Медико-биологические аспекты конструирования биокератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов 14. 01. 07 глазные болезни

ШИПУНОВА АННА ВЛАДИМИРОВНА

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ БИОКЕРАТОПРОТЕЗНОГО КОМПЛЕКСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

14.01.07 – глазные болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Министерства Здравоохранения России

Научные руководители:	Борзенок Сергей Анатольевич доктор медицинских наук Васильев Андрей Валентинович доктор биологических наук
Официальные оппоненты:	Зуев Виктор Константинович доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом хирургии хрусталика и интраокулярной коррекции ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России Калинников Юрий Юрьевич доктор медицинских наук, врач-офтальмолог ФГБУ Клинической больницы Управления делами Президента РФ
Ведущая организация:	ФГБУ «МНИИ Глазных болезней им. Гельмгольца» Министерства Здравоохранения России

Защита состоится «3» декабря 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.014.01 при ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России по адресу: 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России

диссертационного совета,

доктор медицинских наук В.В. Агафонова

Список сокращений

БКПК	Биокератопротезный комплекс		СЭМ	Сканирующая электронная микроскопия
ВКМ	Внеклеточный матрикс		ФБ	Фибробласты
КПК	Кератопротезная конструкция		ЭТС	Эмбриональная телячья сыворотка
МФБ	Миофибробласты		DMEM	Среда Игла в модификации Дульбекко
ОПК	Опорная пластинка кератопротеза		UVA	Ультрафиолет - А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы

По данным Всемирной организации здравоохранения в 2010 году заболевания роговицы явились причиной слепоты 8-ми млн человек (World Health Organization, 2011). Пересадка роговицы при бельмах IV-V категории (по классификации В.П. Филатова и Д.Г. Бушмич, 1947) является неэффективной вследствие развития различного рода осложнений иммунного генеза, приводящих к помутнению трансплантата. Единственным способом восстановления зрения пациентам с такими бельмами остается протезирование роговицы (Филатов В.П.,1934; Гундорова Р.А., 1969; Федоров С.Н., 1969; Зуев В.К., 1974; Якименко С.А. и др., 1981, 1983, 1985; Мороз З.И., 1987; Калинников Ю.Ю., 2000, 2005; Cardona H., 1964, 1977; Barraquer J.,1965; Choyce D., 1965, 1966, 1968, 1973, 1980; Dohlman C., 1967, 1999; Hicks C., 1998). При этом существенной проблемой кератопротезирования остается сохранение имплантированного протеза в тканях бельма из-за отсутствия его истинного приживления в тканях (Гундорова Р.А., 1969; Федоров С.Н., 1969, 1982; Якименко С.А. и др., 1985; Калинников Ю.Ю., 2004; Мороз З.И., 2007; Cardona H., 1964, 1977; Barraquer J.,1965; Choyce D., 1980; Dohlman C., 1999; Hicks C., 1998). В этой связи актуальным вопросом остается создание "идеального" кератопротеза, обладающего высокими оптическими характеристиками и способного надежно интегрироваться в ткани роговицы. Эволюция кератопротезирования шла по пути совершенствования формы, размеров кератопротезов и материалов для их изготовления. Постепенно на смену ригидных гидрофобных материалов (пластик, резина) для конструирования кератопротезов пришли гидрофильные гидрогели, обладающие повышенными интегративными свойствами, способностью пропускать кислород и глюкозу, а также стимулировать эпителизацию поверхности материала после имплантации (Федоров С.Н., 1982, 1995; Калинников Ю.Ю., 2005; Dohlman C., 1999; Legeais J., 2001; Alió J., 2004; Hicks C. et al., 2006; Myung D. et al., 2008). Но, несмотря на достоинства кератопротезов таких моделей, их использование не гарантирует отсутствия таких специфических осложнений, как кератомаляция и отторжение кератопротеза (Калинников Ю.Ю., 2005; Legeais J. et al., 1991; Chirila T. et al.,1993; Hicks C.et al., 1998).

Согласно ранее проводимым патогистологическим исследованиям (Федоров С.Н. и др., 1970; Панормова Н.В., Малов В.М., 1977; Пучковская Н.А.,1979; Шехтер А.Б., Розанова И.Б., 1999) имплантация в организм любого чужеродного материала, в том числе биологических тканей, вызывает стереотипную воспалительно-репаративную реакцию, приводящую к пролиферации фибробластов (ФБ), образованию коллагеновых волокон и других компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), формирующих соединительнотканную капсулу вокруг инородного тела. При развитии различных осложнений происходит срыв адаптивной воспалительно-репаративной реакции, связанный с нарушением межклеточных взаимодействий, способствующих нарушению нейтрофильного и макрофагального звеньев процесса, снижению количества макрофагально-фибробластических и других межклеточных контактов, что приводит к выраженному торможению пролиферативной фазы процесса (Шехтер А.Б., Серов В.В., 1991).

Применение клеточных технологий сегодня позволяет замещать и восстанавливать ткани организма. Культивированные ФБ кожи человека в виде клеточных линий и в составе тканеинженерных конструкций широко используются в комбустиолоии, урологии, стоматологии и других клинических областях медицины, во многом решив проблему недостатка донорского материала (Терских В.В., Васильев А.В., 1995).

Многими исследователями ведутся активные разработки по созданию "искусственной роговицы" (Griffith M.et al., 2008; Myung D.et al., 2008; Sheardown H.et al., 2008) и оптимальных способов доставки культивированных клеток в зону дефекта роговицы с целью стимуляции репаративных процессов (Васильев А.В. и др., 2000,2005; Макаров П.В., 2003; Ходжабекян Г.В., 2003; Беляев Д.С., 2009).

При этом большое внимание при конструировании искусственных роговиц уделяется повышению прочностных свойств матрикса. С этой целью в конструкцию включают синтетические полимеры (Li F.et al., 2003), а также проводят рибофлавин – Ultraviolet A (UVA) - индуцированную фотохимическую сшивку коллагена (McLaughlin C.et al., 2009).

Учитывая успешные результаты создания и применения тканеинженерных конструкций для замещения роговицы и восстановления ее поверхностных дефектов, стал актуальным вопрос использования достижений регенеративной медицины для создания кератопротезов нового поколения с повышенными прочностными и интегративными свойствами за счет использования прочного биополимерного каркаса и клеточных элементов, что послужило основанием к выбору цели исследования.
Цель

Повысить надежность приживления кератопротеза путем создания биокератопротезного комплекса, включающего кросслинкинг-модифицированную донорскую роговицу и культивированные фибробласты кожи человека

1. Разработать конструкцию биокератопротезного комплекса на основе кросслинкинг-модифицированной донорской роговицы и фибробластов кожи человека.

2. Изучить морфологические особенности сочетанного применения кросслинкинг-модифицированных донорских роговиц и фибробластов кожи человека в составе конструкции биокератопротезного комплекса в эксперименте in vitro.

3. Разработать на кроликах экспериментальную модель для изучения биокератопротезного комплекса.

4. Изучить медико-биологические и экспериментально-клинические закономерности приживления разработанной модели биокератопротезного комплекса в эксперименте на кроликах.
Научная новизна результатов исследования

1. Впервые разработанная модель кератопротеза, названная биокератопротезным комплексом, включающая кросслинкинг-модифицированную роговицу, культивированные фибробласты кожи человека и кератопротез модели Федорова-Зуева, позволила в эксперименте избежать развития специфических осложнений при имплантации в глаза лабораторных животных (кроликов).

2. Впервые в эксперименте in vivo показано, что применение аутологичных фибробластов кожи человека в составе биокератопротезного комплекса приводит к более выраженному формированию соединительной ткани вокруг опорной пластинки кератопротеза и неоваскуляризации, чем при использовании аллогенных фибробластов.

3. Впервые установлено, что биодеградирующие желатиновые микроносители при имплантации в составе биокератопротезного комплекса, способствуют активной миграции фибробластов реципиента в полость интрастромального кармана роговицы, их трансформации в миофибробласты, и тем самым, надежно повышают приживление конструкции биокератопротеза.

1. Впервые разработаны подходы к поэтапному конструированию биокератопротезного комплекса на основе кросслинкинг-модифицированной роговицы и культуры аутологичных фибробластов кожи, состоящие в формировании кармана в строме донорской роговицы, проведении кросслинкинг-модификации коллагенового матрикса стромы, введении в полость интрастромального кармана опорной пластинки кератопротеза Федорова-Зуева и культивированных фибробластов кожи на желатиновых микроносителях с последующим инкубированием конструкции в течение 7-ми суток перед имплантацией.

2. Впервые показано, что кросслинкинг-обработка донорских роговиц, невостребованных для кератопластики, повышает плотность упаковки коллагеновых пластин стромы, способствует повышению устойчивости ткани к протеолитическим ферментам слезы, водянистой влаги и интервенции активных макрофагов, что позволяет использовать их в качестве матрицы биокератопротезной конструкции.

3. Впервые показано, что изучение особенностей приживления биокератопротезного комплекса возможно в эксперименте in vivo на глазах лабораторных животных (кроликов) в виде имплантации в интрастромальный карман роговицы в четвертой части биокератопротезной конструкции.

1. Новое поколение клеточно-тканевой биоинженерной конструкции кератопротезов - биокератопротезный комплекс, обладает повышенными прочностными свойствами, устойчивостью к протеолитическим ферментам слезы, водянистой влаги и интервенции активных макрофагов за счет использования в качестве биополимерного каркаса кросслинкинг-модифицированной аллогенной донорской роговицы, культивированных фибробластов кожи на желатиновых микроносителях, способствующих развитию репаративных процессов в строме и полости интрастромального кармана.

2. В эксперименте in vivo показано, что имплантация биокератопротезного комплекса повышает надежность его биологического приживления в глазах экспериментальных животных (кроликов) и обеспечивает профилактику специфических осложнений за счет активного формирования соединительнотканной капсулы вокруг опорной пластинки кератопротеза, интенсивной неоваскуляризации и пролиферации аутологичных фибробластов в полости интрастромального кармана.
Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях ФГБУ МНТК «МГ» им. акад. С.Н.Федорова (Москва, 2010, 2012), V Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2010), V Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2010), Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), IX Всероссийской научной конференции с международным участием «Федоровские чтения» (Москва, 2011) и X Всероссийской научной конференции с международным участием «Федоровские чтения» (Москва, 2012), VI Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2012).

На V Всероссийской научной конференции молодых ученых доклад на тему: «Биоинженерная конструкция кератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов реципиента» был удостоен 1-й премии.

На Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (2010) доклад на тему: «Предварительные результаты конструирования биокератопротезного комплекс с использованием аутофибробластов кожи реципиента» был удостоен 3-го места.

По теме диссертации опубликованы 16 печатных работ, в том числе 3 – в журналах, рецензируемых ВАК РФ. Имеется 1 патент РФ на изобретение.

Работа изложена на 135-ти страницах машинописного текста, иллюстрирована 9-ью таблицами, 38-ью рисунками. Список используемой литературы включает 272 источника, из них 82 - отечественных и 190 - иностранных. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав, содержащих данные обзора литературы, экспериментальных исследований in vitro и in vivo, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка используемой литературы.

Экспериментальные исследования проводились на базе Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (руководитель - д.м.н. С.А. Борзенок) и Лаборатории проблем клеточной пролиферации ФГБУН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук (руководитель - д.б.н., проф. В.В.Терских) совместно с к.б.н., н.с. Э.Б. Дашинимаевым. Гистологические исследования выполнены на базе лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (зав. Лабораторией - к.м.н. Шацких А.В.). Иммуногистохимические и цитохимические исследования осуществлялись в Лаборатории проблем клеточной пролиферации ФГБУН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук. Сканирующая электронная микроскопия выполнялась на базе лаборатории анатомии микроорганизмов ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН (руководитель д.м.н. Л.В. Диденко) совместно с к.м.н. Н.В. Шевлягиной.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы

В основу диссертационной работы положен комплекс экспериментальных исследований in vitro и in vivo.

Материалом для исследования in vitro послужили трупные донорские роговицы, невостребованные для кератопластики (n=36) с низкими морфофункциональными показателями - 1 А-0 (классификация С.А.Борзенка, 2008), выделенные из глаз доноров-трупов на базе Глазного тканевого банка Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

В исследовании использовались культивированные аллогенные ФБ кожи, предоставленные Лабораторией проблем клеточной пролиферации ФГБУН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук.

В качестве трехмерного матрикса для культивированных ФБ применялись желатиновые микроносители CultiSpher-S (Percell, HyСlone, США).

Конструкция биокератопротезного комплекса (БКПК) разрабатывалась на основе кератопротеза модели Федорова-Зуева (n=36).

Исследование in vivo проведено на 30-ти кроликах-самцах (30 глаз) породы шиншилла, весом 2,0-2,5 кг в возрасте 6-ти месяцев. Для конструирования БКПК были использованы трупные аллогенные кроличьи роговицы (n=8) и кератопротезы Федорова-Зуева (n=8). Общий расход кроликов составил 38 животных. Источником первичной культуры кроличьих ФБ служила кожа внутренней поверхности уха животных. Выделение ФБ осуществлялось с помощью механической дезагрегации и ферментативной обработки 0,1% коллагеназой I типа (Worthington, США) с последующей отмывкой и центрифугированием.

Исследование клеточных культур и инкубированных конструкций осуществлялась на инвертированном микроскопе «Leica DM IL» (Leica, Германия) и инвертированном флуоресцентном микроскопе Olympus IX51 (Olympus, Япония).

В связи с необходимостью прижизненной визуализации введенных ФБ внутри инкубируемой биокератопротезной конструкции в них предварительно путем трансфекции был введен ген усиленного зеленого флуоресцирующего белка – EGFP (Евроген, Россия).

Для морфологических и иммуногистохимических исследований проинкубированные КПК на основе аллогенных роговиц человека, а также полученные биоптаты (глазные яблоки кроликов) с имплантированными в строму роговицы КПК, доставляли в лабораторию в 4% растворе параформальдегида в течение 3 часов с момента изъятия. Затем из трупных глаз кроликов вырезали корнеосклеральные диски. Перед приготовлением всех препаратов из роговиц извлекали ОПК. После этого по стандартной методике заливали кусочки в парафиновые блоки, из которых делали полутонкие срезы по 5 микрон. Срезы из биоптатов глаз кроликов окрашивали гематоксилин-эозином. Для проведения иммуногистохимии срезы депарафинизировали непосредственно перед окрашиванием антителами. С целью определения экспрессии маркерных белков ФБ использовали следующие первичные и вторичные антитела:

-для выявления маркера миофибробластов и гладкомышечных клеток:

• Мышиные моноклональные антитела к α-SMA (Abcam, США);

• Козлиные поликлональные вторичные антитела к мышиному IgG

(Abcam, США);

-для идентификации трансфицированных клеточных элементов

• Антитела против зеленого флуоресцирующего белка EGFP

(Abcam, США);

• Козлиные вторичные антитела к мышиному IgG H&L

(Chromeo™ 488) (Abcam, США);

С помощью сканирующей электронной микроскопии (Quanta 200 3D, FEI, США) исследовались архитектоника роговицы до и после проведения процедуры кросслинкинга, а также содержимое интрастромального кармана инкубированного БКПК.

Для выявления живых клеток в культуре использовался витальный краситель Calcein АМ (Biotium, США), а также флуоресцентный краситель DAPI (Invitrogen, США), окрашивающий А-Т регионы ДНК клеточных элементов. Для определения мертвых клеток использовался бромистый этидий (Biotium, США).
Моделирование кератопротезных конструкции in vitro

С целью создания оптимальной модели БКПК было исследовано in vitro 3 типа конструкций.

Контролем (n=12) являлась конструкция, состоящая из нативной донорской аллогенной роговицы человека, в интрастромальный карман которой была имплантирована опорная пластинка кератопротеза (ОПК) модели Федорова-Зуева (рис.1А).

В опытной группе № 1 (n=12) использовалась конструкция, состоящая из кросслинкинг-модифицированной аллогенной донорской роговицы человека с имплантированной ОПК (рис.1В). Кератопротезная конструкция (КПК) опытной группы № 2 (n=12) на основе кросслинкинг-модифицированной аллогенной донорской роговицы (рис.1С) была дополнена введением внутрь интрастромального кармана 200 мкл суспензии трансфицированных ФБ кожи человека, культивированных на желатиновых микроносителях (2х106 кл/мл.). В связи с тем, что в КПК были использованы биологические компоненты (донорская роговица, культивированные ФБ) и металлическое изделие, она была названа «биокератопротезным комплексом».

Далее полученные КПК контрольной и опытных групп помещались в полную ростовую среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащую 10% раствор эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), гентамицин -10 мкг\мл и амфотерицин В – 50 ед/мл, и инкубировались в стандартных условиях(5% СО2, 100% влажность, 37 0С) в течение 7-и, 14-и, 21-их, 28-ми и 35-ти суток.
Результаты лабораторных исследований конструирования биокератопротезного комплекса

В результате проведенного эксперимента in vitro было обнаружено, что ФБ активно адгезировались на поверхности ОПК и росли на ней до состояния монослоя. На всех сроках наблюдения (1-7 сутки) окраска клеточных элементов

А

С
Рис. 1. Схематическое изображение кератопротезных конструкций на основе: А – нативной аллогенной донорской роговицы человека и опорной пластинки кератопротеза модели Федорова-Зуева; В – кросслинкинг-модифицированной аллогенной донорской роговицы человека и опорной пластинки кератопротеза модели Федорова-Зуева; С - кросслинкинг-модифицированной аллогенной донорской роговицы человека, опорной пластинки кератопротеза модели Федорова-Зуева, трансплантированных культивированных фибробластов кожи на желатиновых микроносителях

бромистым этидием была негативной, что указывало на отсутствие клеточной гибели. Безопасность инъекционного введения клеточных элементов на желатиновых микроносителях была подтверждена положительной иммуногистохимической окраской на наличие EGFP. Наблюдалась постепенная миграция введенных ФБ с поверхности желатиновых микроносителей в ткани роговицы. При этом трансфицированные клеточные элементы определялись, как внутри интрастромального кармана, так и в строме роговицы, что могло свидетельствовать о способности фибробластоподобных клеточных элементов перемещаться по межпластинчатым пространствам стромы.

В результате иммуногистохимического окрашивания полученных срезов на маркер МФБ и гладкомышечных клеток было отмечено флуоресцентное свечение трансплантированных клеток, свидетельствующее о трансформации введенных ФБ в МФБ.

На электронограммах образцов с кросслинкинг-модифицированной стромой (опытные группы №1, №2) была выявлена более выраженная упаковка коллагеновых пластин по сравнению с электронномикроскопической картиной образцов контрольной группы, что согласуется с данными ряда авторов (Wollensak G. et al., 2003), и является признаком повышения прочностных свойств коллагенового каркаса роговицы.

Образование фибриллярного синцития вокруг опорной пластинки протеза наблюдалось, начиная с 7-х суток инкубирования конструкции, и продолжалось до конца эксперимента (35 суток).

Таким образом, было подтверждено, что оптимальная конструкция БКПК должна состоять из кератопротеза, изготовленного из инертного и биосовместимого материала (такого как титан), кросслинкинг-модифицированной роговицы с повышенными прочностными свойствами и культивированных ФБ на желатиновых микроносителях, способствующих образованию соединительной ткани вокруг ОПК.

Для доказательства состоятельности разработанной конструкции БКПК были проведены эксперименты in vivo на лабораторных животных.

Для экспериментов использовались глаза кроликов с неизмененной прозрачной роговицей, подходящей для визуального наблюдения за состоянием имплантата и ответной реакцией на него со стороны окружающей ткани в раннем и позднем послеоперационном периодах. Имплантация конструкции в неизменённую роговицу была также обусловлена ожиданием более выраженной реакции отторжения имплантата в здоровой роговице по сравнению с бельмом (Пучковская Н.А. с соавт., 1970; Фёдоров С.Н., Мороз З.И., Зуев В.К., 1982).

При моделировании эксперимента на животных учитывался факт наличия у кроликов тонких (400 мкм) и больших в диаметре (15 мм) роговиц (Gwon A., 2007) , что существенно затрудняет расслаивание донорской роговицы кролика, введение опорной пластинки в интрастромальный карман и проведение хирургических манипуляций. В связи с этим была предложена имплантация КПК путем введения в строму роговиц животных имплантата, представляющего собой четвертую часть кератопротезной конструкции.

Животные-реципиенты (n=30) были разделены на 5 групп (по 6 в каждой), которым в строму роговиц которых вводились различные варианты КПК. В контрольной группе в строму роговицы кроликов вводили имплантат на основе нативной донорской роговицы, содержащий четвертую часть дужки ОПК. В опытной группе №1 конструкция отличалась использованием кросслинкинг-модифицированной стромы донорской роговицы. В опытной группе №2 в конструкцию на основе кросслинкинг-модифицированной стромы дополнительно вводились желатиновые микроносители, а в опытные группы №3 и №4 вводились, соответственно, аутологичные и аллогенные ФБ кожи кролика, культивированные на желатиновых микроносителях.

Клиническую оценку состояния глаз животных проводили по степени воспалительной реакции, васкуляризации роговицы (Ченцова Е.В., 1996), интенсивности помутнения роговицы (Войно-Ясенецкий В.В., 1953). Животные выводились из эксперимента на 7-е сутки и через 3 месяца после имплантации конструкций.
Результаты экспериментально-клинических исследований имплантации биокератопротезного комплекса

Анализ результатов клинических исследований показал наличие незначительной воспалительной реакции на введение имплантатов в роговицах животных всех исследуемых групп, купирующейся самопроизвольно к 14-м суткам.

Помутнение на 7-е сутки наблюдалось в опытных группах №2-4. При этом в опытной группе № 3 (на основе кросслинкинг-модифицированной роговицы, аутологичных ФБ и желатиновых микроносителей) интенсивность помутнения была максимальной. Наименее выраженное помутнение на всех сроках наблюдения было выявлено в опытной группе № 1, где в роговицу вводился имплантат на основе кросслинкинг-модифицированной стромы.

Степень интенсивности новообразования сосудов в первые 7 суток во всех группах была на одном уровне, но, начиная с 21-х суток, на фоне увеличения новообразования сосудов во всех группах, в опытной группе № 1 (на основе кросслинкинг-модифицированной роговицы) этот показатель оставался стабильным до окончания эксперимента.

На сроке 3-и месяца в опытной группе № 3 (на основе кросслинкинг-модифицированной роговицы, аутологичных ФБ и желатиновых микроносителей) степень интенсивности роста новых сосудов была наивысшей.

Отличия опытной группы № 1, состоящие в меньшей степени интенсивности помутнения и новообразования сосудов в роговице, могут быть связаны с изменением физико-химических свойств коллагена за счет проведенного фотохимического воздействия, приводящего к уменьшению количества жизнеспособных клеточных элементов в строме, образованию дополнительных сшивок и снижению уровня связывания воды (Paul R., Bailey A., 1996; Wollensak G., 2004).

Таким образом, результаты динамического изучения трансплантации различных вариантов КПК показали формирование более выраженного бельма с образованием умеренно выраженной васкуляризации в опытных группах, где использовались желатиновые микроносители и культивированные клеточные элементы. При этом максимальная интенсивность бельма наблюдалось в опытной группе, где применялись аутологичные ФБ кожи.

Проведенные морфологические исследования показали, что на раннем сроке наблюдения в строме имплантатов контрольной группы определялись фибробластоподобные клетки, вероятнее всего, являющиеся донорскими клетками роговицы, так как в образцах КПК, где предварительно проводилась процедура кросслинкинга, клеточные элементы отсутствовали (опытные группы № 1 и 2), что может быть связано с их гибелью во время UVA - воздействия. Однако в опытных образцах, предварительно инкубированных с использованием культуры клеток (опытные группы № 3 и 4), в кросслинкинг-модифицированной строме КПК визуализировались фибробластоподобные клетки, что может быть связано с их миграцией из интрастромального кармана в строму в процессе культивирования.

Через 3 месяца в контрольной группе наблюдалась инфильтрация стромы имплантата фибробластоподобными клетками и единичными макрофагами. Но при этом вокруг ОПК признаков созревания соединительной ткани не отмечалось. В опытной группе №1 (на основе кросслинкинг-модифицированной роговицы) наблюдалась минимальная клеточная инфильтрация стромы. Признаков образования соединительной ткани вокруг ОПК также не было.

На позднем сроке в опытной группе, где использовали желатиновые микроносители без клеточной культуры (опытная группа № 2), в кросслинкинг-модифицированной строме имплантата отмечали появление фибробластоподобных клеток. В полости интрастромального кармана наблюдались биодеградирующие желатиновые микроносители, интегрирующиеся в строму. Кроме того, визуализировалась неполноценная нежная соединительнотканная капсула.

В образце роговицы из группы № 3 (на основе кросслинкинг-модифицированной роговицы, аутологичных ФБ и желатиновых микроносителей) вокруг ОПК визуализировались биодеградирующие желатиновые микроносители, а также выраженная и полноценная фиброзная капсула, которая по своим признакам (наличие активных форм ФБ) имела тенденцию к дальнейшему созреванию. Отличия этой группы также состояли в более выраженной васкуляризации в области имплантации ОПК по сравнению со всеми остальными группами.

В группе, где использовались аллогенные клетки (опытная группа № 4), полость интрастромального кармана была заполнена биодеградирующими желатиновыми микроносителями, интегрирующимися в строму. В составе соединительнотканной капсулы преобладали зрелые формы ФБ, что свидетельствовало о снижении активности процесса формирования соединительнотканной капсулы.

Проведенные гистологические исследования позволили прийти к выводу, что применение в составе БКПК кросслинкинг-модифицированной стромы в качестве биополимерного каркаса способствует повышению прочностных характеристик конструкции за счет экранирования коллагена от миграции клеточных элементов, что является хорошим прогностическим признаком надежного приживления трансплантата.

При использовании аутологичных ФБ на желатиновых микроносителях процессы неоваскуляризации и формирования соединительной ткани вокруг ОПК происходили более интенсивно в сравнении с аллогенными клетками и продолжались более 3 месяцев после имплантации конструкции в строму роговиц кроликов.

Полученные результаты иммуногистохимического исследования препаратов роговиц с имплантированными БКПК свидетельствовали о значительной роли культивированных ФБ и желатиновых микроносителей в развитии заместительной регенерации. Желатиновые микроносители способствовали малотравматичному введению клеток в интрастромальный карман роговицы, создавали трехмерные условия для трансформации ФБ в МФБ, являлись дополнительным субстратом для синтеза межклеточного вещества и способствовали неспецифической стимуляции миграции клеточных элементов реципиента. Пролиферация фибробластоподобных клеточных элементов и их миграция в строму свидетельствовали об активных пролиферативных процессах, как в коллагеновом каркасе, так и в полости интрастромального кармана.

Было установлено, что через 3 месяца после имплантации КПК в строму кроликов, определялись только аутологичные клети, в то время как аллогенные ФБ отсутствовали. Отсутствие аллогенных клеточных элементов в имплантатах может быть связано с их лизисом, произошедшим на сроке менее 3-х месяцев после введения КПК в строму роговиц кроликов. Аутологичные клетки на данном сроке оставались in situ, способствуя более выраженному фиброзу и образованию сосудов в участках стромы, прилегающих к ОПК, что подтверждается в ранее проводимых работах другими исследователями (Швецова Е.В.. 2009; Aubock J., 1988; Gielen V., Faure M. et.al., 1987; Hancock K., Hackett M., 1989; van der Merwe A et.al., 1990).

1. Повышение надежности приживления кератопротеза может быть достигнуто созданием биоинженерной конструкции, названной «биокератопротезный комплекс», представляющей собой аллогенную кросслинкинг-модифицированную донорскую роговицу в интрастромальный карман которой имплантированы опорная пластинка кератопротеза модели Федорова-Зуева и культивированные фибробласты кожи на желатиновых микроносителях.

2. Сочетанное использование роговиц с кросслинкинг-модифицированной стромой и фибробластов кожи на желатиновых микроносителях способствует усилению прочностных свойств биокератопротезного комплекса за счет повышения плотности упаковки коллагеновых пластин стромы роговицы, их экранирования от миграции активных макрофагов, образования миофибробластов с последующим формированием соединительнотканной капсулы вокруг опорной пластинки кератопротеза.

3. Изучение приживления и прочностных характеристик биокератопротезного комплекса в глазах экспериментальных животных (кроликов) возможно путем имплантации в строму роговиц четвертой части конструкции.

4. Использование аутологичных фибробластов кожи кроликов по сравнению с аллогенными донорскими фибробластами в составе биокератопротезного комплекса на основе кросслинкинг-модифицированной донорской кроличьей роговицы способствует более выраженному формированию соединительной ткани вокруг опорной пластинки кератопротеза, пролиферации фибробластов в строме имплантата за счет более длительной продолжительности жизни вводимых клеточных элементов (более 3-х месяцев в эксперименте) и неоваскуляризации, что обеспечивает надежность приживления биокератопротезной конструкции у реципиента.

5. Выявленное интенсивное формирование бельма и новообразованных сосудов в группе кроликов с имплантированным в строму биокератопротезным комплексом на основе аутологичных фибробластов кожи свидетельствует о выраженных репаративных процессах в зоне введения имплантата, способствующих надежному приживлению кератопротезной конструкции и профилактики развития специфических осложнений.

Для конструирования биокератопротезного комплекса рекомендуется использовать: 1) консервированные кросслинкинг-модифицированные аллогенные донорские роговицы с низкими морфофункциональными показателями – 1 А-0 (классификация С.А., Борзенка 2008), представляющие собой каркас с повышенными биомеханическими свойствами; 2) культивированные аутологичные ФБ кожи, способствующие более выраженному развитию соединительной ткани и васкуляризации вокруг опорной пластинки кератопротеза; 3) желатиновые микроносители в качестве инертного и невидоспецифического трехмерного матрикса для культивированных клеточных элементов; 4) кератопротез, изготовленный из прочного, инертного и биосовместимого материала (н/р: титан).

Кератопротезирование с использованием биокератопротезного комплекса может быть показано пациентам с осложненными и истонченными бельмами IV-V категории при функциональной сохранности сетчатки и зрительного нерва.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Шипунова А.В., Борзенок С.А., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Комах Ю.А., Мороз З.И., Ковшун Е.В., Волкова О.С., Тонаева Х.Д., Ролик О.И. Технология конструирования биокератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов кожи реципиента // Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии: Сб. тез. - СПб., 2010. - С.143.

2. Шипунова А.В., Борзенок С.А., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Комах Ю.А., Мороз З.И., Ковшун Е.В., Волкова О.С., Тонаева Х.Д., Ролик О.И. Биоинженерная конструкция кератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов реципиента // Актуальные проблемы офтальмологии Всерос. науч. конф. молодых ученых, 5-я: Сб. науч. ст. - М., 2010.- С.236.

3. Борзенок С.А., Васильев А.В., Шипунова А.В., Дашинимаев Э.Б, Комах Ю.А., Ковшун Е.В. Результаты конструирования биокератопротезного комплекса с использованием аутофибробластов кожи реципиента // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.- 2010.-Т.5, № 3. - С.17.

4. Шипунова А.В., Борзенок С.А., Комах Ю.А., Мороз З.И., Ковшун Е.В., Онищенко Н.А., Васильев А.В., Дашинимаев Э.Б. Экспериментальные результаты конструирования биокератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов кожи // Материалы 5-го Всероссийского съезда трансплантологов. - опуб. в журнале Вестник трансплантологии и искусственных органов. - Приложение.-2010. - Т. XII. - С. 239.

5. Шипунова А.В., Борзенок С.А., Васильев А.В., Дашинимаев Э.Б, Комах Ю.А., Ковшун Е.В., Волкова О.С. Предварительные результаты конструирования биокератопротезного комплекса с использованием аутофибробластов кожи реципиента // Всерос. науч. школа-конф. «Стволовые клетки и регенеративная медицина: Сб. тез.- М., 2010. - С.88-89.

6. Borzenok S., Shipunova A., Komakh Y., Moroz Z., Kovshun E., Volkova O., Vasilyev A., Dashinimaev E. Bioengineering of biokeratoprosthesis complex // Annual Meeting of the EEBA-23-th. Abstracts. – Freiburg. – 2011. – P. 88.

7. Борзенок С.А., Васильев А.В., Шипунова А.В., Дашинимаев Э.Б., Мороз З.И., Комах Ю.А., Ковшун Е.В. Новый тип тканеинженерной конструкции кератопротеза на основе аллогенной модифицированной донорской роговицы и культивированных фибробластов кожи человека // Вестник трансплантологии и искусственных органов. – 2011. - №3. - С.67-72.

8. Борзенок С.А., Васильев А.В., Шипунова А.В., Дашинимаев Э.Б., Мороз З.И., Комах Ю.А., Ковшун Е.В. Тканеинженерная конструкция биокератопротезного комплекса // Вестник Оренбургского государственного университета.- 2011. - №14 (133) – ноябрь,- С. 75-78.

9. Шипунова А.В., Борзенок С.А., Тахчиди Х.П., Комах Ю.А., Васильев А.В., Дашинимаев Э.Б. Биоинжиниринг кератопротезных систем // Филатовские чтения: Материалы научно-практ. конф. – Одесса, 2011.- С.193-194.

10. Борзенок С.А., Васильев А.В., Мороз З.И., Шипунова А.В., Дашинимаев Э.Б., Комах Ю.А., Ковшун Е.В. Биокератопротезирование как проблема клеточной биологии и регенеративной медицины // Федоровские чтения: Всерос. науч. конф. с межд. уч., 9-я: Сб. науч. работ - М., 2011.- С. 251-252.

11. Shipunova A., Borzenok S., Komakh Y., Moroz Z., Kovshun E., Vasilyev A., Dashinimaev E. New biokeratoprosthetic complex // EuCornea Congress – 2nd: http://www.eucornea.org/Vienna11/posters-details.asp?id=12431 [Электронный ресурс].

12. Шипунова А.В., Борзенок С.А., Васильев А.В., Дашинимаев Э.Б. Клеточно-биоматриксная конструкция биокератопротезного комплекса // Актуальные вопросы офтальмологии: Сб. науч. тезисов. – Краснодар, 2011. – С. 62.

13. Шипунова А.В., Борзенок С.А., Васильев А.В., Дашинимаев Э.Б., Мороз З.И., Ковшун Е.В., Комах Ю.А., Шацких А.В. Моделирование на экспериментальных животных имплантации конструкции биокератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов кожи // Филатовские чтения: Материалы научно-практ. конф. – Одесса, 2012. - С.187-188.

14. Борзенок С.А., Шипунова А.В., Комах Ю.А., Мороз З.И., Васильев А.В., Дашинимаев Э.Б., Шацких А.В., Ковшун Е.В., Моделирование имплантации конструкции биокератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов кожи. Исследование in vivo // Федоровские чтения: Всерос. науч. конф. с межд. уч. 10-я: Сб. науч. работ - М., 2012. - С. 134-135.

15. Борзенок С.А., Шипунова А.В., Васильев А.В., Дашинимаев Э.Б., Шацких А.В., Мороз З.И., Ковшун Е.В., Комах Ю.А. Конструирование биокератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов кожи // Офтальмохирургия. – 2012. - № 2. - С. 72-77.

16. Борзенок С.А., Шипунова А.В., Васильев А.В., Дашинимаев Э.Б. Результаты моделирования имплантации биокератопротезного комплекса в эксперименте // Материалы 6-го Всероссийского съезда трансплантологов. - опуб. в журнале Вестник трансплантологии и искусственных органов. - Приложение. - 2012.- Т.XIV., С. 306.

1. Тахчиди Х.П., Борзенок С.А., Малюгин Б.Э., Васильев А.В., Шипунова А.В., Дашинимаев Э. Б., Мороз З.И., Ковшун Е. В., Комах Ю.А., Волкова О.С. «Способ кератопротезирования сосудистых осложненных бельм с помощью биокератопротезного комплекса». Патент РФ на изобретение № 2010138160 от 06.10.2011

С 2007 по 2009 год проходила обучение в клинической ординатуре по специальности «офтальмология» на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. С 2009 по 2012 год обучалась в очной аспирантуре на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Является автором 21-й печатной работы, 1-го патента на изобретение.