Эмбриологические особенности системы семенной репродукции факультативно апомиктичных злаков 03. 00. 05 ботаника
жүктеу/скачать 0.97 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Тырнов Валерий Степанович
- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
- Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
- Глава 3. ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
На правах рукописиЮдакова Ольга Ивановна ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИСИСТЕМЫ СЕМЕННОЙ РЕПРОДУКЦИИФАКУЛЬТАТИВНО АПОМИКТИЧНЫХ ЗЛАКОВ03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Саратов – 2009 Работа выполнена в ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г.Чернышевского» на кафедре генетики
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Тырнов Валерий СтепановичОфициальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Эльконин Лев Александрович доктор биологических наук, профессор Матвеев Николай Михайлович доктор биологических наук, профессорВикторов Владимир Павлович Ведущая организация: Ботанический институт им. В.Л.Комарова РАН Защита состоится «____»___________2009 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83; Е-mail: biosovet@sgu.ru. С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского».
Автореферат разослан «____»__________2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета С.А. Невский
Для экспериментального получения апомиктичных форм также необходим банк данных о потенциальных донорах генетических факторов этого способа репродукции. Важной частью работ по созданию такого банка является поиск апомиктов в дикорастущей флоре и их цитоэмбриологический анализ. Вместе с тем, выявление апомиктичных видов и их изучение актуально важно для решения теоретических проблем, связанных с морфогенезом, формообразовательными и эволюционными процессами на основе разных систем размножения, генетикой и эволюцией пола и др. Учитывая высокую практическую значимость исследований по апомиксису, важно изучать способ репродукции особенно в тех таксономических группах, к которым принадлежат ценные сельскохозяйственные культуры (Батыгина, 1987). Объектом настоящего исследования стали представители семейства Злаки (Poaceae), поскольку они составляют основу пищевых ресурсов человека и используются в качестве главных кормовых и пастбищных культур. Цель исследования: выявление специфики структуры и функционирования системы семенного размножения факультативно апомиктичных злаков. Задачи исследования:
Научная новизна. Выявлены общие и специфические особенности эмбриологического развития факультативно апомиктичных злаков. Показана независимость характера проявления апомиксиса на эмбриологическом уровне у растений одного вида от условий места обитания их популяций. Установлено, что апомиктичные виды представляют большую группу в злаковом компоненте флор регионов с разными климатическими и географическими условиями. Впервые установлен факультативный апомиксис у семи видов злаков (Agrostis alba L., Hierochloë glabra Trin. s. l., H. repens (Host) Beauv., Koeleria cristata (l.) Pers., Poa badensis Haenke, P. chaixii Vill., P. sublanata Reverd.). Описан специфический механизм нередукции в мужской генеративной сфере апомиктичных злаков за счет движения хромосом к одному полюсу клетки в анафазе первого или второго деления мейоза. Определен диапазон изменчивости структуры мужских и женских гаметофитов и установлен закономерный характер проявления гаметофитных аномалий у апомиктов. Показана поливариантность процесса оплодотворения полярных ядер в пределах одного растения при псевдогамии. Изучены морфогенетические корреляции стадий эмбрио- и эндоспермогенеза. Дано цитоэмбриологическое обоснование концепции поливариантности процесса формирования семени у факультативно апомиктичных злаков. Научно-практическая значимость работы. Установленные закономерности эмбриологического развития факультативно апомиктичных злаков важны для дальнейшего более целенаправленного решения ряда ботанических, генетических, селекционных, биотехнологических и эволюционных проблем. Выявленные апомиктичные виды злаков могут быть использованы в качестве объектов исследования общих и специфических признаков апомиксиса, доноров признаков апомиксиса, а также исходного материала для создания апомиктичных сортов. Полученные данные расширяют возможности диагностики апомиксиса на эмбриологическом уровне. Апомиктичные злаки, обнаруженные во флоре Нижнего Поволжья, включены в уникальную коллекцию апомиктов Ботанического сада Саратовского госуниверситета. Материалы диссертации используются при чтении общего курса «Ботаника» и специальных курсов «Репродуктивная биология», «Эмбриология растений», «Современные методы селекции», «Генетика пола» в Саратовском госуниверситете. Апробация работы. Результаты исследований были доложены на: XXI Международном симпозиуме «Embryology and seed reproduction» (Санкт-Петербург, 1990); II съезде РБО (Санкт-Петербург, 1998); II съезде ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000); II Международной конференции по апомиксису (Комо, Италия, 2001); XI съезде РБО (Барнаул, 2003); Всероссийской научной конференции «Вавиловские чтения – 2005» (Саратов, 2005); I, II и III Международных школах для молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005; Уфа, 2007; Саратов, 2009); Международной научной конференции «Вопросы общей ботаники: традиции и перспективы» (Казань, 2006); Всероссийской научной конференции «Ботанические исследования в Поволжье и на Урале», посвященной 50-летию Ботанического сада Саратовского госуниверситета (Саратов, 2006); II съезде УОГиС (Алушта, Украина, 2007); III Международной конференции по апомиксису (Вернигероде, Германия, 2007); Международной конференции «Факторы экспериментальной эволюции» (Алушта, Украина, 2008); XII съезде РБО (Петрозаводск, 2008); XX Международном генетическом конгрессе (Берлин, Германия, 2008); научных конференциях Саратовского госуниверситета (2000-2008). Публикации. По материалам исследований опубликовано 36 работ, в том числе 2 монографии и 8 статей в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК РФ. Декларация личного участия автора. Автором выполнен цитоэмбриологический анализ всех видообразцов злаков, собранных на территории Нижнего Поволжья, и более 60% видообразцов из других регионов, что составляет 55 популяций 44 видов; проведена статистическая обработка результатов; сформулированы гипотезы и выводы; приготовлены микрофотографии; разработан модифицированный метод просветления семязачатков. Доля личного участия в написании совместных публикаций составляет от 40 до 80%. Связь с государственными научными программами, участие в выполнении грантов. Работа выполнена при финансовой поддержке тем аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы»: «Развитие Ботанического сада Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского как центра образовательной, научно-исследовательской и инновационной деятельности», «Развитие Ботанического сада Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского как центра биотехнологии растений», «Исследование генетических и эмбриологических закономерностей полиэмбрионии у растений», «Исследование закономерностей и путей модификации полигаметии у растений». Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы. Общий объем работы составляет 240 страниц, содержит 21 таблицу и 47 рисунков. Список литературы включает 470 источников, в том числе 320 на иностранных языках. Основные положения, выносимые на защиту:
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обосновывается актуальность проведенных исследований, определяются их цели и задачи. Глава 1. АПОМИКСИС У ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ РАСТЕНИЙ: НЕРЕШЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И ДИСКУССИОННЫЕ ВОПРОСЫ (обзор литературы) В главе рассматриваются вопросы терминологии и классификации апомиксиса; приводятся сведения о распространении апомиктичного способа репродукции у покрытосеменных растений (Frixell, 1957; Хохлов, 1970; Carman, 1995, 2007; Батыгина, 2000; Шишкинская и др., 2004 и др.); обсуждаются дискуссионные вопросы о причинах и механизмах возникновения апомиксиса (Gustafsson, 1946-1947; Rutishauser, 1969; Savidan, 1982; Nogler, 1995; Leblanc et al., 1995; Carman, 1997, 2007; Albertini, 2001; Соколов, Хатыпова, 2002; Perotti et al., 2004; Matzk et al., 2005, 2007; Okada et al., 2007 и др.) и его роли в эволюции покрытосеменных растений (Darlington, 1937; Stebbins, 1941; Gustafsson, 1946-1947; Петров, 1964; Хохлов, 1970; Wet de et al., 1974; Ellstrand, Roose, 1987; Asker, Jerling, 1992; Шишкинская, Тырнов, 2000; Hörandl, Paun, 2007 и др.). Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ2.1. Материал исследования Исследование проведено на кафедре генетики Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского в 1989-2009 гг. Изучение особенностей эмбриологии апомиктичных видов, начиная с процессов спорогенеза и заканчивая формированием семени, проводили на апомиктичных видообразцах мятликов (Poa L.) из коллекции Ботанического сада Саратовского госуниверситета: Poa badensis Haenke, P. chaixii Vill., P. compressa L. и P. pratensis L. Выбор мятликов в качестве объекта исследования обусловлен не только широким распространением апомиксиса у видов этого рода (Gustafsson, 1946; Nygren, 1954; Muntzing, 1965; Жиров, 1970; Кордюм, 1970; Kellogg, 1987; Батыгина, Маметьева, 1979; Шишкинская и др., 1994; Кутлунина, 2001 и др.), но и тем, что в последние годы они все чаще используются для решения проблем генетического контроля апомиксиса (Matzk, 1991; Naumova et al., 1993; Barcaccia et al., 1998; Albertini et al., 2001, 2004; Matzk et al., 2005, 2007 и др.). Кроме того, изучение эмбриологии представителей рода Poa имеет важное практическое значение, так как подавляющее большинство из них являются ценными кормовыми и газонными травами. Они включены в различные селекционные программы, в том числе направленные на создание сортов для долголетних пастбищ. Растения выращивались в открытом грунте. Фиксацию соцветий проводили ацетоалкоголем (3:1) темпорально: на стадии нераскрывшихся цветков, начала цветения, а также спустя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15 сут от начала цветения. В указанные сроки фиксировали соцветия не менее 10 растений каждого видообразца. Соцветия P. pratensis были зафиксированы в режиме открытого цветения и в беспыльцевом. Во втором варианте из зрелых нераскрывшихся цветков пинцетом удаляли пыльники. Соцветия изолировали бумажными пакетами, а затем фиксировали темпорально спустя 2, 3, 4, 5, 7, 14 сут после кастрации. У каждого видообразца анализ микроспороцитов и мужских гаметофитов проводили у растений, зафиксированных до начала цветения и в его разгар, структуру женских гаметофитов исследовали при всех сроках фиксации. С одного растения приготавливали не менее двух препаратов пыльцы и 20 зародышевых мешков. Всего было проанализировано более 10000 цитологических препаратов. Объектом популяционно-эмбриологических исследований послужила коллекция видообразцов дикорастущих злаков, собранных в разных регионах России. В ходе экспедиций производили случайную выборку видов злаков, фоновых для изучаемых территорий. В период открытого цветения 10-15 растений одного вида собирали с площади не менее 20 м2 и фиксировали смесью Чемберлена (Паушева, 1970). Всего было изучено 79 популяций 54 видов 28 родов злаков, проанализировано более 15000 препаратов.
2.2. Методы исследования Способ репродукции растений устанавливали на основе результатов анализа степени дефектности пыльцы (СДП) и структуры женских гаметофитов. Показатель «качество пыльцы» использовали для предварительной диагностики апомиксиса. Основными критериями для констатации апомиктичного способа репродукции служили эмбриологические признаки апомиксиса, касающиеся особенностей развития женского гаметофита, зародыша и эндосперма (Хохлов и др., 1978). Заключение о половом способе репродукции делали на основе двух главных критериев: отсутствии эмбриологических признаков апомиксиса и регистрации двойного оплодотворения. Для получения наиболее полной информации о специфике эмбриологических процессов при апомиксисе использовали комплекс различных методов цитоэмбриологического анализа: классический метод приготовления постоянных препаратов и экспресс-методы исследования мужской и женской генеративных сфер. Микроспорогенез и структуру микрогаметофитов изучали на временных и глицерин-желатиновых препаратах, окрашенных ацетокармином (Паушева, 1970; Куприянов, 1989). Женскую генеративную сферу исследовали на постоянных препаратах (Паламарчук, 1964), а также приготовленных с помощью методов просветления семязачатков (Herr, 1971) и выделения зародышевых мешков с помощью ферментативной мацерации и последующей диссекции семязачатков (Куприянов, 1982). Препараты анализировали с помощью микроскопов «Axiostar Plus» (K.Zeiss), «Axioskop» (K.Zeiss), «Jenoval» (К.Zeiss) при увеличении окуляра 15х и объектива 20х, 40х, 100х. Фотографирование осуществляли с помощью видеоадаптера «Canon» и программ визуализации изображения «Zoombrowser» и «AxioVision». Математическую обработку результатов проводили в соответствии с известными рекомендациями (Плохинский, 1970; Зайцев, 1984).
ФАКУЛЬТАТИВНО АПОМИКТИЧНЫХ ВИДОВ МЯТЛИКОВИзучение особенностей и закономерностей реализации разных способов репродукции (апомиксиса и амфимиксиса) в пределах одного растения и популяции в целом явилось основной целью первого раздела диссертационной работы. Применение ускоренных методов исследования способствовало выявлению широкого спектра нарушений развития репродуктивных структур апомиктичных злаков. Их анализ важен для понимания механизмов процессов, происходящих в ходе онтогенеза, а также для определения основных направлений и возможных пределов изменчивости репродуктивных структур (гаметофитов, гамет, зародыша и эндосперма). 3.1. Микроспорогенез и структура мужского гаметофита Специфика процесса микроспорогенеза у изученных апомиктичных видообразцов мятликов заключается в возможности формирования в одном пыльнике микроспор с разным уровнем плоидности: гаплоидных, анеуплоидных и диплоидных. К анеуплоидии приводят отставания отдельных хромосом в первом или во втором делении мейоза, к нередукции – различные нарушения расхождения хромосом и цитокинеза. Установлено три механизма образования диплоидных микроспор. Во-первых, нередукция может осуществляться за счет выпадения второго деления мейоза в одной из клеток диады микроспор. В результате вместо тетрады формируются триады с двумя гаплоидными и одной диплоидной клеткой (P. badensis – 1,5%; P. compressa – 0,4%; P. chaixii – 0,1%; P. pratensis – 4,0%). Во-вторых, у P. compressa и P. pratensis образование диплоидных микроспор также происходило за счет движения хромосом к одному полюсу клетки в анафазе I или II. Клеточная перегородка при этом закладывалась в зоне экватора, вследствие чего одна из клеток оказывалась безъядерной, а другая содержала нередуцированное число хромосом. Этот способ нередукции описан у апомиктичных форм впервые. И, наконец, диплоидные микроспоры формировались за счет слияния ядер в двухъядерных клетках. Их образование, как правило, являлось результатом выпадения цитокинеза в телофазе II. Кроме того, у P. pratensis наблюдали случаи, когда в анафазе II хромосомы двигались к одному полюсу клетки двумя отдельными группами и формировали два дочерних ядра. Заложение клеточной перегородки в зоне экватора приводило к образованию безъядерной и двухъядерной клеток. В зрелых пыльниках, наряду с нормальной трехклеточной пыльцой, встречались микрогаметофиты с четырьмя спермиями (P. badensis – 7,4%, P. chaixii – 9,4%, P. compressa – 7,4%, P. pratensis – 1,6%). Это указывает на то, что ядра в двухъядерных микроспорах могут не только сливаться, но и делиться независимо друг от друга. В среднем около 50-60% пыльцевых зерен в пыльниках изученных растений отклонялись от нормы по своему размеру и/или выполненности цитоплазмы. Коэффициент вариации (СV) диаметра пыльцевых зерен в пределах одного пыльника у всех видообразцов превышал 15%. Крупные пыльцевые зерна иногда в несколько раз превосходили по размеру самые мелкие. Морфометрические различия начинали проявляться на стадии микроспор, но наиболее выражены были в зрелой пыльце. Принимая во внимание известный факт корреляции размера клеток с плоидностью ядра, можно предположить, что часть негаплоидных пыльцевых зерен у апомиктов остается жизнеспособной. Это предположение подтвердили результаты сравнительного анализа частоты аномалий в первом делении мейоза с количеством нежизнеспособной (пустой или с плазмолизом) пыльцы в пыльниках. У P. pratensis при средней частоте нарушений расхождения хромосом в первом делении мейоза 8,8% количество дегенерировавших пыльцевых зерен должно составлять не менее 35,2%, поскольку из одной материнской клетки микроспор образуется четыре микроспоры. Однако в изученной выборке количество нежизнеспособной пыльцы оказалась равной всего лишь 5%, что достоверно ниже теоретически ожидаемого значения (P=0,05). Это возможно только в том случае, если часть пыльцевых зерен с разным уровнем плоидности будут оставаться жизнеспособными. Процессы микроспоро- и микрогаметофитогенеза в пределах одного пыльника у мятликов протекали асинхронно. Мейоциты могли находиться на разных стадиях деления: от профазы I до телофазы II. В зрелых пыльниках, наряду с трехклеточными пыльцевыми зернами, встречались одноядерные, двухъядерные и двухклеточные. Поскольку онтогенез мужских гамет сопровождается изменением их формы и размера (Грати, 1971; Нокс, 1990), то присутствие в пыльниках пыльцевых зерен с округлыми, овальными и веретеновидными спермиями также является отражением десинхронизации процесса микрогаметофитогенеза. 3.2. Мегаспорогенез и мегагаметофитогенез Нередуцированные зародышевые мешки у P. chaixii, P. compressa и P. pratensis развиваются из соматических клеток нуцеллуса в результате трех митотических делений (апоархеспория* Poa(Hieracium)-типа). Мейоциты либо дегенерируют, либо дают начало эуспорическим зародышевым мешкам, развитие которых проходит параллельно с развитием одного или нескольких апоархеспорических мегагаметофитов. Около 30% зрелых семязачатков содержали от 2 до 5 зародышевых мешков. Наряду с формированием эуспорических и апоархеспорических мегагаметофитов, у P. pratensis в нескольких семязачатках было зарегистрировано развитие зародышевого мешка из материнской клетки мегаспор (апоспория Antennaria-типа). Разные варианты развития нередуцированного женского гаметофита встречались также у P. badensis. У этого видообразца в подавляющем большинстве семязачатков зародышевые мешки формировались из халазальной клетки диады мегаспор (диплоспория Taraxacum-типа). В то же время в единичных случаях рядом с диадой и тетрадой мегаспор были обнаружены крупные клетки, морфология которых соответствовала инициальным клеткам апоархеспорических зародышевых мешков. Только 2,5% семязачатков у P. badensis содержали сдвоенные зародышевые мешки. Формирование более двух зародышевых мешков в одном семязачатке не наблюдалось. Структура зрелых женских гаметофитов у всех видообразцов характеризовалась широким спектром изменчивости. Наряду с редуцированными и нередуцированными зародышевыми мешками нормального строения (восьмиядерными, семиклеточными) встречались мегагаметофиты с нетипичной структурой. Среди атипичных зародышевых мешков преобладали мегагаметофиты с яйцеклеткоподобными синергидами (P. badensis – 0,1%; P. chaixii – 6,1%; P. compressa – 5,5%; P. pratensis – 4,4%) и дополнительными полярными ядрами (0,3; 6,3; 4,2 и 3,8%, соответственно). С более низкой частотой формировались зародышевые мешки с недифференцированным яйцевым аппаратом и неполным комплектом элементов (без синергид или антипод). У P. pratensis в единичных мегагаметофитах обнаружены яйцеклеткоподобные антиподы. Кроме того, у P. chaixii и P. pratensis зарегистрированы уникальные случаи образования вместо одной из антипод дополнительного зародышевого мешка. В некоторых зародышевых мешках наблюдалось сочетание разных гаметофитных аномалий. Основными причинами образования мегагаметофитов с атипичной структурой являются:
Вследствие десинхронизации митозов или выпадения делений в некоторых недифференцированных зародышевых мешках присутствовало нестандартное количество (3, 5, 6, 7) ядер. Недостаток ядер приводил в дальнейшем к отсутствию какого-либо элемента в зрелом зародышевом мешке. Чаще всего встречались мегагаметофиты без антипод, так как именно в халазальном районе наблюдалась нехватка ядер или их полное отсутствие. Ценоцитные зародышевые мешки, у которых ядра располагались в микропилярной части, были зарегистрированы у P. badensis (0,4%), P. chaixii (1,9%), P. compressa (0,9%) и P. pratensis (3,9%). В зрелых цветках практически с той же частотой (0,5; 1,6; 1,2 и 2,2%, соответственно) встречались гаметофиты без антипод. В большинстве атипичных мегагаметофитов количество ядер соответствовало норме, но их локализация была необычной для ценоцитных стадий. Наряду с биполярными зародышевыми мешками встречались: 1) аполярные с центральным расположением ядер; 2) униполярные, ядра которых были сосредоточены на одном конце клетки; 3) полиполярные с локализацией ядер на трех или четырех полюсах. Нарушение поляризации может привести к попаданию ядра в нехарактерную для него зону. Изменение позиционной информации в свою очередь делает возможным трансдетерминацию, т. е. переопределение направления развития элементов зародышевого мешка. В современной теории онтогенеза позиционной информации отводится ведущая роль в определении пути дифференциации клеток (Корочкин, 1999). Результаты сравнительного анализа атипичных зародышевых мешков на разных стадиях развития позволяют определить локализацию зон дифференциации в мегагаметофите. Среди более чем 4000 проанализированных зародышевых мешков не было зарегистрировано ни одного достоверного случая образования дополнительного полярного ядра за счет ядер «синергид», тогда как женские гаметофиты с дополнительными яйцеклетками вместо синергид встречались у всех видообразцов. В то же время среди сформированных зародышевых мешков обнаружены восьмиядерные мегагаметофиты с тремя полярными ядрами, трехклеточным яйцевым аппаратом и двумя антиподами, что указывает на образование дополнительного полярного ядра за счет одной из «антипод». Такое переопределение пути развития ядер мегагаметофита возможно, если зоны дифференциации в нем располагаются линейно одна над другой: в халазальной области зона антипод, за ней зона центральной клетки, затем зона яйцеклетки, и, наконец, зона синергид (рис. 1).
2 3 4 
жүктеу/скачать 0.97 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|
