот и щелочей на рН буферов;

определить буферную емкость сыворотки крови.

Таблица 1

Измеряют рН приготовленных растворов и рассчитывают теоретическое значение рН по формуле

где рК ацетата равно 4,7.

а) в 3 пробирки наливают по 1 мл буферного раствора (рН одинаковый); во вторую пробирку добавляют 1 мл дистиллированной воды; в третью – 2 мл дистиллированной воды. Во все пробирки добавляют универсальный индикатор. Цвет проявившейся окраски заносят в табл. 2.

Таблица 2

Номер колбы	Объем, мл		Разбавление	Количество индикатора	Окраска
	буфера	воды
1 2 3	1 1 1	– 1 2	– в 2 раза в 3 раза	1 капля 2 капли 3 капли

Делают вывод об изменении буферных свойств раствора при различной степени разведения.

б) готовят растворы согласно таблице 3 и измеряют величину рН получившихся растворов.

Таблица 3

Делают вывод об изменении буферных свойств раствора при различной степени разведения.

В 6 колб, содержащих буфер либо дистиллированную воду, добавляют 0,01 н. раствора HCl или NaOH в соответствии с таблицей 4.

Определяют рН приготовленных растворов и делают вывод о влиянии кислот и щелочей на рН буферных систем.

В первую пробирку наливают 2 мл сыворотки крови, разведенной 1:10. Во вторую пробирку наливают буферный раствор с рН = 7,4, разведенный 1:10. В обе пробирки добавляют по 2 капли индикатора фенолфталеина. Содержимое пробирок 1 и 2 оттитровывают 0,1 н. раствором NaOH до появления малиново-красного окрашивания.

Производят расчет буферной емкости (В) сыворотки крови и буферного раствора согласно формуле

^,

где А – количество сильной щелочи, пошедшей на титрование (мл);

10 – разведение сыворотки (буфера);

рН₀ – водородный показатель содержимого пробирок до начала титрования (рН₀ = 7,4);

рН₁ – водородный показатель после окончания титрования (рН₁= 9);

н – молярная масса эквивалента щелочи;

2 – объем взятой сыворотки (буфера).

Сравнивают буферную емкость сыворотки крови и буферного раствора.

1. 
   В чем состоит функциональная роль буферных систем организма?
   
2. 
   Как готовят буферные растворы?
   
3. 
   От чего зависит рН буферных растворов?
   
4. 
   Как влияют на рН буферных растворов их разведение, а также добавление в раствор кислоты или щелочи?
   
5. 
   Как отличаются буферные емкости 0,1 н. ацетатного буфера при разных рН?
   

Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которыми обладают многие пористые материалы. Наиболее часто для этой цели применяют органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Разделение веществ при помощи гелей, основанное на различиях в размере молекул, называется гель-фильтрацией.

Принцип, лежащий в основе метода проникающей хроматографии, прост. Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем или пористыми стеклянными шариками и уравновешивают с помощью соответствующего растворителя. Крупные молекулы, не проникающие в поры сита, проходят между частицами геля, в то время как небольшие молекулы «застревают» в них и движутся с меньшей скоростью.

Для гель-фильтрации применяют гели на основе декстрана, полиакриламида, агарозы, полистиролов.

Гель образует неподвижную фазу, в которой с током буфера происходит разделение биологических молекул. Гель формируют в колонках, стеклянных или пластиковых, различного размера и диаметра (в зависимости от цели эксперимента). Гель-хроматография на сефадексе используется для обессоливания растворов белков (разделение крупных белковых молекул и малых молекул солей), определения молекулярных масс белков, разделения сложных смесей макромолекул. Размер биологических молекул является главным фактором их эффективного разделения при движении в пористом геле. Гели, используемые для хроматографии, имеют разный размер пор, что позволяет делить вещества в широком диапазоне молекулярных масс (1000 — 1000000 дальтон).

При прохождении через колонку геля смеси молекул разного размера крупные молекулы движутся быстрее, чем мелкие. В конечном итоге компоненты смеси элюируются с колонки, наполненной гранулами геля, в порядке уменьшения их молекулярной массы. Для характеристики процесса гель-фильтрации используют понятия: свободный объем колонки (Vo) и объем элюции (Ve). Свободный объем определяют путем пропускания через колонку раствора «голубого декстрана» (высокомолекулярного вещества с массой 2 х 10⁶ дальтон). Объем, с которым выходит пиковая концентрация голубого декстрана, называется свободным объемом колонки (Vo). Объем, с которым выходит пиковая концентрация разделяемого вещества, называется объемом элюции (Vэ).

Цель работы. Провести гель-хроматографию на колонке с сефадексом (гелем на основе декстрана) белковых экстрактов, выделенных из органов подопытных животных.

Задачи работы:

подготовить сефадекс к хроматографии;

подготовить гель-фильтрационную колонку к хроматографии;

провести гель-хроматографию белковой фракции и построить кривые элюирования.

1. 
   Буфер А (0,04 М натрий-фосфатный буфер, 0,26 м NaCl, рН 7,5).
   
2. 
   Буфер В (0,02 М натрий-фосфатный буфер, 0,13 м NaCl, рН 7,5).
   
3. 
   Голубой декстран (1мг/мл).
   
4. 
   Сефадекс G-75.
   

Оборудование:

1.Колонка для гель-фильтрации Биохиммак СТ.

2.Колба Бунзена (1000 мл) с резиновой пробкой.

3.Перистальтический насос LOIP LS-301.

4.Спектрофотометр SmartSpec Plus Вio-Rad

Ход работы:

1. 
   Подготовка сефадекса.
   

К объему набухшего сефадекса добавить равный объем буфера А, перемешать, дать отстояться и удалить надосадочную жидкость.

Перелить гель в колбу Бунзена, закрыть ее пробкой и дегазировать гель 15минут. По окончании дегазации сефадекс готов для внесения в колонку.

2. 
   Подготовка к работе гель-фильтрационной колонки.
   

Из колбы Бунзена налить в колонку гель сефадекса. По мере осядания гранул геля и вытекания элюата добавлять в колонку новые порции геля. После образования столбика геля высотой 98 см поднять конец выходной трубки выше уровня буфера в колонке. Необходимо постоянно наблюдать, чтобы гель находился под слоем буфера.

Присоединить к входу к колонке трубку от перистальтического насоса, наслоить на столбик геля вплоть до конца колонки элюирующий буфер В. Конец выходной трубки опустить вниз. Пропустить через колонку 300 мл буфера В со скоростью 20 мл/час. После этого убрать большую часть буфера над гелем, оставив около 2 мм

3. 
   Проведение гель-хроматографии белковой фракции.
   

Наслоить на столбик геля 6 мл белкового экстракта и дать впитаться в гель. Промыть стенки колонки 4 мл элюирующего буфера, удалить их. Наслоить на гель элюирующий буфер вплоть до конца колонки. Присоединить к колонке перистальтический насос.

Элюирующий буфер пропускать через колонку со скоростью 20 мл/час. Объем элюата, собранный до выхода из колонки декстрана, определяет свободный объем колонки. Далее элюат необходимо собирать фракциями по 5 мл. Собрав около 60 фракций, определить содержание в них белка по поглощению в ультрафиолетовой области спектра при 280 нм. Построить графики элюирования. По оси ординат значения поглощения при 280 нм, а по оси абсцисс номер фракции. Сравнить графики элюирования разных экстрактов. Сделать выводы.