Министерство здравоохранения республики беларусь

2. Хранение и доставка биологического материала

Транспортировка клинического материала должно осуществляться в специальных термоконтейнерах с охлаждающими элементами или термосах со льдом в течение 1 суток. Каждый образец, для исключения взаимной контаминации, хранят и транспортируют в отдельном полиэтиленовом пакете.

2.1. Выделение ДНК из биологического материала, амплификацию ДНК Chlamydia trachomatis, электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводят с использованием комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя на имеющемся в диагностической лаборатории оборудовании для проведения полимеразной цепной реакции.

2.2. Для проведения количественного ПЦР исследования по оценке относительной концентрации ДНК Chlamydia trachomatis следует провести амплификацию 2-кратного титрования ДНК-стандарта криптической плазмиды Chlamydia trachomatis в диапазоне от 1,5х10⁴ до 500 копий/мл для построения стандартной кривой. Каждую из ДНК концентраций проамплифицировать в дублях. Также проамплифицировать два контрольных отрицательных образца, реактив которых состоит из сложной ДНК амплификационной смеси, где мишень ДНК-стандарта заменяется водой. Корреляции между значение цикла, при котором пороговая линия и кривая амплификации пересекаются и log10 концентрации копий ДНК криптической плазмиды Chlamydia trachomatis в мл должна составлять не менее 0,9.
Третий этап - постаналитический

3.1 Идентификацию результатов электрофоретического разделения ДНК Chlamydia trachomatis осуществлять по следующим критериям:

- выявление в исследуемых биологических пробах специфического ПЦР – продукта Chlamydia trachomatis;

- соответствие размера ДНК-продукта в клиническом образце размеру ДНК-продукта Chlamydia trachomatis контрольной пробы;

- соответствие молекулярной массы ДНК-продукта в клиническом образце размеру ДНК-продукта Chlamydia trachomatis контрольной пробы;

- соответствие интенсивности свечения ДНК-продукта в клиническом образце размеру ДНК-продукта Chlamydia trachomatis контрольной пробы.

При анализе биологические пробы считать положительными на наличие ДНК Chlamydia trachomatis, если:

• 
  молекулярные характеристики ДНК-продукта в клиническом образце соответствуют молекулярным характеристикам ДНК-продукта Chlamydia trachomatis контрольной пробы.
  

• 
  в пробе, содержащей клинический образец, специфических ДНК-продуктов не обнаружено или он выявлен, но его молекулярные характеристики ДНК не соответствуют молекулярным характеристикам фрагмента молекулы контрольной ДНК Chlamydia trachomatis.
  

- образец считать положительным, если по каналу детекции специфического фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis для него определяется значение порогового цикла, не превышающее пороговый уровень (см.инструкцию производителя);

- образец считать отрицательным, если по каналу детекции специфического фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis для него не определяется значение порогового цикла (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), по каналу детекции фрагмента ДНК внутреннего контроля для него определяется значение порогового цикла, не превышающее пороговый уровень (см. инструкцию производителя).

- образцы, для которых отсутствует значение порогового цикла как по каналу детекции специфического фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis, так и по каналу фрагмента ДНК внутреннего контроля или получено значение порогового цикла более указанного производителем, требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае если повторно получается аналогичный результат, требуется повторить анализ образца, начиная с этапа выделения.

3.3. Идентификацию результатов количественного ПЦР исследования по оценке относительной концентрации ДНК Chlamydia trachomatis следует осуществлять следующим образом:

3.3.1. Построить стандартную кривую корреляции между значение порогового цикла (СТ) и log10 концентрации копий ДНК-стандарта криптической плазмиды Chlamydia trachomatis (рис.1).

3.3.2. Вычислить значения относительной концентрации ДНК Chlamydia trachomatis в исследуемых биологических образцах по формуле: концентрация =10 ^{(-0,297xСT+13,819).}

Рис. 1. Стандартная кривая корреляции между СT и log10 концентрации копий ДНК-стандарта криптической плазмиды Chlamydia trachomatis.

3.3.3. Диагностически значимой относительной концентрацией ДНК криптической плазмиды Chlamydia trachomatis следует считать интервал от 1,5х10⁴ до 469 копий/мл, которая является основанием для установления этиологического фактора развития инфекционного процесса урогенитального тракта и назначения адекватного этиотропного лечения.

3.3.4. При относительной концентрации ДНК криптической плазмиды Chlamydia trachomatis 100-468 копий/мл и сомнительных результатах ИФА и ПИФ следует провести культуральные исследования для подтверждения/опровержения хламидиоза. В случае подтверждения диагноза следует начать этиотропную терапию, в случае опровержения рекомендуется динамическое наблюдение у гинеколога, уролога, дерматовенеролога с последующим проведением исследований через 3 мес.

3.3.5 Выявление ДНК криптической плазмиды Chlamydia trachomatis в высоких относительных концентрациях в 1,51х10⁴ – 4,7х10⁷ копий/мл независимо от результатов ИФА и ПИФ требует незамедлительного назначения этиотропной и иммунокорригирующей терапии.

ПЕРЕЧЕНЬ ВОЗМОЖНЫХ ОШИБОК ПРИ ВЫПОЛНЕНИИ И ПУТИ ИХ УСТРАНЕНИЯ:

1. Попадание крови и большого количества слизи, выделений в пробирку с биологическим материалом. Для устранения необходимо стерильным марлевым тампоном с влагалищной поверхности шейки матки и уретры снять слизь и влагалищные выделения. При взятии биологического материала нельзя прилагать физические усилия.

2. Несоблюдение стерильных условий на преаналитическом этапе. Манипуляция взятия биологического материала должна проводиться в стерильных перчатках, стерильным тампоном.

3. Использование многоразового медицинского инструментария. Забор материала произвести отдельными одноразовыми, стерильными зондами.

4. Неправильный выбор места и вида биологического материала для исследования неадекватно очагу поражения.

5. Не соблюдение условий транспортировки пробирок с биологическим материалом при температуре внешней среды без контейнеров или термосов с охлаждающимися элементами. Транспортировка проб должна осуществляться в термосах со льдом или термоконтейнерах с охлаждающимися элементами. Каждый образец, для исключения взаимной контаминации, хранят и транспортируют в отдельном полиэтиленовом пакете.

6. Нарушение сроков хранения пробирок с биологическим материалом. Пробирки с биологическим материалом должны быть доставлены в течение 2-х часов в ПЦР-лабораторию. Полученные пробы (соскобы эпителиальных клеток) могут храниться при температуре 2-8 ^оС в течение 2 дней. При необходимости более длительного хранения соскобы замораживают при –20 ^оС и хранят в течение 1 недели. Если необходимо хранить пробы еще более длительный срок, их замораживают при температуре –70 ^оС. Замораживание образцов с ликвором, спермой, мочой и венозной кровью. Замораживание образцов с ликвором, спермой, мочой и венозной кровью не допускается.

7. Несоблюдение технологии удаления супернатанта – захват осадка, содержащего ДНК на аналитическом этапе выделения ДНК.

8. Повторное использование отработанных наконечников. Обязательно менять наконечники при переходе от пробы к пробе, желательно использовать наконечники с фильтром - аэрозольным барьером для предотвращения попадания микрокапель раствора в пипетку. Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываться в специальные контейнеры или емкости, содержащие дезинфицирующий раствор (1 Н соляная кислота, 10% гипохлорит натрия или 10% хлорная известь).

9. Несоблюдение последовательности раскапывания опытных и контрольных пробирок. Вначале следует раскапать отрицательный контрольный образец, затем исследуемые пробы, в конце положительный контрольный образец.

10. Несоблюдение технологии использования отработанных наконечников и пробирок. Обязательно менять наконечники при переходе от пробы к пробе, желательно использовать наконечники с фильтром - аэрозольным барьером для предотвращения попадания микрокапель раствора в пипетку. Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываться в специальные контейнеры или емкости, содержащие дезинфицирующий раствор (1 Н соляная кислота, 10% гипохлорит натрия или 10% хлорная известь).

11. Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем выделения ДНК может свидетельствовать о неэффективном выделении ДНК. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз, и при вторичном отсутствии положительного сигнала в пробе с положительным контролем выделения ДНК необходимо повторно выделить ДНК и провести ПЦР.

12. Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР (К+) может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации, неверно приготовленной верхней ПЦР-смеси, а также других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В этом случае необходимо провести ПЦР еще раз.

13. Использование трансиллюминатора со слабыми флюоресцентными лампами. Лампы менять необходимо 1 раз в 3 года при их использовании 5 часов в неделю.

14. Неправильное формирование карманов на планшетке с агарозным гелем, когда происходит совмещение близрасположенных карманов и подтекание амплификата.

15. Неправильное размещение планшетки в камере для электрофореза. Планшетку необходимо располагать от катода к аноду, т.е. от “-” или черного электрода к “+” или к красному электроду.

16. Появление любого значения порогового цикла в таблице результатов для отрицательного контрольного образца свидетельствует о наличии контаминации реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.

17. При значении коэффициента корреляции менее 0,9 необходима перестановка всех проб, начиная с первого этапа анализа.

Приложение

Диагностический алгоритм исследований при урогенитальном хламидиозе.