Ультраструктурная и молекулярно-генетическая характеристика сперматозоидов у пациентов с астенозоос­­­­пермией 03. 03. 04- клеточная биология, цитология, гистология

Хаят Сабина Шаукатовна

03.03.04– клеточная биология, цитология, гистология

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук
МОСКВА – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Курило Любовь Федоровна

Болтовская Марина Николаевна

доктор медицинских наук,

врач клинической лабораторной диагностики ГБУЗ города Москвы "ГКБ № 14 им. В.Г.Короленко Департамента здравоохранения  города Москвы" Бочарова Елена Николаевна

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Михайлова Лилия Петровна

Причинами бесплодия у мужчин могут являться функциональная неполноценность сперматозоидов. Нарушение функциональных свойств сперматозоидов при традиционном светооптическом исследовании в ряде случаев выявить невозможно. Для определения различных структурных параметров сперматозоидов может быть применен метод ультраструктурного анализа. Этот подход позволяет выявить особенности органоидов сперматозоидов – состояние акросомы, компактизации хроматина, строение жгутика и его компонентов, состояние и функционирование митохондрий, центриолей.

Внедрение методов молекулярной биологии в изучение генома человека позволило накопить информацию о различных генетических дефектах, приводящих к нарушениям характеристик сперматогенеза. За последние несколько лет были не только картированы некоторые гены, продукты экспрессии которых влияют на развитие и функции гамет, гонад и других органов половой системы, но и описаны мутации этих генов. Это позволило в настоящее время четко идентифицировать причину некоторых форм нарушения центральных звеньев эндокринной регуляции и определить влияние этих мутаций на процессы стероидо- и гаметогенеза в гонадах, морфогенеза органов половой системы (Черных, Курило, 2001; Wilson, Davies, 2007).

Цель исследования - изучить ультраструктурные и молекулярно-генетические нарушения двигательной активности сперматозоидов на репрезентативной выборке пациентов с астенозооспермией.

Для достижения поставленной цели исследования были сформулированы следующие задачи:

1. 
   Проанализировать вклад астенозооспермии в структуру патозооспермии на репрезентативной выборке пациентов.
   
2. 
   Выявить особенности ультраструктуры жгутика сперматозоида и его компонентов у пациентов при астенозооспермии и бесплодии.
   
3. 
   Исследовать возможные сочетания нарушений ультраструктур сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией и бесплодием.
   
4. 
   Определить, имеется ли взаимосвязь между такими параметрами спермограммы, как подвижность сперматозоидов и наличие повреждений ДНК (одно- и двунитевые разрывы ДНК).
   
5. 
   Провести исследование состава незрелых половых клеток из эякулята на разных стадиях их развития в группе мужчин с астенозооспермией и бесплодием.
   
6. 
   Определить роль наиболее распространенных мутаций митохондриальной ДНК на репрезентативной выборке пациентов с астенозооспермией, провести сравнительный анализ частоты и спектра мутаций митохондриальной ДНК сперматозоидов во фракциях с различными параметрами подвижности сперматозоидов.
   
7. 
   Изучить характер возможных перестроек гена GAPDHS, экспрессирующего спермоспецифичную изоформу глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, одного из ферментов гликолиза.
   
8. 
   Расширить протокол комплексного медико-генетического обследования пациентов с астенозооспермией и бесплодием.
   

Впервые на репрезентативной выборке российских пациентов установлено, что снижение подвижности сперматозоидов (астенозооспермия, астенотератозооспермия, олигоастенозооспермия, олигоастенотератозооспермия) вносит ведущий вклад (93%) в структуру патозооспермии. Анализ результатов статистической обработки показал, что структура астенозооспермии неоднородна: в 70 % случаев она сочетана с тератозооспермией, олигоастенотератозооспермия составляет 26% , олигоастенозооспермия - 0,25%, астенозооспермия встречается лишь 4% обследованных.

Количественный кариологический анализ соотношения незрелых половых клеток на разных стадиях их развития из эякулята впервые позволил выявить блок сперматогенеза на стадиях прелептотены-лептотены-зиготены у большинства пациентов с астенозооспермией, сопровождающейся полизооспермией. Также выявили повышенное количество незрелых половых клеток с признаками дегенерации и нарушением анафазы 1 и 2 делений мейоза.

Выявлено отсутствие ассоциации астенозооспермии и нарушений структуры хроматина и целостности ДНК.

При исследовании ультраструктурных основ нарушения двигательной активности сперматозоидов показано, что морфологические аномалии затрагивают различные компоненты жгутиков сперматозоидов – аксонему (центральные и периферические микротрубочки, динеиновые ручки), наружные плотные фибриллы, фиброзный слой.

У всех исследованных пациентов с дисплазией фиброзного слоя впервые обнаружен полиморфизм в гене GAPDHS - замена аденина на гуанин rs29381 (660-22 G>A) в гетерозиготном состоянии.

В работе расширена схема протокола комплексного медико-генетического обследования пациента с астенозооспермией неясного генеза. Полученные новые данные об особенностях нарушения ультрастуктуры сперматозоида у пациентов с астенозооспермией, проясняющие патогенез астенозооспермии, а также полученные данные о полиморфизме в гене GAPDHS у пациентов с астенозооспермией и дисплазией фиброзного слоя открывают возможности для оптимизации диагностики пациентов с астенозооспермией. Полученные данные важны для понимания ультраструктурных и молекулярно-генетических механизмов патогенеза астенозооспермии. Выявленное отсутствие ассоциации между количеством сперматозоидов с нарушением целостности ДНК и низкой подвижностью сперматозоидов расширяют современные представления о роли одно- и двунитевых разрывов ДНК сперматозоидов в этиологии астенозооспермии.

Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников (урологов-андрологов, акушеров-гинекологов, медицинских генетиков).
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в работу лаборатории генетики нарушений репродукции Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический генетический научный центр» Российской академии медицинских наук. В практикеу лаборатории внедрен расширенный протокол комплексного медико-генетического обследования, включающий обязательное проведение электронно-микроскопического анализа ультраструктур сперматозоидов, цитогенетического исследования и молекулярно-генетического анализа гена GAPDHS для пациентов с анастенозооспермией неясного генеза.
Основные положения, выносимые на защиту

1. 
   Астенозооспермия, одна из самых распространенных форм патозооспермии, имеет неоднородную структуру и в 70% случаев сочетана с тератозооспермией, астенозооспермия, несочетанная с другими формами патозооспермии встречается у 4% обследованных. Это свидетельствует о различных механизмах, приводящих к нарушению важной функции – нарушению двигательной активности сперматозоидов.
   
2. 
   Количественный анализ структуры сперматозоидов показывает, что морфологические аномалии затрагивают различные компоненты – акросому, митохондрии, микротрубочки аксонемы, динеиновые ручки, наружные плотные фибриллы, фиброзный слой.
   
3. 
   Распространенная делеция мтДНК 4977 не имеет клинической значимости для пациентов с астенозооспермией, данная протяженная делеция была обнаружена нами в образцах эякулята у обследованных пациентов с астенозооспермией и в контрольной группе примерно с равной частотой.
   
4. 
   У пациентов с тотальной астенозооспермией и дисплазией фиброзного слоя в гене GAPDHS кодирующего фермент ГАФДс впервые обнаружили полиморфизм, rs29381 (660-22 G>A) в гетерозиготном состоянии.
   

Результаты данной работы были представлены на Ежегодных российских научно-образовательных форумах "Мужское здоровье и долголетие" в 2009 и 2010 (г. Москва); 4th Utah-Florence Symposium on the Genetics of Male Infertility 2010 (Park City, USA); 16-th European Workshop on Molecular and Cellular Endocrinology of the Testis 2010 (Elba, Italy); VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 (г. Ростов-на-Дону); European Human Genetics Conference, 2010 (Gothenburg, Sweden); 26-м съезде European Society of human reproduction and embriology 2010 (Rome, Italy); 20-th World Congress on Fertility and sterility 2010 (Munich, Germany) (5-м Международном конгрессе Всемирной ассоциации по репродуктивной медицине в 2010 (г. Москва); American Society of Human Genetics Annual Meeting 2010 (Washington, USA); Ежегодной конференции молодых ученых Медико-генетического научного центра РАМН в 2010 и 2011 (г. Москва). Основные результаты работы доложены на межлабораторном научном семинаре Медико-генетического научного центра РАМН (декабрь, 2011).

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Спермиологический анализ эякулята выполняли по методу, рекомендованному ВОЗ, использовали нормативные значения для оценки показателей спермограммы (WHO, 1999). По результатам спермиологического анализа и классификации вариантов патозооспермии, пациентов относили к одной из шести групп, по рекомендации ВОЗ (WHO, 1999) (нормозооспермия, олигозооспермия, азооспермия, аспермия, астенозооспермия, тератозооспермия)

Для проведения количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов препараты фиксировали 2,5%-ным раствором глютарового альдегида на какодилатном буфере (рН 7,2-7,4) и обрабатывали по описанной Е.Е. Брагиной (2002) методике. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме UltraCutIII (Reichert), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали в электронном микроскопе HU11 B.

Строение головок сперматозоидов оценивали на продольных срезах, строение жгутиков – на строго поперечных срезах. Проводили оценку состояния различных органоидов сперматозоидов по следующим параметрам: количество ядер; наличие акросомы; размер, положение акросомы относительно ядра, консистенция акросомы; форма ядра и состояние хроматина (степень конденсации, наличие вакуолей, наличие процессов деградации); наличие и положение цитоплазматической капли; структура аксонемы жгутиков сперматозоидов (количество и расположение периферических и центрального дуплетов микротрубочек, наличие или отсутствие динеиновых ручек); структура и расположение периаксонемных структур: митохондрий, наружных плотных фибрилл, фиброзного слоя; структура центриоли.

Каждый сперматозоид оценивали по вышеуказанным параметрам, после чего проводили подсчет (в процентах) содержания сперматозоидов с определенными формами аномалий. За референсные значения содержания сперматозоидов с различными нарушениями структуры принимали соответствующие значения параметров сперматозоидов в группе фертильных мужчин.

Наличие незрелых половых клеток из эякулята и их состав по стадиям развития оценивали по методу Л.Ф. Курило, патент на изобретение №2328736 (2007).

Из клеток осадка эякулята готовили ядра клеток на суховоздушных препаратах. После окрашивания красителем Гимза проводили подсчет ядер НПК на разных стадиях сперматогенеза и вычисляли долю клеток каждой из стадии от общего числа подсчитанных клеток. Подсчитывали 200-300 НПК, параллельно отмечали и другие типы клеток – сперматозоиды, эпителиальные клетки и лимфоциты.

Цитогенетическтий анализ лимфоцитов периферической крови в группе пациентов с астенозооспермией, сопровождающейся полизооспермией.

Цитогенетическое исследование проводили на препаратах метафазных хромосом лимфоцитов периферической крови, культивируемых in vitro в соответствии со стандартной методикой (Hungerford, 1965). GTG-дифференциальное окрашивание хромосом выполняли согласно общепринятому методу (Seabright, 1971) в модификации (Захаров и др., 1982). Отбор метафазных пластинок и анализ хромосом осуществляли согласно общепринятым критериям (Кулешов, 1991).

Выделение геномной ДНК сперматозоидов из эякулята выполняли с помощью набора реагентов для выделения ДНК Diatom^TM DNA Prep 220 в соответствии с протоколом производителя. Детекцию делеции 4977 митохондриальной ДНК (мтДНК) проводили методом гнездовой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью праймеров предложенных ранее (Kao, 1995).

Идентификацию точковой мутации мтДНК A3243G проводили методом ПЦР/ПДРФ с использованием эндонуклеазы рестрикции AvaI.

Результаты амплификации оценивали путем проведения вертикального электрофореза в полиакриламидных гелях с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия.

Исследование образцов ДНК на наличие вариантов в гене GAPDHS проводили методом ПЦР с последующем определением последовательности нуклеотидов на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 (Applied Biosystems).

Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов

Фрагментацию ДНК определяли методом TUNEL на мазках эякулята. Мазки спермы наносили на адгезивные стекла (Histo Bond) и обрабатывали по протоколу фирмы-изготовителя (DeadEnd^TM Fluorometric TUNEL System, PROMEGA). Препараты окрашивали DAPI (4,6-diamino-2-phenylidole, Sigma) для специфической окраски ДНК. Просмотр осуществляли с помощью микроскопа Axiovert 200V (Carl Zeiss).

Для расчета вероятности сочетания астенозооспермии с другими формами патозооспермии, мы использовали формулу условной вероятности: - Условная вероятность обнаружить пациента с нарушениями в спермограмме в сочетании с астенозооспермией.

Для исследования ассоциации между показателями традиционного спермиологического исследования и показателями количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов мы использовали программный пакет Microsoft Excel и его встроенные функции обработки статистических данных.

При нормальном распределении выборки для парных сравнений использовался t-критерий Стьюдента. Достоверными считались различия при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение

Оценка вклада астенозооспермии в структуру патозооспермии

С декабря 2006 по декабрь 2010 года в лаборатории генетики нарушений репродукции МГНЦ РАМН было обследовано 9215 пациентов с проблемами репродукции. Проведенные на этой выборке клинические и спермиологические исследования демонстрируют, что значительный вклад (8563 мужчин - 93%) в структуру патозооспермии вносят случаи снижения подвижности сперматозоидов (астенозооспермия, астенотератозооспермия, олигоастенозооспермия, олигоастенотератозооспермия) (рис. 1).

Рис. 1. Структура группы пациентов со сниженной подвижностью сперматозоидов

Такая гетерогенность диктует необходимость поиска новых маркеров для изучения пациентов с различными формами астенозооспермии.

Результаты спермиологического исследования	Число пациентов	Доля, %
Нормозооспермия	131	1,42
Азооспермия	330	3,58
Астенозооспермия	270	2,93
Астенотератозооспермия	6074	65,91
Олигозооспермия	79	0,86
Олигоастенозооспермия	19	0,21
Олигоастенотератозооспермия	2200	23,87
Олиготератозооспермия	6	0,07
Тератозооспермия	106	1,15

В рамках данной работы отдельно была изучена группа пациентов с нарушением подвижности сперматозоидов при их высокой концентрации (полизооспермия, состояние, при котором концентрация сперматозоидов в 1 мл превышает 120 млн). Полизооспермия была нами выбрана вследствие того, что эта форма патозооспермии характеризуется значительным повышением концентрации сперматозоидов, снижением их подвижности и большим числом лейкоцитов, при отсутствии бактериальной микрофлоры в эякуляте. Поэтому мы считали целесообразным проанализировать ассоциацию случаев повышения концентрации сперматозоидов и их подвижности.

Важно отметить, что полизооспермию наблюдали у 965 пациентов, а это составляет 10,5% случаев от общего количества обследованных мужчин за 4 года (2006-2010гг.). Пациенты с астенозооспермией и астенотератозооспермией составляли 76% случаев в группе пациентов с полизооспермией.

У 11 пациентов с астенозооспермией, сопровождающейся полизооспермией, мы провели цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови. У всех обследованных определен нормальный мужской кариотип 46,ХУ. У одного из пациентов родился мальчик с дисомией по хромосоме У (кариотип 47, ХУУ).

Мы провели многостадийный, с использованием ряда количественных критериев оценки состояния НПК из эякулята по стадиям их развития (Курило Л.Ф., патент на изобретение №2328736, 2007), анализ у 20 пациентов с астенозооспермией, сопровождающейся полизооспермией. Число незрелых половых клеток (округлых, по определению ряда исследователей) в 15 из 20 случаев полизооспермии было повышено.

При количественном анализе НПК - состава сперматоцитов 1 на разных стадиях профазы 1 мейоза, сперматоцитов 2 и сперматид, нарушения деления сперматид и дегенеративных форм (из эякулята) в 16 случаях из 20 исследованных выявлен блок на стадиях от прелептотены до зиготены профазы 1 мейоза, в 1 случае установлен блок и на стадии пахитены (1,4%, в контроле - 0,45%), по-видимому, поэтому у данного пациента индекс сперматоцитов 2 и сперматид был значительно снижен. У 16 из 20 пациентов был повышен индекс неидентифицируемых половых клеток (по стадиям профазы 1), вследствие дегенеративных изменений в ядрах. В 10 из 20 случаев отмечено повышенное число случаев нерасхождения сперматид в делениях мейоза.

Таким образом, несмотря на блок сперматогенеза на стадиях прелептотены-лептотены-зиготены (у большинства пациентов с астенозооспермией, сопровождающейся полизооспермией) и повышенного количества НПК с признаками дегенерации, а также - с нарушением анафазы 1 и 2 делений мейоза (неразошедшиеся сперматиды у половины исследуемых по НПК случаев), у этих пациентов концентрация сперматозоидов значительно превышала норму. Естественно, используемые нами количественные критерии оценки состояния НПК на разных стадиях мейоза свидетельствуют о физиологической селекции длительного и многостадийного процесса сперматогенеза.

Ультраструктурное исследование сперматозоидов пациентов с астенозооспермией

Для ультраструктурного исследования выборка пациентов с астенозооспермией составила 86 мужчин, группа контроля – 62 мужчины. Популяция сперматозоидов человека гетерогенна, наряду со сперматозоидами нормального строения в эякуляте фертильных мужчин выявляются разнообразные формы с патологией акросомы, укладкой хроматина, с различными формами аномалии ультраструктуры жгутика (аксонемы и периаксонемных структур, отсутствие динеиновых ручек).

Однако у фертильных мужчин доля патологически измененных сперматозоидов не превышает определенной величины. Bartoov и соавт. (1994), Бочарова и соавт. (2007) приводят данные количественного ультраструктурного исследования пациентов фертильной группы. Эти показатели мы брали как референсные значения при оценке эякулята пациентов с патозооспермией (табл.2).

При количественном электронно-микроскопическом исследовании эякулята пациентов с астенозооспермией показано, что наряду с ожидаемыми аномалиями структуры аксонемы жгутиков и периаксонемных структур у этих пациентов обнаруживали аномалии структуры головки. Из 86 исследованных пациентов с астенозооспермией у 64 - повышено число сперматозоидов с измененным положением акросомы. У 62 человек повышено число сперматозоидов с прореагировавшей акросомой, у 2 пациентов – повышено содержание сперматозоидов с аномальной морфологией акросомы, у 24 человек - повышено число сперматозоидов с незрелым хроматином.

Электронно-микроскопическое исследование ультрастуктур сперматозоидов	Референсные значения
Нормальные акросомы	Не менее 40%
Деградация акросом	Не более 20%
Незрелый хроматин	Не более 30%
Нормальный жгутик	Не менее 80%
Нормальные митохондрии	Не менее 80%
Нормальная аксонема	Не менее 70%
Дисплазия фиброзного слоя	Не более 10%
Аномалиия наружных плотных фибрилл	Не более 20%

В таблице 3 представлен сравнительный анализ различных параметров структуры сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией и у пациентов с нарушенной фертильностью, но с нормальными показателями подвижности. Изменение формы акросомы выявлено в 11 раз чаще у пациентов, в эякуляте которых определена нормальная подвижность сперматозоидов, что свидетельствует о том, что этот параметр является фактором инфертильности. В то же время у пациентов с астенозооспермией нарушение положения акросомы и прореагировавшая акросома ассоциированы с нарушением подвижности.

Повышенное число сперматозоидов с измененным положением акросомы у пациентов с астенозооспермией обнаружено в 1,5 раза чаще, чем у пациентов с нормальной подвижностью. Изменение положения акросомы, выявленное у 64 пациентов, сочетается с наличием цитоплазматической капли на головке и нерегулярной укладкой митохондрий в 15.6 % случаев.

Нормальное расположение акросомы формируется в процессе спермиогенеза и связано с правильным функционированием цитоскелетных структур сперматозоидов – формированием микротрубочковой манжетки (Kierszenbaum, Tres, 2004). Возможно, у пациентов с астенозооспермией имеет место нарушение функций микротрубочкового аппарата, который, как известно, составляет основу аксонемы.

Подвижность сперматозоидов определяется структурой жгутика – аксонемы и периаксонемных структур. На рис. 2 представлены поперечные и продольные срезы через средний и основной отделы жгутика сперматозоида нормальной морфологии. Количественный анализ структуры жгутиков сперматозоидов показывает, что морфологические аномалии затрагивают различные компоненты жгутиков сперматозоидов – аксонему, наружные плотные фибриллы, фиброзный слой (рис.3-5). Из 86 обследованных пациентов с астенозооспермией у 4 человек содержалось более 50% сперматозоидов с дисплазией фиброзного слоя, у 10 обратившихся повышено содержание сперматозоидов со сдвинутыми плотными фибриллами. Подобные аномалии могут встречаться у фертильных пациентов, однако значительные нарушения подвижности большого числа сперматозоидов ассоциированы со структурными дефектами аксонемы жгутиков всех сперматозоидов или их большей части. Из 86 обследованных пациентов с астенозооспермией у 2 человек отсутствовала центральная пара микротрубочек аксонемы жгутика (9+0), у 12 (14%) пациентов повышено содержание сперматозоидов с нарушением строения пар периферических микротрубочек (5+2, 7+2 и т.д.), у 2 пациентов (2%) повышено содержание сперматозоидов с дезорганизацией строения пар микротрубочек.

У ряда пациентов отмечено сочетанное нарушение нескольких ультраструктурных компонентов жгутиков. Нарушение строения пар периферических микротрубочек, выявленное у 12 пациентов, сопровождается изменением положения акросомы (91.7% случаев), нерегулярной укладкой митохондрий (83.3% случаев), сдвигом наружных плотных фибрилл (67,7% случаев). При этом у 6 из 12 пациентов наблюдали все четыре формы ультраструктурной аномалии сперматозоидов - нарушение строения пар периферических микротрубочек, изменение положения акросомы, нерегулярная укладка митохондрий, сдвиг наружных плотных фибрилл.
Проведение количественного анализа морфологических аномалий аксонемы имеет прогностическое значение у пациентов с астенозооспермией (Ryder et al., 1990). В тех случаях, когда сперматозоиды с определенной атипией строения составляют большую часть клеток эякулята данного пациента, можно предполагать генетически обусловленные формы патозооспермии. При этом фенотип сперматозоидов не меняется со временем, не поддается терапевтической коррекции и сходен с атипией сперматозоидов других пациентов с аналогичными нарушениями фертильности, аномалии нередко носят семейный характер, имеется риск их наследования (Chemes, Rawe, 2003; Chemes, Rawe, 2010). Это необходимо учитывать при планировании программ вспомогательных репродуктивных технологий.

При неспецифических формах аномалии обнаруживается гетерогенная комбинация различных изменений, которые не носят семейного характера, корректируются терапевтическими методами (Chemes, 2000; Chemes, Rawe, 2003). Часто множественные аномалии головки и жгутиков представлены одновременно, их проявления могут варьировать у одного и того же пациента. Неспецифические аномалии жгутиков описаны в популяции фертильных и инфертильных мужчин (Wilton et al., 1985; Hunter et al., 1988; Chemes, 1993). Они могут быть представлены изменением количества или топографии структур аксонемы или наружных плотных фибрилл при сохранении нормальной морфологии жгутика в светооптическом микроскопе. Подобные изменения описаны в 70% случаев выраженной астенозооспермии (Williamson et al., 1984; Courtade et al., 1998).

У фертильных пациентов подобные аномалии не превышают 30%. Подобные неспецифические аномалии могут быть различной этиологии.

Гетерогенные нарушения строения аксонемы в отличие от генетически детерминированных, могут поддаваться терапевтической коррекции. Чаще всего лечение сводится к устранению факторов курения и неконтролируемого приема лекарственных препаратов.

Рис. 2. Поперечные срезы через жгутики сперматозоидов нормальной морфологии. Снизу – срез через средний отдел жгутика: аксонема 9+2 окружена наружными плотными

фибриллами (НФ) и митохондриями (М), вверху – срез через основные отделы жгутиков, аксонема окружена фиброзным слоем (ФС). ПМ – периферические дуплеты микротрубочек, ЦМ – центральная пара микротрубочек.

ФС

МТ

НФ

Рис. 3. Поперечный срез через жгутик с дезорганизацией микротрубочек аксонемы (МТ), наружных плотных фибрилл (НФ) и ассиметричным фиброзным слоем (ФС)

Рис. 4. Поперечные срезы через жгутики сперматозоидов с различными аномалиями структуры: НА – аксонема с уменьшенным количеством дуплетов микротрубочек (7+2), ДА – аксонема с сохранившимся фиброзным слоем и дезорганизацией микротрубочек, А – жгутики с нормальными аксонемами

Рис. 5. Поперечный срез через основной отдел жгутиков пациентов с абсолютной астенозооспермией. Отсутствует центральная пара микротрубочек аксонемы (9+0) (стрелка)

Митохондрии, сосредоточенные в среднем отделе жгутика сперматозоида, являются источниками энергии, необходимой для подвижности сперматозоидов. Пять комплексов дыхательной цепи митохондрий (КДЦ) выполняют важнейшую функцию – обеспечение энергией в виде молекул аденозинтрифосфата биохимических процессов, осуществляемых на клеточном уровне. 13 полипептидов КДЦ кодируются митохондриальной ДНК, и около 70 полипептидов – ядерными генами. Мутационное изменение пептидов, входящих в состав КДЦ, сопровождается снижением продукции энергии во всех типах клеток организма, что приводит к нарушению их функции.

Для анализа молекулярно-генетических причин снижения подвижности сперматозоидов нами были проведены исследования перестроек мтДНК. Обследовали 240 мужчин с бесплодием в браке. Критериями отбора пациентов являлось снижение подвижности сперматозоидов. Анализ на наличие делеции проводили с помощью «гнездовой» ПЦР. Делеция мтДНК 4977 была обнаружена нами в образцах эякулята у обследованных пациентов с астенозооспермией и в контрольной группе примерно с равной частотой, что соотносится с результатами, полученными в последние годы другими авторами (Ieremiadou, Rodakis, 2009). Это может быть связано с феноменом гетероплазмии, когда в одной митохондрии присутствуют популяции делетированных и интактных молекул мтДНК, при этом неизвестен порог их патогенности. Патогенность крупных делеций связывают прежде всего с утратой генов сразу нескольких тРНК, что приводит к нарушению трансляции практически всего митохондриального генома. Делеция 4977 приводит к потере около трети генетического материала митохондриальной ДНК. Так как подвижность сперматозоидов требует энергетических затрат, а делеция 4977 ведет к утрате нескольких необходимых генов, кодирующих субъединицы комплексов окислительного фосфорилирования, данную перестройку мтДНК исследовали у пациентов с нарушениями подвижности сперматозоидов. Литературные данные свидетельствуют о том, что в научных центрах разных стран у пациентов с астенозооспермией была продемонстрирована ассоциация наличия делеции митохондриальной ДНК 4977 со снижением подвижности сперматозоидов. (Dhillon, 2007; Kao, 1995). Мы впервые на репрезентативной выборке российских пациентов с астенозооспермией и доноров предприняли исследование по выявлению такой ассоциации.

Таким образом, распространенная делеция мтДНК 4977 не участвует в патогенезе астенозооспермии и не позволяет использовать метод выявления данной протяженной делеции в качестве достоверного патогенетического критерия астенозооспермии.

Следующим подходом к выявлению мутаций митохондриальной ДНК и анализу ассоциаций с астенозооспермией было изучение точковой замены A3243G в гене тРНК лейцина методом ПЦР-ПДРФ с использованием эндонуклеазы рестрикции AvaI. Эта перестройка не была выявлена ни в одном из изученных образцов. На основании этих результатов, мы предполагаем, что дефекты дыхательной цепи митохондрий, вызываемые точковой заменой A3243G в гене тРНК лейцина, не оказывают значительного влияния на подвижность сперматозоидов.

Таким образом, нами было выявлено отсутствие ассоциации между сниженной подвижностью сперматозоидов и наличием протяженной делеции митохондриальной ДНК4977, а также распространенной точковой заменой в митохондриальной ДНК A3243G

Учитывая наличие более 3 тысячи генов, контролирующих репродукцию человека (Matzuk, Lamb, 2008), можно предположить значительную долю генных мутаций в этиологии репродуктивных нарушений. Зависимость активности половых клеток не только от работы комплексов дыхательной цепи митохондрий, но и ферментов гликолиза обуславливает необходимость поиска новых генетических и биохимических маркеров.

Дисплазия фиброзного слоя жгутика – генетически обусловленное заболевание, проявляющееся на ультраструктурном уровне хаотичным расположением колонн и ребер фиброзного слоя в аксонеме, часто сочетается с отсутствием центральной пары микротрубочек аксонемы. Изучение генетической составляющей дисплазии фиброзного слоя (ДФС) продемонстрировало наличие целого комплекса генов-кандидатов, вовлеченных в патогенез дисплазии фиброзного слоя жгутика сперматозоида.

Одним из гликолитических ферментов является глицеральдегид—3-фосфат-дегидрогеназа (ГАФД), которая катализирует окислительное фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата. В нашей лаборатории разрабатываются подходы к изучению характера возможных перестроек гена GAPDHS, кодирующего сперматозоидную изоформу глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, одного из ферментов гликолиза.

Препараты тотальной ДНК, выделенной из сперматозоидов 5 пациентов с астенозооспермией и дисплазией фиброзного слоя жгутика сперматозоида, были доступны для молекулярно-генетического анализа. Провели секвенирование 5 экзонов гена GAPDHS. Полученная нуклеотидная последовательность в группе доноров совпадает с референсной, в то время как во всех образцах у пациентов с ДФС выявили полиморфизм rs29381 (660-22 G>A) в гетерозиготном состоянии. У пациентов с астенозооспермией и ДФС данная замена аденина на гуанин у пациентов с астенозооспермией описана нами в литературе впервые.

Таким образом, исследования, проведенные в нашей работе, показывают существование различия в референсной нуклеотидной последовательности гена GAPDHS у доноров и в пациентов с дисплазией фиброзного слоя. Что, в свою очередь может, оказывать влияние на активность фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, угнетая энергетический обмен в сперматозоиде, и, как следствие, двигательную активность сперматозоида. Эти данные требуют дальнейших исследований, планируется расширить выборку пациентов с нарушением подвижности сперматозоидов и дисплазией фиброзного слоя.

Гетерогенность механизмов, приводящих к астенозооспермии, усложняет ее патогенез. Мы не выявили ассоциации астенозооспермии и повышенного содержания сперматозоидов с нарушением конденсации хроматина. Фрагментация ДНК – другой тип нарушений генетического аппарата сперматозоидов, имеющий отличную от нарушений конденсации хроматина природу (Брагина и соавт., 2009). Поэтому следующим подходом к исследованию патогенеза астенозооспермии было исследование уровня фрагментации ДНК сперматозоидов как возможного источника нарушения их подвижности. В лаборатории генетики нарушений репродукции провели исследование уровня фрагментации ДНК у 266 пациентов с нарушением фертильности (из них 153 с астенозооспермией) путем введения меченых нуклеотидов и терминальной трансферазы (метод TUNEL). Это позволило выявить двойные и одинарные разрывы ДНК. Для всех пациентов был проведен спермиологический анализ. В нашем исследовании мы не выявили ассоциации между низкой подвижностью сперматозоидов и повышенным количеством половых клеток с нарушением целостности ДНК у пациента. Вместе с тем мы показали отсутствие ассоциации между повышением количества сперматозоидов с нарушением целостности ДНК и концентрацией сперматозоидов: в группе пациентов с высоким уровнем фрагментации ДНК (более 15%) доля пациентов с низкой концентрацией сперматозоидов составила 55%, тогда как в группе пациентов с нормальным уровнем фрагментации ДНК не превышала 22%.

Аномалии хроматина сперматозоидов часто ассоциированы с показателями спермиологического анализа ниже нормативных (ВОЗ, 1999). Однако некоторые исследователи (Henkel, 2004) считают, что параметры фрагментации ДНК не имеют четкой ассоциации с параметрами эякулята.

В работе 2003 года Benchaib с соавторами выявили отсутствие ассоциации фрагментации ДНК с характеристиками спермограммы: концентрацией, подвижностью и процентом морфологически аномальных сперматозоидов. Данные нашего исследования не полностью согласуются с результатами коллег и демонстрируют отсутствие ассоциации астенозооспермии с повышенным содержанием сперматозоидов с повышенной фрагментацией ДНК и ассоциацию олигозооспермии (содержание в 1 мл эякулята менее 20 млн. сперматозоидов (ВОЗ, 1999)) с повышенным содержанием одно- и двунитевых разрывов ДНК.

Эти противоречивые данные требуют дальнейших исследований, планируется расширить выборку пациентов с нарушением подвижности сперматозоидов. Изучение патогенеза астенозооспермии требует расширения современных представлений о роли нарушения целостности генома (одно- и двунитевых разрывов ДНК) сперматозоидов в этиологии астенозооспермии.

Модификация протокола комплексного медико-генетического обследования пациентов с астенозооспермией

На основании полученных данных, нами была предложена модификация протокола обследования пациентов с астенозооспермией неясного генеза (рис.6). Рекомендация проводить анализ гена GAPDHS на наличие полиморфизма rs29381 (660-22 G>A) и других возможных перестроек была внесена в протокол. Первый этап включает сбор анамнеза фертильности. При сборе анамнеза уточняются следующие сведения: является бесплодие первичным или вторичным, возраст мужа и жены, факт перенесенных инфекционно-воспалительных заболеваний половых органов, хирургических вмешательств, варикоцеле. Затем проводят спермиологический анализ в соответствии с «Лабораторным руководством ВОЗ по оценке и обработке эякулята человека» который рекомендуется повторить через 2 недели. Оценку сперматогенеза проводят на основании лучшей из двух спермограмм. Для исключения хромосомной природы бесплодия назначают цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови. Пациентам со сниженным процентом подвижных форм рекомендуют электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов. На этом этапе обследования нами рекомендуется заморозить при -20°С 0,5 мл эякулята для дальнейшего исследования на наличие перестроек гена GAPDHS у пациентов с астенозооспермией и повышенным содержанием сперматозоидов с дисплазией фиброзного слоя жгутика.

1. 
   Среди пациентов с бесплодием и патозооспермией (9215 человек) 93% составляют мужчины с разными формами астенозооспермии. Структура астенозооспермии неоднородна: в 70 % случаев она сочетана с тератозооспермией, группа пациентов с олигоастенотератозооспермией составляет 26% , с олигоастенозооспермией - 0,25%, астенозооспермия встречается у 4% обследованных. Это свидетельствует о различных механизмах, приводящих к нарушению двигательной активности сперматозоидов.
   
2. 
   При электронно-микроскопическом исследовании в эякуляте пациентов с астенозооспермией (86 мужчин) повышенное содержание сперматозоидов с прореагировавшей акросомой выявляется в 2 раза чаще, а с нарушенной структурой плотных фибрилл в 6 раз чаще, чем у пациентов с нормальной подвижностью сперматозоидов.
   
3. 
   При электронно-микроскопическом исследовании в эякуляте пациентов с астенозооспермией (86 мужчин) обнаружены сочетания нарушений нескольких ультраструктур сперматозоидов. Изменение положения акросомы, выявленное у 64 пациентов, сочетается с наличием цитоплазматической капли на головке и нерегулярной укладкой митохондрий в 15.6 % случаев (10 мужчин). Нарушение строения пар периферических микротрубочек (12 мужчин) сопровождается изменением положения акросомы (91,7% случаев), нерегулярной укладкой митохондрий (83,3% случаев), сдвигом наружных плотных фибрилл аксонемы (67,7% случаев). При этом у 6 из 12 мужчин наблюдали четыре ультраструктурные аномалии сперматозоидов - нарушение строения пар периферических микротрубочек, изменение положения акросомы, нерегулярная укладка митохондрий, сдвиг наружных плотных фибрилл аксонемы.
   
4. 
   При электронно-микроскопическом исследовании эякулята пациентов с астенозооспермией (86 мужчин) не обнаружено ассоциации астенозооспермии и повышенного содержания сперматозоидов с нарушением конденсации хроматина. При анализе фрагментации ДНК ассоциации между количеством сперматозоидов с нарушением целостности ДНК и низкой подвижностью сперматозоидов не выявлено.
   
5. 
   Количественный кариологический анализ соотношения незрелых половых клеток из эякулята на разных стадиях сперматогенеза впервые позволил выявить блок сперматогенеза на стадиях прелептотены-лептотены-зиготены и повышенное количество незрелых половых клеток с признаками дегенерации у 80% мужчин с астенозооспермией, сопровождающейся полизооспермией. Неразошедшиеся в делениях мейоза сперматиды выявлены в 50% исследованных по незрелым половым клеткам случаев астенозооспермии.
   
6. 
   Проведенный на репрезентативной выборке (240 пациентов с астенозооспермией) молекулярно-генетический анализ митохондриальной ДНК свидетельствует о неучастии делеции митохондриальной ДНК 4977 и точковой мутации митохондриальной ДНК A3243G в патогенезе астенозооспермии.
   
7. 
   Проведенный молекулярно-генетический анализ гена GAPDHS, кодирующего один из ферментов гликолиза, спермоспецифическую глицеральдегид—3-фосфат-дегидрогеназу, позволил впервые описать в этом гене полиморфизм rs29381 (660-22 G>A) в гетерозиготном состоянии у пациентов с тотальной астенозооспермией и дисплазией фиброзного слоя аксонемы жгутика.
   
8. 
   Модифицирован протокол комплексного медико-генетического обследования пациентов с астенозооспермией с обязательным цитогенетическим (по лимфоцитам периферической крови), ультраструктурным анализом сперматозоидов и исследованием гена GAPDHS.
   

1. 
   Хаят С.Ш., Брагина Е.Е., Захарова Е.Ю., Курило Л.Ф. Структура и патогнез астенозооспермии // Андрология и генитальная хирургия. – 2010. – №3. – С. 43-48.
   
2. 
   Хаят С.Ш., Mясников Д.А., Курило Л.Ф. Анализ патогенеза полизооспермии // Андрология и генитальная хирургия. – 2011. – №3. – С.46-49.
   
3. 
   Хаят С.Ш. Ультраструктурные и генетические основы двигательной активности жгутика сперматозоида // Андрология и генитальная хирургия. – 2012. – №1. – С. 59-61.
   
4. 
   Хаят С.Ш., Захарова Е.Ю., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф. Частота делеции мтДНК 4977 в сперматозоиздах пациентов с астенозооспермией неясного генеза // Материалы 7-го Российского научно-образовательного форума Мужское здоровье и долголетие. – 2009. – С. 74.
   
5. 
   Курило Л.Ф., Якубова Н.П., Гордеева Е.Г., Хаят С.Ш. Этические и законодательные вопросы при выполнении биомедицинских технологий. // Проблемы репродукции. – 2009 – Т.15. – С.16.
   
6. 
   Hayat S. Sh., Schilejko L.V., Kurilo L.F. Detection of the 4977 bp mitochondrial DNA deletion in asthenozoospermiс men //4th Utah-Florence Symposium on the Genetics of Male Infertility – 2010. – P. 46.
   
7. 
   Хаят С.Ш., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф. Оценка наличия делеции мтДНК4977 среди пациентов с астенозоосермией // Материалы 8-го Российского научного форума Мужское здоровье и долголетие. – 2010 – С. 105
   
8. 
   Hayat S. Sh., Schileiko L.V., Kurilo L.F. The mitochondrial tRNALeu(UUR) A3243G transition in asthenozoospermic men // 16-th European Workshop on Molecular and Cellular Endocrinology of the Testis –P. 137.
   
9. 
   Хаят С.Ш., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф. Изучение делеции 4977 и транзиции A3243G мтДНК в сперматозоидах пациентов с астенозооспермией неясного генеза // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика. – 2010. – С. 187.
   
10. 
    Hayat S. Sh. Investigation of the 4977 bp mitochondrial DNA deletion in asthenozoospermiс men // European Journal of Human Genetics - European Human Genetics Conference. – 2010. – P.134.
    
11. 
    Hayat S.Sh., Schileiko L.V., Kurilo L.F. The mitochondrial tRNALeu(UUR) A3243G transition in asthenozoospermic men // 26th Annual Meeting of ESHRE – 2010. – P. 41.
    
12. 
    Hayat S.Sh., Schileiko L.V., Kurilo L.F. The 4977 bp mitochondrial DNA deletion and tRNALeu(UUR)A3243G transition in asthenozoospermic men // 20-th World Congress on Fertility and sterility. – 2010 – 138.
    
13. 
    Hayat S. Sh., Bragina E.E., Kurilo L.F. Light microscopic and ultrastructural analysis of spermatozoa in asthenozoospermic men // 5th Congress of World Association of Reproductive Medicine Reproductive BioMedicine Online. – 2010. – V.20 – S 3. – P.117
    
14. 
    Hayat S. Sh., Bragina E.E., Kurilo L.F. Ultrastructural analysis of spermatozoa in asthenozoospermic men // ASHG 2010 Annual Meeting – 2010. – P. 275.
    
15. 
    Хаят С.Ш. Структура полизооспермии у пациентов с бесплодием // материалы конференции молодых ученых МГНЦ РАМН – 2011. С. 28.