Дәріс № 21. Аминқышқылдарды алу

1. 
   Аминқышқылдарды алу әдістері.
   

1.Табиғи ақуыздардың құрамына келесі аминқышқылдары кіреді: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагин қышқылы, цистеин, глицин, глутамин қышқылы, гистидин, глутамин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, оксипролин, пролин, серин, кирозин, треонин, триптофан және валин. Сегіз аминқышқылын жануарлар организмі өздігінен синтездей алмайды, сондықтан оларды биологиялық ауыстырылмайтын аминқышқылдары деп атайды. Оларға пенилаланин, изолейцин лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан және валин жатады.

Аминқышқылдарын химиялық синтез жолымен алуға болады, бірақ бұл жағдайда қиын ажыратылатын L- D- формадағы аминқышқылдарының рацимикалық қоспасы түзіледі. Аминқышқылдарын табиғи ақуыздардың гидлозі арқылы гидролизаттардан аминқышқылдарын бөлу жолымен алуға болады. Бірақ ақуыздардың артық қоры шектеулі, сонымен қатар қышқылды гидролиз кезінде кейбір аминқышқылдар, мысалы триптофан бұзылады. Қазіргі уақытта бүкіл дүние жүзінде көп мөлшерде глутамин қышқылын немесе оның натрий тұзын, L-лизин және метионин (50т жылына) алады. Осы мөлшердің көп мөлшерін микробиологиялық синтез береді. Биосинтез үшін ауксотрофты мутанттарды, яғни мутагенді факторлардың әсерінен дамуға және өсуге қажетті қандайда бір аминқышқылдардың өздігінен синтездеу қабілеттілігін жоғалтқан бактериялар. Бұл осындай бактериялардың өсуі және көбеюі үшін ортада аминқышқылдардың, яғни гомосерин, треонин немесе метиониннің және т.б белгілі бір мөлшер болу қажет. Осы мутанттарға көбінесе биотин қажет. Мұндай бактерияларды гомосериндефицитті немесе биотин дефицитті деп атайды. Мұнымен қоса мутанттар көп мөлшерде басқа аминқышқылдарын, яғни лизин немесе глутамин қышқылын синтездеп, оларды қоршаған ортаға бөлуге қабілетті. Мутагенді факторлар жасушадағы аминқышқылдарының қалыпты биосинтезін генетикалық ақпаратқа әсер ету арқылы өзгерте алады. Егер сәулелену немесе химиялық факторлардың ДНКға әсері нәтижесінде ферменттің синтезделуі үшін ешқандай ақпарат бермесе онда жасушада да синтезделмейді.

Ауксотрофты мутанттарды оқу нәтижесінде ормитин продуценттері ретінде аргинин немесе цитруллинрефицидті; гомосерин немесе диаминопимерин қышқылы триониндефицидті; изолейцин продуценттері; лизиндефицитті; тирозин продуценттері фенилаланиндефицитті болуы мүмкін. Кейде табиғатта кездесетін бактериялар өсу процессі кезінде ортада 2-5г/л бос аминқышқылдарын жинақтауға қабілетті, бірақ ауксотрофты мутанттар оларды одан да көп мөлшерде,яғни 20-100г/л продуцирлейді.

1. 
   Лизин продуценттері
   
2. 
   Лизин биотехнологиясы
   

Лизин мал азығындағы дефицитті ауыстырылмайтын аминқышқылдары лизиннің биосинтезі үшін бревибактериум, миктороройойс, коррунебактериум тұқымдасының ауксотрофты бактерияларының гомосерин дефициті мутанттарын қолданады.

Лизиннің активті продуценті бревибактериум. Оның клеткалары қозғалмайтын Грам оң таяқшалары, ұзындығы 1,2-2,5 мкм, кейде сопақша немесе домалақ формада болады.

Лизин продуценттерінің көмірсуы не сірке қышқылының N және О₂ көздері бар қоректік ортада культивирлейді. Бактерия клеткасында лизин пирожүзімді, аспарогинді немесе янтарь қышқылынан синтездейді. Лизин алу кезінде жағымсыз продуценттерді болдырмау керек.

Жеткіліксіз аэрация лизиннің орнына аланин не сүт қышықылының түзілуіне әкелуі мүмкін. Қоректік ортада дефицитті аминқышқылдарының концентраты гомосеррин, метионин және треонин маңызды фактор болып табылады. 1 л қоректік ортада оптимальді концентрациясы треонин 800мг, метионин 200мг. Культураның дамуы үшін 1 л қоректік ортаға 200мкг концентрацияда тиамин қажет. Процестің реттегіші ретінде биотин қолданылады. Қоректік ортада биотин концентрациясы 1-4мкг/л глутамин қышқылын продуцирлейді, 2,5мг/л концентрациясы сүт қышқылының түзілуін үдетеді.

Ферментация басында өсу факторын қамтамасыз ететін ол треоанин. Бірақ оның концентрациясы жоғары болмау керек, себебі, кейінгі кезеңдерде ол фермент ингибиторы ретінде әсер етуі мүмікн.

Лизин алу үшін мелассадан (7-12%) қант, жүгері экстрактілерінен, аммоний тұзынан бір және екі араластырылған калий фосфаты (0, 05%) тұратын қоректік ортада өсіреді.

Біріншіден, культураны араластырғыш колбада, содан соң 100 және 3000л сыйымдылықтағы ферментаторларда көбейтеді. Егінді материалдың көлемі 5-10% болу керек, оптимальді температурасы 30-33 ^оС, рН 7,46 ферментациялау ұзақтығы әр кезеңде 24 сағат шамасында негізгі ферментация 50-70 сағат. Ерітіндідегі лизин концентрациясы 20-40г/л жетеді, ал қантқа шығымы 25-35% клетканың биомассасына концентрациясы 10-15г/л. Кристалданған лизиннің жоғары концентрациясын алу үшін меласса қоректік ортасын қолданады.

Кристалданған лизинді алу үшін массасын центрифугалайды, ал кристалданған лизинді катионидтік У-2 немес КВ-4-Р-2 өткізеді.

Дәріс №23. Витаминдерді алу
Жоспар:

1. 
   Рибофлавин
   
2. 
   Цианкобаламин
   

Микроорганизмдердің құрамында көп витаминдер бар. Олар көбінесе ферменттердің құрамында болады. Биомассада витаминдердің құрамы мен мөлшері берілген.

Кейбір витаминдерді микроорганизмдер синтездейді, ал кейбірулерін дайын күйде қоршаған ортадан сіңіреді. Витминді синтездейтін культураны аутотрофты, егер культура белгілі бір витаминді синтездемейтін болса, аутогетеротрофты деп атайды.

В тобындағы витаминге бай болып саналатын ашытқылар: нан дрожжысы, сыра, азықтық дрожжылар. Ортаның жағдайын өзгерте отырып кейбір витаминді көбейтуге болдаы. Рибофлавиннің мөлшері аэрацияланатын интенсивтілігіне және құрамында темірдің болуына байланысты клеткада витаминнің мөлшерін және ашық бөлінуін микроэлементтердің әсерінен өзгердуге болады, мысалы марганец қосу арқылы инозиттің жиналуын байқауға болады. Кобальттің жоғары дозасы культуралдық сұйықтықта пиридоксиннің көлемі көбейеді.

Микрорганизм клеткасында рибофлавин, флавинадениннуклеотидтүрінде жинақталады. Ақырғы жағдайда бос күйінде вакуольде сары кристалл түрінде болады. Культивирлеуден кейін 5-7 тәуліктен кейін культура қартайып, автолизге ұшырап және рибофлавин вакуольден шығып, ортаға жинақталады.
Дәріс №24. Антибиотиктерді алу
Жоспар:

1. 
   Антибиотиктер классификациясы
   

Антибиотиктер органикалық қосылыстар болып табылады. Олар тірі клеткалармен снтезделеді, өте аз концентрацияда дамуға сезімтал, микроорганизм түрлерін өлтіруге қабілетті. Оларды тек микроорганизмдер мен жануарлар жасушалары ғана емес, сонымен қатар өсімдіктер жасушалары түзеді. Өсімдіктектес антибиотиктерді фитонцид деп атайды. Ол: томатин, сативин, хлорамин, сарымсақтан бөлінген антибиотиктер.

Алғашқыда антибиотиктерді олардың продуценттеріне қарай классификациялайды: бактериялық, актиномицеттік, саңырауқұлақтық. Биологиялық әсеріне байланысты: антибактериалды, антифунгицитті, ісікке қарсы болып бөлінеді.

Антибактериалды антибиотиктерге: пенициллин, карбамицин, т.б Грам оң бактерияларының өсуін тежеуіштер: тетрациклин, неомицин, стрептомицин болып бөлінеді және саңырауқұлаққа қарсы: нистатин, гризеофульгин, леворин жатады, ісікке қарсы: актиномицин және митомицин.

1. 
   алифатты антибиотиктер – нистатин, микостатин, фунгицидин. Нистатин дрожжылар мен саңырауқұлақтарға әсер етеді, бірақ бактерияларға әсер етпейді.
   
2. 
   Амоциклдік антибиотиктер – тетрациклин стафилакоккаларға, стрептококкаларға, сальмонеллаларға әсер етеді.
   
3. 
   Хинондар - стафилакоккаларға, стрептококкаларға әсер етеді.
   
4. 
   Азотты гетероциклді антибиотиктер – пенициллин және оның туындылары. Грам оң бактерияларға, яғни сальмонеллалар, стафилакоккалар, кандидаларға әсер етеді.
   
5. 
   Стрептомициндер және оларға қатысты антибиотиктер – Грам теріс бактерияларға әсер етеді.
   
6. 
   Оттегілік гетероциклді антибиотиктер – гризеофульвин, т.б
   
7. 
   Антибиотиктер – полипептидтер – грамицидин, т.б
   

1. 
   Микробтық пенициллинді алу.
   
2. 
   Азықтық антибиотиктер.
   

2. Азықтық антибиотиктерді арзан шикізат түрлерінен культуралды сұйықтықтан таза күйінде жеңілдетілген технология арқылы алады. Биомицин Actinomyces aureo faciens актиномицеттерін продуцирлейді. Бұл саңырауқұлақ организмдеріне ұқсас. Тереңдік өсіру жағдайларында актиномицет культуралары вегетативті көбеяді, яғни жіпше, таяқша, тіпті шар түріндегі гиф бөліктерін бөлу арқылы. Қатты қоректік орталарда актиномицеттер мицелли колонналарын түзеді. Кейінірек олардың беткі қабатында құрамында домалақ, сопақ немесе циллиндрлі споралары бар спорангиялар дамиды. Ферментация кезінде шамамен 50 сағ яғни мицеллидің массасы максимумға жеткен кезде антибиотик синтезі әлі де жалғасады, 60-70 сағ ферментациядан кейін максимум мәнге жетеді.

Егінді материал ретінде спораларды қолданады, оларды 2-6^оС температурада 3 тәулік сақтауға болады. Культуралардың колбаларда көбеюі үшін өте қарапайым ортаны қолданады ( 3% ұн, 3% жүгері экстрактысы). Процесс рН 6,7-6,8, 28-30^оС температурада 24-30 сағ өтеді. Ары қарай егінді материалды егінді ферментаторларда мөлшері негізгі ферментатордың жұмыс көлемінен 11-12% жеткенше көбейтеді. Ол үшін ұн және жүгері экстрактысынан тұратын қоректік ортаны қолданады. Ферментация процессі 27-28^оС, рН 6,6-6,7 30 сағ аралығында аэробты жағдайда өтеді. Егінді материалды 16-18^оС температурада тек 20 сағ қана сақтауға болады. Негізгі ферментацияны культураны оттегімен қамтамасыз етуді және қоректік ортаны араластыру қызметін атқаратын араластырғышы немесе аэрливті ауашашыратқыш жүйесі бар аппараттарда жүргізеді. Жоғарыда көрсетілген құрамды ортаның қолдана отырып және температураның, орта реакциясының, аэрацияның оптималды жағдайын қамтамасыз ету арқылы культивирлеудің бірінші сағатында мицеллидің интенсивті өсуін бақылауға болады. Бірінші 16 сағатта гифтерде гомогенді протомлазма байқалады, ал 24 сағаттан кейін протоплазма фрагментациясы пайда болады, осы уақытта культуралды сұйықтық сары қоңыртқай түске ие болады. Осы этапта биомицин интенсивті синтезделеді, сонымен қоса ортаның рНы жоғарылайды және процесс соңында (70-80 сағ кейін) 7,0-7,2 жетеді. Ферментация кезінде белсенділігі 1000-1500 бірл/мл. Азықтық бимицинді алу сұлбасы төменде келтірілген:

• 
  Қоректік ортаны дайындау;
  
• 
  Стерилдеу;
  

Ұн;

Салқындату;

• 
  Егінді материалды дайндау;
  
• 
  Ферментация;
  
• 
  Мицеллиді бөлу және ұсату;
  
• 
  Мицеллиді кептіру;
  
• 
  Мицеллиді ұсақтау;
  
• 
  Азықтық биомицинді буып түю.
  

1. 
   Ферментті препараттардың продуценттері
   
2. 
   Техникалық ферментті препараттар
   

1. Ферментті прапараттарды алу үшін зең саңырауқұлақтарымен қоса бактериялар мен ашытқыларды да қолданады. Кейде техникалық ферменттік препараттарды алу ферментация процесімен аяқталады. Мысалы, спиртөндірісінде крахмалды қанттау үшін aspergillius niger сұйық культурасын пайдаланады. Оны спирттік барда 1% крахмал мен тұздар бар қоректік ортада тереңдік егу әдісімен өсіреді. Соңында оны сұйық күйінде 10-12% көлемде қанттандырылған заттарға қосады. Практикада құрғақ техникалық ферментті препараттарды кеңінен қолданады.

2. Техникалық ферментті препараттар. Оның бірі амилолетикалық комплекстік ферментті препараттар (АКФП). Оны зең саңырауқұлақтарды қоректік ортада өсіріп, кептіріп, алынған массаны ұсақтау арқылы алады. Бұл препараттың активті түрін саңырауқұлақ солодты экстракциялап, буландыру, кептіру арқылы алады. Ал ең активті ферменттік препаратты культуралдық сұйықтықтан амилазаны ацетонмен тұндыру арқылы алуға болады. Тұндырылғаннан ейін оны коагулятпен 27-28^оС кептіреді. Ферменттердің тұндырылуы үшін аммоний сульфатын қолданады. Алдын ала культуралды сұйықтықта 40^оС та 40% құрғақ зат пайда болғанша кептіреді.

Саңырауқұлақты солод. Қазіргі кезде мал шаруашылығында, спирт және сыра өндірісінде құрғақ амилолептикалық ферменттерді көп қолдана бастады. Бұл препаратты саңырауқұлақты солод деп жиі айтады. Оны алу үшін таза культураны колбада, одан кейін кюветтерде көбейтеді. Осы стадияларда қоректік ортаны стерильді бидай кебектерін пайдаланады. Оны автоклавта 1 сағат 0,1 МПа қысым астында стерильдейді. Кебектің ылғалдылығы 45% жеткізіп, оны тұз немесе күкіт қышқылымен қышқылдандырады. Салқындатылған кебек үстіне таза культура егіп, 30^оС кезінде 3-4 тәулік ішінде культивирлейді. Бұл кезде қоректік ортада споралар пайда болады. Кюветтерде таза культураны 10-12 сағат 32-33 ^оС температурада, содан соң 27-28 ^оС массалық спорулляцияға дейін өсіреді. Таза культураны жақсы сақтау үшін оны сол кюветтерде кептіреді, ылғалдылығы 20-25% жеткенше. Ол үшін 40 ^оС ыстық ауа жібереді. Осы культураны екі апта сақтауға болады. Кюветтерді стерильдеу үшін негізгі ферментаторларда араластырғышы бар ағынды бу және суытатын қондырғылары бар арнайы аппаратта өтеді. Кюветтерді суыту үшін стерильденген ауа пайдаланылады. Алдымен шнек арқылы аппаратқа кебек енгізеді, содан кейін 0,2% формалин қосып отырады, оны сумен сұйылтады, араластырғыш арқылы кебек арасына 100-105 ^оС бар ауа өткізеді 50-60 минут. Содан кейін кебекті сумен немесе 37^оС ауамен суытады. Масса ылғалдылығын 56-58% келтіреді. Ол үшін салқын қайнаған су қолданылады. Оны таза культура қосып жақсылап араластырады. Осы массаны кюветтерге салады да, арнайы полкаларға қояды. Кюветтің көлемі 0,5м² , һ 25мм. Олар перфорирленген қаңылтырмен жасалады. Камераны кюветтермен толытру алдында оларды 8 сағат бумен немесе формалинмен стерильдейді және 3-4 сағат стерильденген ауамен желдетеді. Зең саңырауқұлақтарын 2 кезеңде өсіреді:

1) 8-10 сағат 32-33^оС температурада аэрациямен, 92-93% ылғалды ауамен споралар ісінеді және өледі.

2) амилаза ферментіне бай мицеллалар пайда болады, температурасы 26-28^оС ауа ылғалдылығы 96-100% ауаның алмасуын жоғарылатады. Ауаның жылдамдығы 1-1,5 м/с. 24-36 сағат ішінде кебек ақ жұмсақ мицелимен өсіп кетеді. Ылғалдылығы 38-40% . Өсіп шыққан мицелиді 40-45 ^оС ауамен кептіреді және ұсақтайды, одан кейін 10-14% ылғал болғанша 85-90 ^оС кептіреді.

1. Трансформациялау принципі

2. Сорбиттің L-сорбозаға трансформациясы
1. Кейінгі жылдары микробиологиялық зерттеулерде, сонымен қатар өнеркәсіпте микроорганизмдерді қолданудың жаңа әдістері табылуда. Микроорганизм ферменттерінің көмегімен органикалық заттардың молекуласындағы жеке бөліктерді өзгерту мүмкіндігі ашылды – микробиологиялық заттардың трансформациясы жүрді. Биосинтез және ашу процестерде ферменттердің көптеген мөлшері қатысатын болса, микробиологиялық трансформацияда тек белгілі бір фермент қана қатысады, ол тотығуды, декорбоксильденуді, метилденуді немесе басқа қандай да бір реакцияны катализдейді.

Қандай да бір заттың трансформациясын жүргізу үшін алдымен сәйкес микроорганизмнің культурасын трансформирленетін ерітіндінің көлемінен 5-10%-ке тең етіп көбейтеді. Заттың трансформациясы үшін ерітіндіні біріншіден, трансформирленетеін заттың максимальді мәнінн ерітуге болады (әдетте 10—25%) және екіншіден, культураның өсуіне қажетті қоректік тұздардың максимальді мөлешерін қолдану қажет, бірақ ол заттардың химиялық бөлінуін қиындатпау керек. Егер трансформирленетін зат суда ерімейтін болса, оны алдын-ала органикалық бейтарап еріткіште ерітіп алады, одан кейін интенсивті араластыру арқылы оны негізгі ортамен араластырады. Процесстің ұзақтығы әдетте 1-2 тәулік. Микробиологиялық трансформациядан кейін заттардың ерітіндіден химиялық бөлінуін жүреді.

Органикалық заттардың микробиологиялық трансформациясын келесі топтарға бөлуге болады.

1) тотығу реакциялары: активтендірілімеген көміртегінің гидроксильденуі, олефиндердің тотығуы, алкилді топтардың тотығуы, ароматты сақинаның микробиологиялық гидроксильденуі, ароматты қосылыстардың сақинаны бұза отырып тотығуы, май қышқылдарының fj-тотығуы, дегидрирлену, карбонильді топтардың карбонильдерге және карбоксиьлдерге, альдегидтердің карбоксильдерге, метилдердің карбоксильдерге және екіншілік карбонильді топтардың кетотоптарға тотығуы, циклді спирттердің дегидрогенизациясы, аминотпотардың нитротоптарға тоығуы, аминотоптардың гидроксильді топтарға тотығып алмасуы, тиоэфирлердің сульфоксидтер мен сульфондарға дейін тотығуы, N-оксидті топтарды енгізу, циклопарафиндердің циклокетондарға дейін тотығуы, тотығудың аралас типтері;

2) тотықсыздану реакциялары: альдегидтердің біріншілік спирттерге дейін тотықсыздануы, кетон және дикетондардың тотықсыздануы, қос байланыстардың гидрирленуі, нитротоптардың тотықсыздануы, біріншілік және екіншілік спирттердің тотықсыздануы, альдегидтердің меркатпоқосылыстарға трансформациясы, күкірт құрамды қосылыстардың тотығуы және т.б;

3) декарбоксильдену: соңғы металды топты түзу арқылы органикалық қышқылдардың декорбоксильденуі, карбон қышқылдарын түзу арқылы кетоқышқылдарыдң тотығып декарбоксильденуі, кетоқышқылдардың спирттерге тотықсызданып декарбоксильденуі, аминдерді және аминқышқылдарын түзу арқылы аминқышлықладрының декарбоксильденуі, моноаминқышқылдарының спирттерге және оксиқышқылдарға айналуы, декарбоксильденудің аралас типтері.

4) дезаминдену реакциялары: аминқышқылдарының карбон қышқылдарына, аминқышқылдардың кето және окси қышқылдарына, амидтердің спирттерге, аминдердің альдегидтер мен кетондарға, аминдердің сәйкес карбон қышқыолдарына дейін тотығып дезаминденуі, дезаминденудің аралас типтері;

5) гликозидтердің түзілуі, мысалы глюкозадан мальтозаның дрожжылар арқылы синтезделуі;

6) гидролиз: эфирлердің жуылуы, гликозидті байланыстың гидролизі, амидтердің гидролизі, ақуыздардың гидролизі және т.б.;

7) метильдену реакциялары;

8) этерификация, соның ішінде фосфорилирлену және ацетилирлену;

9) дегидратация;

10) конденсация реакциялары;

11) аминирлену және амидтену;

12) диметоксильдену реакциялары;

13) нуклеотизация;

14) галогендену;

15) деметильдену;

16) ассиметризация;

17) рацемизация;

18) изомеризация.
Белгілі бір қосылыстардың берілген реакция типтерімен микробиологиялық трансформациясы үшін микроорганизм культураларын таңдау эмпирикалық жолмен жүзеге асады. Алайда қажетті трансформацияның жүзеге асуы үшін микроорганизмдердің белгілі бір топтарын да ұсынуға болады, мысалы, полиолдардың окситоптарының тотығуы үшін Acetobacter және Acetomonas культураларын қолдануға болады, аминотоптардың нитротоптарға тотығуы үшін Streptomyces, дезаминдену үшін-дрожжылар, стероидтардың гидроксильденуі үшін – саңырауқұлақтар және т.б қолдануға болады. Микробиологиялық трансформацияға арналған культуралардың арнайы альбомы болады.

Органикалық қосылыстардың трансформациясы үшін қолданылатын технологиялық әдістерді келесі топтарға бөлуге болады:

1) өсіп жатқан культураларды қолдану арқылы периодты жағдайлардағы

трансформациялау;

2) көбеймейтін жасушаларды қолдану;

3) споралар арқылы трансформация;

4) дезинтегрирленген жасушаларды қолдану;

5) микроорганизмдердің иммобильденген жасушаларын қолдану арқылы трансформациялау;

6) микроорганизмдерден бөлініп алынған иммобильденген ферментті препараттарды трансформацияда қолдану;

7) үздіксіз әдістер.

Аскорбин қышқылын алудың технологиялық процесі бес кезеңнен тұрады:

1) D-сорбиттен D-глюкозаны соңғы сутегіні каталитикалық тотықсыздануы арқылы 8—12 МПа және 130—135°С температурада алады;

2) L-сорбозаны D-сорбиттен сірке қышқылды бактерияларды қолдану арқылы микробиологиялық трансформациялау жолымен алады;

3) диацетон L-сорбозаны сорбозадан оны күкірт қышқылының (катализатор) қатысуымен ацетонмен өңдеу арқылы алады. Одан кейін ацетонды айдайды, ал диацетонсорбозаны сілтімен бөліп алады;

4) диацетонсорбозаның калий перманганатымен немесе натрий гипохлоридімен сілтілі ортада диацетон-2-кето-1-гулон қышқылы гидратына дейін тотығуы, соңғысының тұз қышқылы көмегімен бөлінуі,

5) диацетон-2-кето-1-гулон қышқылы гидратының хлороформ немесе дихлорэтанның қатысуымен аскорбин қышқылына енолизациялануы және лактонизациялануы. Катализатор ретінде хлорлы сутегін қолданады. Одан кейін аскорбин қышқылын қайта кристалдануға ұшыратады.