Issn 305-9397. Ғылым және білім. 2022. №1-1 (66) issn 2305-9397
Материалы и методы исследований
жүктеу/скачать 7.12 Mb. Pdf көрінісі
|
| Материалы и методы исследований. Исследовательская работа проведена в полевых
и лабораторных условиях. Для своевременного выявления бактериального ожога проводились регулярные обследования насаждений яблони юга и юго-востока Казахстана во время вегетационного периода по методикам выявления и идентификации возбудителя ожога плодовых деревьев [16, 17]. Обследования насаждений яблони по выявлению возбудителя бактериального ожога на сортах яблони проведены в крупных производственных садах и фермерских хозяйствах Туркестанской, Жамбылской, Алматинской и Жетысуской областей и коллекционных насаждениях ТОО «КазНИИ плодоовощеводства», расположенный в Талгарском районе Алматинской области. С деревьев с явно выраженными симптомами поражения бактериальным ожогом отбирали ветки, листья для проведения микробиологических исследований. Для бактериологического анализа, подтверждающего наличие Erwinia amylovora в растении отбирали свежие образцы из коры, взятой на границе язвы, а также из бактериального экссудата, и согнутых кончиков молодых побегов. Выделение чистой культуры возбудителей бактериального ожога проводили по общепринятым методикам на 3-х питательных средах: картофельном агаре, Левановой среде и среде Кинга Б [17]. Выделение ДНК из бактериальной культуры. Экстракцию нуклеиновых кислот проводили с использованием PrepMan™ Ultra Sample Preparation Reagent и методом кипячения. В 100 мкл деионизированной воды вносили с помощью бактериологической петли колонию бактерии, далее добавляли 50 мкл реагента PrepMan™ Ultra тщательно вортексировали. Пробирки помещали в термостат на 10 минут при 99 ⁰С. После инкубации содержимое центрифугировали при 13.4 тыс. об/мин 2 минуты. 50 мкл супернатанта переносили в чистые пробирки. При методе выделения кипячением мазки культуры добавляли в 200 мкл деионизированной воды, затем образцы помещали в водяную баню или термостат при 100 ⁰С на 10 минут. После инкубации содержимое в центрифугировали при 13.4 тыс. об/мин 2 минуты. 50 мкл супернатанта, содержащего ДНК переносили в чистые пробирки. Постановка ПЦР. Для подтверждения принадлежности выдленных культур к Erwinia amylovora использовали классический метод ПЦР. ПЦР проводили с использованием праймеров описанных Taylor et al. [18], Gottsberger [19], Stöger et al. [20]. Реакцию ставили в |