Влияние тимэктомии на иммунный ответ у мышей линии сва/Са

Научный руководитель - к.м.н., старший научный сотрудник Лабунец И.Ф.

Институт генетической и регенеративной медицины НАМНУ
Известно, что формирование иммунного ответа включает как распознавание чужеродных агентов разной природы, так и развертывание цепи реакций, направленных на их ликвидацию. Сила иммунного ответа во многом зависит от присутствия критического количества иммунокомпетентных клеток, которые происходят от стволовых клеток костного мозга и дифференцируются в центральных лимфоидных органах: В-лимфоциты, моноциты и макрофаги - в костном мозге, Т-лимфоциты - в тимусе [1, 2, 3, 4, 5].

Макрофаги принимают участие в иммунном ответе на всех его этапах. Во-первых, они осуществляют немедленную защитную реакцию до тех пор, пока не произойдет усиление иммунного ответа, регулируемое антигенспецифичными Т-клетками. Во-вторых, они вызывают активацию Т-клеток, осуществляя процессинг и презентацию им антигена. И наконец, активированные в свою очередь Т-клетками, они выполняют важные функции в эффекторных механизмах клеточного иммунитета, вызывая воспаление и уничтожая микроорганизмы, а также опухолевые клетки. Предположительно активация макрофагов происходит в несколько этапов, под влиянием следующих один за другим стимулов, которыми могут служить цитокины, эндотоксин, различные медиаторы и регуляторные факторы воспаления [1].

Центральный орган иммунной системы тимус секретирует гормональные субстанции и цитокины, которые проявляют по отношению к клеткам костного мозга колониестимулирующие свойства [5, 6]. Инволюция тимуса сопровождается уменьшением в сыворотке крови уровня гормонов тимуса, и, как результат, нарушением пролиферации, дифференцировки, функциональной активности Т- и В-лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов [7, 8]. Нарушение дифференцировки стволовых клеток у тимэктомированных животных можно восстановить с помощью введения таким животным биологически активных факторов тимуса [5]. Дефицит Т-лимфоцитов после тимэктомии также может привести к нарушению взаимодействий между клетками иммунной системы и стволовыми клетками костного мозга.

Цель – исследовать показатели иммунного ответа и функциональную активность макрофагов у мышей линии СВА/Са после удаления тимуса.

Материалы и методы исследования

Уровень иммунного ответа оценивали у взрослых (3 – 5 месяцев) мышей линии СВА/Са (генотип а, H-2^k) разводки ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины». Мыши линии СВА/Са характеризируются генетически обусловленным сильным ответом на Т-зависимый антиген (эритроциты барана), высокими адаптивными возможностями организма и продолжительностью жизни [9], что позволило выбрать мышей этой линии в качестве наиболее подходящей модели для проведения иммунологических исследований. Животные были разделены на 2 группы:

контрольные мыши, которым проводили ложную операцию без удаления тимуса;

тимэктомированные мыши – животные, тимус которых был удален за 3,5 месяца до проведения эксперимента.

За 5 суток до проведения эксперимента тимэктомированные и ложнооперированные животные были иммунизированы эритроцитами барана внутрибрюшинно в дозе 2х10⁸ клеток на мышь (0,2 мл 3% взвеси эритроцитов барана на физиологическом растворе).

Биологический материал получали после декапитации мышей под эфирным наркозом согласно правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных [10].

Селезенку, выделенную у животных экспериментальных групп, гомогенизировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали концентрацию клеток в камере Горяева. Количество антителобразующих клеток (АОК) в селезенке определяли в реакции локального гемолиза в геле по методу Эрне и Нордина [11]. Результаты представляли в виде относительного количества АОК на 10⁶ спленоцитов и абсолютного количества АОК в перерасчете на общее количество клеток в селезенке. Оценку титра гемолизинов и гемагглютининов проводили стандартным методом [12]. Результаты реакций выражали в log₂ титра антител.

Для изучения механизмов влияния тимэктомии на иммунный ответ у тимэктомированных и ложнооперированных мышей линии СВА/Са также определяли фагоцитарную активность макрофагов in vitro. Для этого клеточную суспензию спленоцитов мышей отмывали в среде RPMI-1640. Суспензию клеток доводили до концентрации 8·10⁶/0,2мл, после суспензию наслаивали на чистые покровные стекла размером 18х18мм, которые размещали в шестилуночных стерильных планшетах и инкубировали на протяжении 60 минут во влажной атмосфере с содержанием 5% СО₂ при 37^˚С. После инкубации неадгезированные клетки смывали со стеклышек теплым раствором 0,9% NaCl, поочередно опуская их в три стакана.

Для определения фагоцитарной активности макрофагов на полученный монослой наносили 0,2 мл суспензии латекса в концентрации 2,5х10⁸ мл в среде RPMI-1640 и инкубировали 45 минут во влажной атмосфере с содержанием 5% СО₂ при 37⁰С. После чего стеклышки смывали, опуская в стакан с теплым физиологическим раствором, фиксировали в парах 4% параформальдегида, приготовленного на растворе Хенкса (рН 7,4) и окрашивали по Романовскому-Гимзе.

Под светловым микроскопом подсчитывали не меньше 100 макрофагов, определяя показатели функциональной активности макрофагов: фагоцитарный индекс (ФИ – количество клеток, способных к фагоцитозу частичек латекса), фагоцитарную активность (ФА – процент активных макрофагов к общему числу подсчитаных макрофагов); фагоцитарное число (ФЧ – количество частичек латекса, поглощенных одним макрофагом) [13].

Статистический анализ результатов проводился с использованием методов параметрической (t критерий Стъюдента) статистики в программном пакете Statistica 6.0 [14].
Результаты исследования и их обсуждение

1. Влияние тимэктомии на показатели иммунного ответа у мышей линии СВА/Са.

Известно, что стресс – это адаптационная реакция организма, в основе которой лежит активация гипофизарно-надпочечниковой системы. Повышение в крови концентрации АКТГ и глюкокортикоидов наблюдается после различных видов стресса, в том числе и после операционных вмешательств. Основными клетками-мишенями для действия кортикостероидов являются лимфоциты. Одним из ранних проявлений стресса является перераспределение и мобилизация лимфоцитов, что обусловливает клеточное опустошение тимуса и селезенки и ведет к формированию быстрой адаптивной реакции на стрессорное раздражение. В этих условиях улучшаются клеточные взаимосвязи, повышается содержание стволовых клеток в костном мозге, наблюдается миграция Т-лимфоцитов из тимуса в костный мозг [9, 15]. Повышение уровня гормонов гипофизарно-надпочечниковой системы является одним из факторов, который может привести к угнетению эндокринной функции тимуса [16].

В связи с описанным выше важно было ввести в эксперимент группу животных с ложной операцией. Результаты исследования показателей иммунного ответа у ложнооперированных и тимэктомированных мышей представлены в табл.1. Установлено, что у тимэктомированных мышей снижается масса селезенки по сравнению с ложнооперированными животными (P<0,05). Кроме того, после тимэктомии наблюдается снижение клеточности селезенки (P<0,05).

Количество АОК в селезенке иммунизированных мышей является одним из важных показателей силы иммунного ответа, на который может влиять тимус. И хотя значительных изменений относительного количества АОК после тимэктомии мы не наблюдали, абсолютное количество АОК в селезенке существенно уменьшилось у животных без тимуса по сравнению с ложнооперированными (в 1,6 раза, P<0,05 ). По нашим данным видно, что титр антител в сыворотке крови иммунизированных животных в ответ на тимэктомию не изменялся. Однако, при индивидуальном анализе величин титра антител установлено, что у 28,6% тимэктомированных мышей его значения были ниже 6, тогда как в ложнооперированной группе таких животных не было.

Таблица 1

Уровень иммунного ответа у ложнооперированных и тимэктомированных мышей линии СВА/Са

Иммунный ответ - интегральный иммунологический показатель, который зависит от активности его составляющих. Результаты определения показателей фагоцитарной активности макрофагов у животных экспериментальных групп показали, что в ответ на тимэктомию наблюдается тенденция к снижению количества клеток, способных поглощать частички латекса (табл.2). Показатели ФА и ФЧ практически не изменяются после тимэктомии. Нами ранее показано, что в костном мозге мышей линии СВА/Са количество клеток-предшественников для гранулоцитарно-макрофагальных колоний снижается после тимэктомии. Кроме того, как уже отмечалось ранее, сила иммунного ответа во многом зависит от присутствия критического количества иммунокомпетентных клеток. Поэтому можно полагать, что удаление тимуса преимущественно влияет на количество активных клеток, способных осуществлять фагоцитоз, а не на функциональную активность макрофагов.

Таблица 2

Фагоцитарная активность макрофагов селезенки мышей лини СВА/Са

1. У мышей линии СВА/Са тимэктомия угнетает первичный иммунный ответ на Т-зависимый антиген (эритроциты барана).

2. Тимэктомия приводит к некоторому снижению количества клеток, способных к фагоцитозу.
Литература

1. Maurice R.G., O’Gorman Albert, D. Donnenberg. Handbook of human immunoligy. Second edition. – New York: CRC Press, 2008 - 642 p.

2. А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. Иммунология. .Пер. с англ. В. И. Кандрора, Л. А. Левницкого – М.: Мир, 2000 – 562 с.

3. Галактионов В. Г. Иммунология: Учебник. – М.: МГУ. 1998 – 480 с.

4. Дранник Г. Н. Клиническая иммунология и аллергология. – Одесса: АстроПринт, 1999 – 603 с.

5. Ярилин А. А. Основы иммунологии: Учебник. – М.: Медицина, 1999. – 608 с.

6. Ярилин А.А. Структура тимуса и дифференцировка Т-лимфоцитов. – М: Медицина, 1991. – 43 с.

7. Родниченко А. Е., Андрианова Л. Ф., Бутенко Г. М. Особености иммунного ответа у мышей разных генотипов и отдаленные последствия применения иммунотропных препаратов в раннем возрасте // Проблемы старения и долголетия. – 2009. – Т. 18, № 3, – С. 280 – 294.

8. Бутенко Г. М. Старение иммунной системы // Проблемы старения и долголетия. – 1998. – Т. 7, №3. – С. 5 – 7.

9. Лабунец И.Ф., Кучук О.В., Родниченко А.Е., Бутенко Г.М. Генетические особености функционального состояния иммунной системы у интактных мышей и при условии стресового воздействия //Актуальные проблемы акушерства и гинекологии, клинической иммунологии и медицинской генетики. Сборник научных работ, выпуск 19. – Киев – Луганск, 2010. - С. 271 – 281.

10. Приказ Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. № 755 о мерах по дальнейшему совершенствованию работы с использованием экспериментальных животных.

11. Jerne N.K., Nordin A.A., Henry C. Cell-bound antibodies. -Wistar Institute Press. -1963. -109 p

12. МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ НАКАЗ N 356 25.07.2003 Про затвердження методичних рекомендацій "Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних хімічних речовин при їх гігієнічній регламентації"

13. Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації) / Під ред. О.В.Стефанова –К.: Авіцена. -2001. -528 с.

14. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст]/ О.Ю. Реброва. – М.: МедиаСфера, 2003. – 312 с.

15. Корнева Е.А. Шхинек Гормоны и иммунная система. – Л.: Наука, 1988. – 251с.

16. Гриневич Ю. А., Демина Э. А. Иммунные и цитогенетические еффекты плотно- и редкоионизирующих излучений/ Под ред. А. А. Ярилина. – К: Здоровье, 2006. – 200 с.
EFFECT OF THYMECTOMY ON THE IMMUNE RESPONSE IN MICE OF СВА/Са

Rieznik E. Y., Rodnichenko A.E., Vasyliev R.G., Labunets I.F.

Supervisor of studies - MD., senior researcher Labunets I.F.

Institute of Genetic and Regenerative Medicine NAMS

Involution of the thymus is accompanied by a decrease in blood serum levels of hormones of the thymus and, consequently, by a violation of proliferation, differentiation, functional activity of T- and B-lymphocytes, macrophages and neutrophils, which affect on the strength of the immune response. That is why, the research of the relationship between the functioning of the thymus and the strength of immune response is relevant.

Тhe goal of this work was to investigate the immune response and functional activity of macrophages in mice CBA/Ca after removal of the thymus.

We observed a significant decrease in weight of the spleen; in the number of antibody-forming cells (AFC) in the spleen; and the tendency to decrease in the number of cells capable of phagocytosis of latex particles after thymectomy.