Д. К. Найманов, А. М. Калбаева Гендік және жасушалық инженерия
Сүтқоректілер жасушасына гендерді енгізу. Жануарлар жасушасына
жүктеу/скачать 1.81 Mb. Pdf көрінісі
|
| 3.3 Сүтқоректілер жасушасына гендерді енгізу. Жануарлар жасушасына
тасымалдауға арналған векторлардың сипаттамасы. Сүтқоректілер жасушаларына жасалатын манипуляцияларды екі үлкен топқа бөлуге болады: сомалық жасушалармен жасалатын және жыныс жасушаларын трансформациялауға арналған тәжірибелер. Соңғысының нәтижесінде трансгенді ағзалар алынады. Бөтен генетикалық ақпаратты енгізудегі ең жақсы тасымалдаушы ретінде ретрофирустар, мысалы, тышқан лейкозының вирусының негізіндегі векторлар қолданылады. Олар тасымалданатын геннің бөтен нысаналы жасушаға дұрыс тасымалданып, жоғары тиімділікпен енуін қамтамасыз етеді. Көбінесе жануарлардың трансформациясын ретровирустар көмегімен (трансформацияның барлық түрлерінің 40%-ындай үлесі), ДНҚ-ын липосомаларға қаптау жолымен (25%), сонымен қатар аденовирустарды да сирек қолданады. Аденовирустар мықты иммундық жауап шақыруы мүмкін, оның үстіне оларды қайтара енгізу мүмкіндігі жоқ. Егер бөтен ДНҚ молекуласын жасушаға тасымалдау мәселесі in vitro жағдайында шешілген болса, оның нысаналы жасушаға сәтті жетуінің мәселесі әлі күнге дейін шешіліп жатыр. Осы мәселені шешу жолдарының бірі рецепторлық ақуызы бар немесе белгілі бір ұлпа үшін спецификалығы жоғары антигендері бар конструкцияларды жасау. Ал вектордың интеграциялану тұрақтылығы, экспрессиялануының басқарылуы, қауіпсіздігі сияқты қасиеттері әлі айтарлықтай жетілдіруді қажет етеді. Жетілдіруді қажет ететін қасиеттердің ішіндегі ең маңызды мәселенің бірі – бөтен геннің интеграциялану тұрақтылығы болып табылады. Қазіргі кезге дейін геномға интеграциялану ретровирустардың немесе аденоассоциацияланған векторлардың көмегімен іске асып келді. Бөтен геннің интеграциялануының тұрақтылығын арттыру үшін рецептордық қатысуымен іске асатын жүйелерге ұқсайтын конструкцияларды жетілдіру немесе тұрақты эписомалық векторларды жасақтау арқылы (яғни, ядроның ішінде ұзақ уақыт персистенттілігін сақтай алатын ДНҚ құрылымдары). Соңғы уақытта сүтқоректілердің жасанды хромосомаларының (MAC - mammalian artificial chromosomes) негізіндегі векторларды жасауға көп мән беріліп жатыр. Қалыпты хромосомадағыдай құрылымдық элементтерінің болуы арқасында мұндай хромосомалар жасушада ұзақ уақыт сақтала алады да, олардың құрамында геннің қажет уақытта және қажетті ұлпада қызметін ойдағыдай атқаруы үшін, қызықтырушы бүтін (геномдық) гендер және олардың табиғи басқару элементтері бола алады. Осыған байланысты, ашытқылардың геномдарының толық картасы құрылғандықтан, оларға арнап жасанды хромосома (YAC – yeast artificial chromosomes) жасалып шығарылған. 89 Модификацияланған жасушаларды анықтау (идентификациялау) үшін маркерлер қажет. Сомалық жасушаларды трансформациялаған кезде әдеттегі селективті маркерлерді қолданады. Колумбия университетінің терапия және хирургия колледжіндегі Аксель және оның әріптестері дәл осы жолмен тышқан жасушасының мүкісін жойған. Ол үшін герпес вирусынан алынған тимидинкиназа (ТК) гені бар ДНҚ фрагментін алып, албырт спермасынан алынған тасымалдаушы ДНҚ-ның бірнеше милиграмымен араластырып, ТК гені жоқ (ТК - ) тышқандардың L- культурасына тұндырады. 100000 жасушаға 1 жасуша жиілігімен ТК - - жасушалар ТК генін қабылдап бастаған. Сондықтан ТК гені жоқ жасушалары өсе алмайтын селективті ортада ТК генін қабылдап алған жасушалар өсе бастады. Басқа селективті маркердің рөлін дигидрофолатредуктазаны (ДГФР) кодтайтын ген атқарады, оны мутантты емес жасушаларды трансформациялау үшін қолданады. Осы геннің көптеген көшірмелерін экспрессиялаудың арқасында жасуша плазмидамен бірге фермент ингибиторына төзімділікке ие болады да, осы ингибитордың жоғары концентрациясы бар ортадан трансформанттарды оңай бөліп алуға болады. Одан бөлек қалыпты жасушаларда қызмет атқара алатын, құрамында гендік маркерлері бар екі универсалды вектор жасалды. Олардың құрылысы ұқсас құрастырылған: трансгенді жасушалардың фенотипін анықтайтын прокариоттық гендер және онымен байланысқан эукариоттардың басқарылатын сигналдық тізбектері. Осы векторлардың біреуінің құрамына SV-40 геномының аймағына енгізілген прокариоттардың неомицин антибиотигіне төзімділік гені кіреді. Эукариоттық жасушалар неомициннің аналогы G 418-ге сезімтал болып келеді, G 418-ді геннің өнімі белсенділігінен айырады. Міне, осылайша, трансфекциядан өткен жасушалар G 418-і бар қоректік ортада өсе алу қабілетіне ие болады. жүктеу/скачать 1.81 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|