Исследование силогенерирующего процесса в мышечных волокнах кролика с помощью быстрых изменений длины и температуры 48

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 3

ВВЕДЕНИЕ 14

ГЛАВА 1. Объект и методы исследования 29

ГЛАВА 2. Исследование силогенерирующего процесса в мышечных волокнах кролика с помощью быстрых изменений длины и температуры 48

ГЛАВА 3. Сравнение переходных процессов напряжения, вызванных

изменениями длины и температуры 65

ГЛАВА 4. Исследование реакции напряжения на быстрые изменения длины и температуры в мышечных волокнах кролика, обработанных ЭДК 85

ГЛАВА 5. Генерация силы и производство работы ковалентно пришитыми

поперечными мостиками в мышечных волокнах кролика 107

ГЛАВА 6. Рентгенодифракционные исследования структурных изменений, сопровождающих силогенерирующий процесс в мышце 118

ГЛАВА 7. Кинетика структурных изменений при развитии напряжения в

мышечных волокнах кролика в ответ на скачок температуры 128

ГЛАВА 8. Интерпретация результатов: структурно-кинетическая модель

двухшагового механизма работы поперечного мостика 141

ВЫВОДЫ 156

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 158

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение

Актуальность темы. Исследование молекулярного механизма мышечного сокращения является одной из интереснейших проблем биофизики. Согласно предложенным в середине 50-х годов теории скользящих нитей и мостиковой теории мышечного сокращения (Н. Huxley, Hanson, 1954; A. Huxley, Niedergerke, 1954; A. Huxley, 1957; Н. Huxley, 1969; A. Huxley, Simmons, 1971), в основе этого процесса лежит циклическое взаимодействие миозиновых головок, или "поперечных мостиков", выступающих из толстых нитей, с мономерами актина, составляющими основу тонких нитей. Это взаимодействие ведёт к укорочению саркомера, а длина самих нитей остаётся постоянной. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы, в частности, создание атомных трехмерных реконструкций актина, миозиновой головки и актин-миозинового комплекса (Holmes и др., 1990, 2004; Rayment и др., 1993а, б; Houdusse и др., 1999, 2000), многие важные детали механизма работы поперечных мостиков остаются неизвестными. По-прежнему нет полной ясности в том, с какими именно конформационными изменениями в актин-миозиновом комплексе связано развитие силы или укорочения мышечных клеток и каким образом химическая энергия гидролиза АТФ преобразуется в механическую работу. Даже фундаментальные вопросы о том, какая доля миозиновых мостиков участвует в развитии активного силы в каждый момент времени и на какое расстояние миозиновый мостик может переместить актиновую нить в результате гидролиза одной молекулы АТФ, являются предметом дискуссий (Kishino, Yanagida, 1988; Finer и др., 1994; Molloy и др.,

1995; Simmons и др., 1996; Ishijima и др., 1998; Linari и др., 1998; A. Huxley, 2000).

Проблема изучения молекулярного механизма мышечного сокращения состоит, главным образом, в том, что механическая функция актин-миозинового мотора может быть реализована лишь при сохранении надмолекулярной структуры мышцы, а исследование изолированных сократительных белков даже с использованием всех средств современной биохимии и молекулярной биологии способно дать лишь косвенную информацию об их механической функции. С другой стороны, изучение конформационных изменений актин-миозинового комплекса в структурированных системах, способных совершать механическую работу, таких как мышечное волокно или миофибрилла, сопряжено с большими трудностями в интерперетации результатов и определении механических параметров отдельных компонентов системы.

Таким образом, представляется актуальным исследовать взаимосвязи между макроскопическими механическими процессами сокращающения мышцы и молекулярными структурными событиями в сократительных белках, которые, как представляется, лежат в основе механической функции мышцы, в демембранизованных мышечных волокнах, где состав среды, окружающей сократительные белки, полностью контролируется экспериментатором, а механическая функция сохранена. Использование клеток с проницаемой мембраной позволяет применить такие современные методы нестационарной кинетики, как импульсный фотолиз веществ и скачок температуры для

синхронизации процессов, происходящих в отдельных миозиновых молекулах. Малоугловая дифракция рентгеновских лучей представляет собой один из наиболее продуктивных методов исследования структурных изменений в мышце на молекулярном уровне (Н. Huxley, 1996). Благодаря использованию мощных синхротронных источников рентгеновского излучения и быстродействующих электронных детекторов изменения интенсивностей самых ярких рефлексов от одиночных интактных клеток лягушки были измерены с субмиллисекундным временным разрешением (Irving и др., 1992; Dobbie и др., 1998). Результатом этих исследований явилось структурное подтверждение правильности мостиковой теории мышечного сокращения, предложенной А. Huxley и Simmons'oM в 1971 году. Прогресс, достигнутый в применении техники рентгеновской дифракции высокого временного разрешения к одиночным интактным мышечным волокнам, делает актуальным её применение для изучения структурных изменений в волокнах с проницаемой мембраной. В таких волокнах можно, в частности, использовать для инициализации силогенерирующего процесса в активном состоянии метод скачка температуры как альтернативу методу механических деформаций. В этом случае силогенерация происходит в изометрических условиях, то есть без относительного смещения толстых и тонких нитей. Результаты исследования механических характеристик переходных процессов в одиночных сокращающихся мышечных волокнах, вызванных высокоамплитудным скачком температуры показали, что эти характеристики существенно отличаются от таковых, вызванных механическими деформациями (Bershitsky, Tsaturyan, 1992;

Bershitsky, 2001). Более того, по нашим данным, переходные процессы напряжения, вызванные ступенчатыми деформациями и скачком температуры имеют различную природу (Bershitsky, Tsaturyan, 2002). Поэтому представляется актуальным детально исследовать механические характеристики отдельных мостиков и структурные события, сопровождающие цикл работы мостиков, используя эти два типа воздействий. Комбинация разных методов возбуждения силогенерирующего процесса в мостиках может помочь понять основы молекулярной природы мышечного сокращения.

Цели и задачи исследования: изучить термомеханические и кинетические характеристики элементарных молекулярных генераторов силы мышечного сокращения - поперечных мостиков - во время силогенерирующего процесса в мышце, а также рентгеноструктурные изменения в мышечных волокнах теплокровных (кролика), сопровождающие этот процесс, а именно:

1. Разработать метод скачка температуры для одиночных волокон скелетных мышц с одновременным измерением их механических характеристик в субмиллисекундном и структурных изменений в миллисекундном временном диапазоне;

2. Разработать экспериментальную модель демембранизованных клеток скелетных мышц теплокровных со стабилизированной структурой саркомеров, способных к длительной (десятки минут) активации, необходимых для механических и рентгеноструктурных исследований в различных физиологических состояниях;

3. Исследовать кинетику и термодинамику силогенерирующего шага мостиков при физиологической температуре;

4. Изучить механические реакции мышечных волокон кролика на скачок температуры и выяснить, с какими процессами в поперечных мостиках связаны эти реакции;

5. Сравнить переходные процессы силы в одиночных мышечных волокнах кролика, вызванные субмиллисекундными изменениями длины и температуры;

6. Зарегистрировать и исследовать рентгеноструктурные изменения в одиночных активированных мышечных волокнах с временным разрешением 1 мс, сопровождающие силогенерирующие процессы, вызванные быстрыми изменениями длины и температуры.

Методы исследования: микромеханика одиночных мышечных волокон высокого (-0,1 мс) временного разрешения; лазерная дифракционная регистрация длины саркомеров и управляемая изометрия с использованием длины саркомеров для обратной связи; джоулев скачок температуры; частичная ковалентная сшивка миозина с актином в мышечном волокне; рентгеновская дифракция высокого (1 мс) временного разрешения с использованием источников синхротронного излучения.

Объект исследования: одиночные химически демембранизированные (скицированные) волокна скелетных мышц кролика.

Научная новизна. В ходе работе:

- Впервые разработана экспериментальная техника и модель одиночных волокон скелетных мышц теплокровных с проницаемой мембраной, стабилизированных частичной ковалентной сшивкой, пригодная для исследования механических и структурных изменений методом рентгеновской дифракции высокого временного разрешения при физиологических условиях.

- Впервые разработан и реализован метод джоулева скачка температуры в одиночных клетках (волокнах) скелетных мышц кролика, превосходящий по своим характеристикам и возможностям известные в настоящее время методы.

- С помощью джоулева скачка температуры впервые получено независимое доказательство существования быстрого силогенерирующего шага в мостиках, присоединенных к тонким нитям, т. е. подтвержден один из главных постулатов мостиковой теории мышечного сокращения.

- Впервые показано, что силогенерирующий "шаг" мостиков может происходить без смещения толстых и тонких нитей в саркомерах и в условиях, исключающих отсоединение и присоединение миозиновых мостиков к тонким нитям.

- Впервые исследована кинетика механических ответов одиночных волокон скелетных мышц кролика на быстрое изменение температуры.

0

- Впервые показано и доказано, что увеличение напряжения в мышце при повышении температуры происходит за счёт увеличения сшюгенерирующей способности мостиков, а не их числа.

- Впервые показано, что реакция напряжения в мышце теплокровных в ответ на повышение температуры сопровождается значительным увеличением интенсивности первой актиновой слоевой линии на рентгенограмме, свидетельствуя о переходе присоединённых мостиков в стерео-специфически связанное с актином состояние.

- Впервые показано, что кинетика роста интенсивности первой актиновой слоевой линии на рентгенограмме волокон скелетных мышц кролика в ответ на скачок температуры с временным разрешением в 1 мс совпадает с кинетикой роста силы.

- Впервые показано, что силогенерирующие процессы в мышце, вызванные механическими деформациями и скачком температуры имеют разную природу.

- Найдены новые и уточнены известные детали механизма работы актин-миозинового мотора, что расширяет и дополняет знания о мышечном сокращении и ведёт к пересмотру существующих представлений о механизме генерации силы в мышце.

Практическая ценность. Работа посвящена изучению природы фундаментального явления - силогенерации в мышце, то есть того молекулярного механизма актин-миозинового взаимодействия, который лежит в основе биологической подвижности. Методы и подходы, разработанные в работе могут быть применены в во многих прикладных исследованиях особенностей сокращения скелетных и сердечных поперечно-полосатых мышц. К ним относятся: экспериментальная модель одиночных мышечных клеток с проницаемой мембраной, стабилизированных частичной ковалентной сшивкой; метод скачка температуры в одиночных клетках, позволяющий исследовать механическое поведение мышечных клеток с проницаемой мембраной при физиологической температуре и в изометрических условиях,; метод регистрации и контроля длины саркомеров мышечных волокон в воздухе; метод регистрации рентгенограмм одиночных клеток в воздухе, то есть с минимальным потерями из-за рассеяния фотонов окружающим раствором. Разработанные подходы и методы могут быть использованы для анализа особенностей работы актин-миозинового мотора в клетках различных типов в норме и при патологии, а метод джоулева скачка температуры потенциально применим и к другим биологическим объектам.

Публикации. Результаты диссертации изложены в 39 публикациях в научных журналах и сборниках конференций, а также в научных отчётах.

Апробация работы. Основные результаты были доложены на Международной конференции по медицинской биомеханике (Рига, 1986); на VI и VII

ю

Всесоюзных съездах по теоретической и прикладной механике (Ташкент, 1986; Москва 1991); на VIII и IX Всесоюзных симпозиумах "Биофизика и биохимия биологической подвижности" (Пущино, 1987; Тбилиси, 1990); на Выездном заседании секции биологической подвижности Научного совета по проблемам биофизики АН СССР (Ереван, 1988); на Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1989); на собрании Национального комитета СССР по теоретической и прикладной механике (Москва, 1986); на Всесоюзных школах по биологической подвижности (Лосево, 1985; 1989) и по физиологии и биофизике миокарда (Свердловск, 1981, 1984, 1987); на Всесоюзных семинарах "Биомеханика-84, -87, -90, -91" (Москва, 1984, 1990; Ленинград, 1987; Санкт-Петербург, 1991, 1999, 2001); на II и III Международных симпозиумах "Биологическая подвижность: новые методы исследования" (Пущино, 2001, 2004); на XVIII, XIX, XXIV, XXVI, XXVIII, XXX, XXXI, XXXII и XXXIII Европейских мышечных конференциях (Лунтерен, Нидерланды, 1989; Брюссель, Бельгия, 1990; Флоренция, Италия, 1995; Шневердинген, Германия, 1997; Йорк, Великобритания, 1999; Павия, Италия, 2001; Лунтерен, Нидерланды, 2002; Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004); на IV Международной конференции по мышечной энергетике (Сиена, Италия, 1992); на Международных рабочих совещаниях по мышечному сокращению и биологической подвижности (Альпбах, Австрия, 1998, 2001, 2004); на восьми ежегодных конференциях получателей грантов Медицинского Института им. Ховарда Хьюза (HHMI; Прага, Чехия, 1996; Варшава, Польша, 1997; Будапешт, Венгрия, 1998; Москва, Россия, 1999; Вашингтон, США, 2000; Ванкувер,

Канада, 2001; Керне, Австралия, 2002; Таллинн, Эстония, 2004); на собраниях Физиологического общества Великобритании (Эдинбург, 1989; Бирмингем, 1994); на семинарах Лондонской мышечной серии (London Muscle Series) в 1992 и 2002, а также на других научных конференциях и семинарах.

Часть экспериментов была выполнена в Отделе биофизики (Randall Institute) Королевского колледжа Лондонского университета (King's College London) при финансовой поддержке фонда Wellcome Trust; в Отделе физической биохимии Национального Института медицинских исследований Совета по медицинским исследованиям Великобритании (National Institute for Medical Research, MRC, Лондон); в Отделе биомедицинских наук Империал Колледжа Лондона (Biomedical Sciences Division, Imperial College London), и Лаборатории Дасбери, Чешир (Daresbury Laboratory, Cheshire); на Европейском синхротроне ESRF, Гренобль, Франция. Исследования, вошедшие в работу, были поддержаны грантами РФФИ, Wellcome Trust, HHMI, INTAS, MRC, Daresbury Laboratory, NATO, ESRF, EMBL, Royal Society, Международного научного фонда ISF (фонд Сороса) и совместным грантом ISF и Правительства России.

Автор считает своим долгом почтить память своего первого учителя профессора В Л. Изакова, который побудил в нём интерес к биофизике и стоял у истоков настоящего проекта. Автор хотел бы выразить благодарность своим учителям и наставникам: профессорам A.F. Huxley и R.M. Simmons'y и доктору D.R. Trentham'y» в немалой степени содействовавшем выполнению этой работы. Автор признателен своему другу и коллеге А.К. Цатуряну за многолетнее и

12

плодотворное сотрудничество. Автор благодарит также профессора B.C. Мархасина за его благожелательные и настойчивые усилия, подвигнувшие автора к написанию настоящей диссертации.

13

ВВЕДЕНИЕ

14

регистре, так что их Z-линии, а также А- и I-зоны совпадают и представляют собой чередующиеся тёмные и светлые полосы, идущие поперёк мышцы, что и определило название мышц - поперечно-полосатые, в отличие от гладких, не имеющих такой упорядоченной организации клеток. Поперечную исчерченность мышц можно видеть в световой микроскоп, предпочтительно интерференционный или фазово-контрастный. В силу регулярности саркомеров, их длину можно также измерять дифракционными методами, наиболее часто для этого используются гелий-неоновые или полупроводниковые лазеры.

15

превращается в механическую работу (Энгельгардт и Любимова, 1939). Миозиновая головка переходит в 'шейку' - длинный сс-спиральный участок тяжелой цепи, с которым ассоциированы легкие цепи. Их количество в миозинах разного типа варьирует в широких пределах. Мышечный миозин или миозин II содержит две тяжелые и четыре легких цепи. С-терминали каждой из тяжелых цепей соединены в супер-а-спиральный субфрагмент-2 (S2), переходящий в длинный стволовой и также супер-а-спиральный участок молекулы, называемый легким меромиозином (ЛММ). При физиологической ионной силе окружающего раствора (250 мМ) стволовые участки молекул миозина агрегируют и образуют миозиновые нити. В скелетных мышцах эти нити обладают спиральной симметрией и представляют собой трехзаходную правую спираль с периодом около 43 нм и осевым расстоянием между ярусами выступающих миозиновых головок ~14,3 нм. На один период миозиновой спирали приходится 9 молекул миозина или 18 миозиновых головок. Длинные суперспирализованные части молекул миозина (ЛММ) образуют ствол толстой миозиновой нити диаметром около 15 нм. Схема строения скелетной мышцы, ее клетки или волокна и основной структурной единицы - саркомера показана на рис. В.1.

Саркомер —

f-*\ Н-ДИСК

Миофибрилла

Z-диск

Миофиламенты внутри саркомера"

=ЙШШ

L_7^ I •»-»*

Рис.В.1. Структура скелетной мышцы.