Дәріс № 5 Сабақтың тақырыбы: Нуклеин қышқылдарын бөлу және талдау әдістері

1. Нуклеин қышқылдарын бөліп алудың жалпы принциптері. Әртүрлі реагенттерді нуклеин қышқылдарын бөліп алуда пайдалану.

2.ДНҚ нуклеин қышқылдарын фракциялау. Жалпы ДНҚ оқшаулау тазарту үшін түрлі реагенттерді пайдалану

Рестрикциялау — модификациялау құбылысы 50-ші жылдары байқалған болатын. Рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді, ал модификация — молекуланың белгілі топтарын химиялық жолмен немесе оларға баска топтарды жалғау арқылы өзгерту. Рестрикция мен модификациялау құпиясын В. Арбер ашты.

Бактерияның “өзінің” нуклеин кышқылын “бөтен” фагтардың (вирустардың) нуклеин қышқылынан ажырататын арнайы ферменттері болады. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның клеткада көбеюіне жол бермейді. Рестриктазалармен қатар бактерияларда метилаза деген фермент бар. Ол бактерияның өзінің ДНҚ тізбегіндегі азоттық негіздерге белгілі мөлшерде әрбір репликациядан кейін метил тобын (СН₃) жалғап, модификациялап отырады. Метилденген ДНҚ-ны рестриктаза “өзінікі” санап оған “тиіспейді”. Бұл бактериялардағы өзіндік бір “иммундык жүйе” іспеттес. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енген фагтың кейбір нуклеин қышқылы кездейсоқ метилденіп кетеді. Осы қателігінен бактерияның өзі фагтың әсерінен қырылып калады. Осы құбылысты О. Смит, Д. Натанс және В. Арбер ашты. Рестриктазалар табиғаттың ген инженериясына арнап жасаған таптырмас құралы. Бактерия әр түрлі болғандықтан олардың рестриктазалары ДНҚ-ны әртүрлі жолмен үзеді.[Қазір 500-ден аса рестриктаза түрі белгілі және олар ДНҚ-ны бір-бірінен өзгеше 120 жерінен үзе алады. Яғни зерттеуші рестриктазаны тандай отырып ДНҚ-дан қалаған ферментті нсмесе генді бүлдірмей бүтін күйінде кесіп алады.

Генді бөліп алу мен ген өркенін (клондарын) алу үшін әртүрлі объектілер (бактериялардан, сүтқоректілер клеткаларынан, құстардан т. б. алынған) және әртүрлі вирустар жұқтырылган ортада өсірілетін ерекше ферменттер құрал ретінде пайдаланылады. Негізіндс олар үш түрлі ферменттер: рестриктазалар, лигаза жәис кері транскриптаза.

Рестриктазалар – дезоксирибонуклеазалардың ДНҚ молекуласын қысқа немесе ұзын болшектерге тіпті жеке нуклеотидтерге дейін кесетін ферменттердің бір түрі. Рестриктазалардың ерскшеліктері ДНҚ молекуласын кез кслген жерден кеспей тек белгілі нуклеотидтер арасынан кесуінде. Әрбір рестриктазаның тандайтын нуклеотидтср орналасу тәртібі бар. Бұл әдетте 4-6 жұп нуклеотидтер, әртүрлі рестриктазалар үзетін жеріндегі нуклеотидтердің құрамында айырмашылығы болады. Мысалы Е. соІі рестриктазасы ДНҚ молекуласын ГААТТЦ учаскесіндс үзеді, Ват -НІ-ГГАТЦЦ учаскесінде. Қазір әр түрлі рестрикта-залардың жүзден артық өзіндік бірізділігі белгілі.

ДНК тізбегінің ұзына бойында нуклеотидтер кездейсоқ орналасса, теөт белгілі нуклеотидтен тұратын жүйелілік (бірізділік) 1/256-ға, ал алты нуклеотидтен – 1/4096 тең болады. Сондықтан рестриктазалар ДНК-ны бірнеше жүздеген немесе мындаған нуклеотидтер жұптарынан түратын бөлшектерге үзеді,