Спинномозговая жидкость (ликвор)

Спинномозговую жидкость в количестве не менее 1 мл собирают, используя одноразовые иглы, в одноразовые пластиковые пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл.

Не требуется.

- при температуре от 2 ⁰С до 8 ⁰С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 ⁰С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

1.6. Биопсийный и аутопсийный материал.

Взятие материала.

Материал забирают из зоны предполагаемого местонахождения возбудителя инфекции, из поврежденной ткани или из пограничного с поврежденным местом участка. Кусочки ткани диаметром не более 5 мм помещают в одноразовые стерильные пробирки объемом 2 мл, содержащих соответствующую транспортную среду. Пробирку плотно закрывают. Макроаутоптат помещают в контейнер с физиологическим раствором или транспортной средой № 2.

При выявлении бактериальных агентов процесс подготовки макробиоптатов (макроаутоптатов) аналогичен, только ступку и изотонический раствор не охлаждают.

По другому способу биоптат непосредственно перед выделением нуклеиновых кислот помещают в жидкий азот, затем аккуратно измельчают его пестиком в предварительно охлажденной жидким азотом фарфоровой ступке. Взвешивают 100 мг кусочков ткани и растирают их в ступке в жидком азоте до порошка. Затем для выделения РНК порошок переносят в гомогенизатор и следуют инструкции по выделению РНК. Для выделения ДНК к полученному порошку добавляют равный объем стерильного физиологического раствора (0,1 мл), тщательно перемешивают и отбирают необходимый объем материала согласно инструкции для выделения ДНК.

Фарфоровая посуда, а также гомогенизаторы должны быть предварительно обработаны хромпиком и простерилизованы. При гомогенизации нескольких образцов необходимо после каждой пробы протирать поверхность стола 0,2%-ным раствором ДП-2Т, затем водой и 70%-ным этиловым спиртом и менять перед обработкой следующей пробы перчатки.

Образцы биопсийного и аутопсийного материала, предназначенного для выделения ДНК или РНК:

- при комнатной температуре – в течение 6 часов;

- при температуре от 2⁰С до 8 ⁰С - в течение 3 суток;

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 ⁰С - длительно.

Взятие материала осуществляют в количестве не менее 1,0 мл в одноразовые градуированные стерильные флаконы с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не менее 50 мл.

Перед выделением нуклеиновых кислот необходимо провести разжижение мокроты, используя раствор "Муколизин" (Na₂HPO₄ 77,4 мМ, NaH₂PO₄ 22,6 мМ, бета-МЭ 99,4 мМ, 5%-ный азид натрия в конечной концентрации 0,05%). В емкость с мокротой добавляют "Муколизин" в соотношении 5:1 (5 частей "Муколизина" к 1 части мокроты), ориентируясь по градуировке емкости и стерильные стеклянные бусы. В процессе разжижения мокроты (20 - 30 мин.) емкость периодически встряхивают. Затем автоматической пипеткой, используя наконечник с фильтром, отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в пробирку с завинчивающейся крышкой или в микроцентрифужную пробирку с защелкой на 1,5 мл и центрифугируют при 5000-7000 g в течение 10 мин. Удалить 0,8 мл надосадочной жидкости, осадок клеток перемешать с 0,2 мл оставшейся жидкости

Допускается выделение ДНК/РНК из 0,1 мл разжиженной мокроты без стадии центрифугирования.

Условия хранения и перевозки материала и предварительно обработанных проб:

- при комнатной температуре - в течение 6 часов;

- при температуре от 2⁰С до 8 ⁰С - в течение 3 суток;

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 ⁰С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Взятие материала осуществляют в одноразовые, плотно завинчивающиеся пробирки объемом 50 мл.

Промывные воды бронхов или бронхо-альвеолярный лаваж перемешивают переворачиванием пробирки. Автоматической пипеткой, используя наконечник с фильтром, отбирают 1 мл клинического материала, помещают в пробирку с завинчивающейся крышкой или пробирку с защелкой на 1,5 мл и центрифугируют при 7000 g в течение 10 мин. Удалить 0,9 мл надосадочной жидкости, осадок клеток перемешать с 0,1 мл оставшейся жидкости.

- при температуре от 2⁰С до 8 ⁰С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 ⁰С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

1.9. Мазки из полости носа.

Взятие материала.

Мазки (слизь) берут сухими стерильными ватными тампонами на пластиковой основе. Тампон вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2 - 3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с защелкивающейся крышкой, содержащую соответствующую транспортную среду (например, № 2) и аккуратно обламывают пластиковый стержень на расстоянии не более 0,5 см от рабочей части, оставляя рабочую часть зонда с материалом в транспортной среде. Пробирку плотно закрывают крышкой.

Не требуется.

- при комнатной температуре - в течение 6 ч;

- при температуре от 2 ⁰С до 8 ⁰С - в течение 3 суток;

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 ⁰С - длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами на пластиковой основе вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку со специальной транспортной средой (например, № 2) и аккуратно обламывают пластиковый стержень на расстоянии не более 0,5 см от рабочей части, оставляя рабочую часть зонда с материалом в транспортной среде. Пробирку плотно закрывают крышкой.

Не требуется.

- при комнатной температуре - в течение 6 ч;

- при температуре от 2 ⁰С до 8 ⁰С - в течение 3 суток;

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 ⁰С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Взятие материала проводят в положении больного сидя с отклоненной назад головой путем введения с помощью одноразового шприца (зонда) теплого стерильного изотонического раствора натрия хлорида (3-5 мл) поочередно в каждый из носовых ходов. Промывную жидкость собирают через стерильную воронку в одну стерильную пробирку.

Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания паром под давлением.

Предварительная обработка проб.

Не требуется.

- при температуре от 2 ⁰С до 8 ⁰С - в течение 6 ч;

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 ⁰С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

1.12. Смывы из ротоглотки.

Взятие материала.

Перед взятием смывов из ротоглотки проводят предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10 - 15 с) 25 - 40 мл изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через стерильную воронку в стерильный флакон на 50 мл.

Не требуется.

- при комнатной температуре - в течение 6 ч;

- при температуре от 2 ⁰С до 8 ⁰С - в течение 3 суток;

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 ⁰С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Взятие материала производят стерильным шприцем. Если бубон имеет сохранившуюся кожу (не вскрывшийся бубон), то ее протирают предварительно спиртом. Пункцию бубона производят как в его центре, так и на периферии. Из вскрывшегося бубона материал забирают в местах с сохраненной тканью, а также берут отделяемое бубона. Исследуемый материал в количестве 0,1 - 0,3 мл помещают в пробирку с транспортной средой № 2 или ESP (см. п. 2).

Не требуется.

- при температуре от 2⁰С до 8 ⁰С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 ⁰С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

1.14. Везикулы, пустулы.

Взятие материала.

Перед взятием материала кожные элементы очищают ватным тампоном, смоченным эфиром или спиртом, затем прокалывают их у основания стерильной иглой или тонким капилляром пастеровской пипетки. Для ускорения поступления материала элемент сверху надавливают пинцетом. Корку или верхнюю часть везикул отделяют от кожи иглой, скальпелем. Исследуемый материал помещают в пробирку с транспортной средой N 2 или ESP (см. п. 2) или другой транспортной средой, рекомендованной производителем.

В соответствии с п. 1.12.

После взятия и доставки материала в лабораторию комаров, клещей, блох и вшей их обрабатывают эфиром до обездвижения, нанося каплю эфира на ватно-марлевую пробку. После определения вида и пола материал может быть объединен в пулы в зависимости от вида, пола, места и даты сбора и помещен в сухие чистые пробирки объемом 1,5 мл.

Группировку проб осуществляют в соответствии с МУ 3.1.1027-01 "Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций". При исследовании на чуму в одну пробу включают по 20 - 30 (не более 50) блох или мелких клещей, вшей. Иксодовых клещей при исследовании на чуму и другие природно-очаговые инфекции исследуют отдельно по фазам развития и в одну пробу берут пивших самок не более трех, голодных - до 30; нифм пивших - до 15, голодных - до 50; личинок пивших - до 30. При исследовании на туляремию в одну пробу объединяют до 50 имаго иксодовых клещей, 50 - 100 нифм и 100 - 200 личинок. Блох, гамазовых клещей, вшей исследуют до 100 особей в пробе. Из кровососущих двукрылых группируют пробы, включая в одну до 100 комаров, до 250 мошек и 20 - 25 слепней. При исследовании на арбовирусные инфекции комаров объединяют в пулы по 50 - 100 экземпляров. При необходимости проводят исследования отдельных особей.

Предварительная обработка проб:

- клещей помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, куда вносят 1 мл 96%-ного этанола, встряхивают на вортексе и центрифугируют в течение 3 - 5 с при 2000 g для удаления капель с крышки пробирки;

- с помощью вакуумного отсасывателя отдельными наконечниками для каждой пробы удаляют спирт из пробирки;

- вносят в пробирку 1 мл 0,15 М раствора хлорида натрия, встряхивают пробирку и осаждают капли с крышки пробирки на микроцентрифуге в течение 3 - 5 с при 2000 g;

- с помощью вакуумного отсасывателя отдельными наконечниками для каждой пробы удаляют раствор хлорида натрия из пробирки;

- переносят клещей в стерильную фарфоровую чашку, добавляют 0,7-1,0 мл

0,15 М раствора хлорида натрия и гомогенизируют пробу;

- наконечником с фильтром переносят пробу в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 1200g в течение 2 мин. для осветления пробы.

РНК и ДНК выделяют из 0,1 мл надосадочной жидкости.

При выделении РНК и ДНК из комаров, блох и вшей используют данную методику обработки проб, за исключением этапов отмывки в 96%-ном этаноле и 0,15 М растворе хлорида натрия. Насекомых сразу гомогенизируют в стерильной ступке в 0,15 М растворе хлорида натрия.

Материал после разбора и формирования проб:

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 ⁰С или в сосуде Дьюара с жидким азотом - длительно.

Обработанный материал (после гомогенизации и осветления) хранится длительно при температуре минус 70 ⁰С или в сосуде Дьюара с жидким азотом.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Пробы отбирают с соблюдением правил асептики в стерильные широкогорлые банки с помощью стерильной ложки, пинцета или ножа. Края банок обжигают над пламенем спиртовки. После закладки проб банки закрывают стерильной бумагой и перевязывают.

Твердые пищевые продукты в количестве 1 - 10 г помещают в стерильную ступку, добавляют 0,9%-ный раствор натрия хлорида в соотношении 1:10 и растирают до гомогенного состояния. Отстаивают и через ватный тампон отбирают надосадочную жидкость, из которой проводят выделение ДНК. Жидкие пищевые продукты в объеме 0,2 мл переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл или 2,0 мл для выделения ДНК.

- при температуре от 2⁰С до 8 ⁰С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20 ⁰С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70 ⁰С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

2.2. Почва, трава, фураж, подстилка.

Взятие материала.

Пробы почвы с мест вероятного обсеменения патогенными микроорганизмами (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут в количестве 20 - 30 г на глубине до 15 см, на территории скотомогильников - на глубине до 2 м с помощью почвенных буров. При этом верхний слой почвы (2 - 3 см) снимают.

Пробы фуража берут из поверхностного слоя - не менее 400 г на 4 кв. м поверхности при незатаренном типе хранения. Из брикетированного корма срезают верхний слой брикета. Отбор проб проводят сухим стерильным пробным щупом. Пробы грубых кормов (сено, солома) берут из разных мест скирды при помощи ножниц и пинцета из расчета одна проба (40 г) на 4 кв. м площади скирды. Отобранные навески сена и соломы измельчают при помощи ножниц и пинцета на листе бумаги, затем помещают в банки. Зеленую массу, срезанную ножницами, помещают пинцетом в пробирку или в банку.

Предварительная обработка проб.

К исследуемому материалу добавляют 0,9%-ный раствор натрия хлорида 1:10, тщательно перемешивают в течение 15 мин., отстаивают в течение 10 мин. для оседания крупных частиц. Надосадочную жидкость дробно центрифугируют: первоначально в течение 2 - 3 мин. при 2000g, затем супернатант центрифугируют в течение 15 мин. при 10000g. Осадок ресуспендируют в 0,2 - 0,5 мл дистиллированной воды.

В соответствии с п. 2.1.

Водопроводную воду и воду из поверхностных водоемов для исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах по 500 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой. Из водопроводных кранов отбор проб воды производят после предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в течение 10 мин. при полном открытии крана.

Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования двумя способами: в объеме 1 л в двух емкостях по 500 мл или тампонами, приготовленными из марлевых салфеток размером 10 х 15 см в 10 - 15 слоев. Последние закрепляют у места забора воды, через 1 сутки помещают в стерильную банку, содержащую физиологический раствор.

Смывы с поверхностей берут стерильными ватными тампонами или марлевыми салфетками. Перед взятием смывов тампоны или салфетки смачивают стерильным физиологическим раствором. После взятия смыва тампон (салфетку) погружают в емкость с физиологическим раствором.

При выявлении бактериальных агентов и возбудителей микозов подготовку проб осуществляют методом дробного центрифугирования или вакуумной фильтрации на фильтры с размерами пор 0,45 и 0,65, 0,8, 1,2 мкм, соответственно. При выявлении вирусных агентов для подготовки проб используют только вакуумную фильтрацию на фильтры с размерами пор 0,2 мкм.

Из отобранных образцов переносят по 125 мл в 4 центрифужных стакана объемом 250 мл с завинчивающимися крышками (или по 80 мл в 6 центрифужных пробирок, или по 50 мл в 10 центрифужных пробирок) и центрифугируют в течение 15 мин при 10000g. После этого осадок в каждом стакане (пробирке) ресуспендируют в 0,2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Полученные суспензии переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл или 2,0 мл и центрифугируют при 10000g в течение 1 мин. Надосадочную жидкость отбирают наконечником с фильтром в микропробирку объемом 1,5 мл. Для выделения ДНК используют 0,1 - 0,2 мл надосадочной фракции.

Возможно центрифугирование одной пробы в одном центрифужном стакане (пробирке). Для этого в центрифужный стакан (пробирку) переносят пробу в объеме 50-125 мл и центрифугируют в течение 15 мин при 10000g, надосадочную жидкость удаляют, и в стакан (пробирку) снова добавляют соответствующий объем исследуемой пробы. Аналогичным образом центрифугируют весь объем исследуемой пробы. После последнего центрифугирования осадок ресуспендируют в 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и центрифугируют при 10000g в течение 1 мин. Надосадочную жидкость отбирают наконечником с фильтром в микропробирку объемом 1,5 мл. Для выделения ДНК используют 0,1 - 0,2 мл надосадочной фракции.

Вакуумная фильтрация

Для исследования используют стерильные фильтры с соответствующими размерами пор. В случае сильной загрязненности исходного образца воды механическими или масляными примесями, определяемыми визуально, его предварительно фильтруют на стеклянной воронке через стерильный ватно-марлевый или бумажный фильтр. Подготовленную таким образом воду пропускают через мембранный фильтр. После окончания фильтрации мембранные фильтры переносят обожженным анатомическим пинцетом в стерильный флакон (чашку Петри) или стерильный пластиковый пакет типа «Вихрь» объемом 100 мл, содержащих 10 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Воду после фильтрации обеззараживают добавлением сухой хлорной извести из расчета 200 г на 1 л. Для сорбции бактерий и вирусов с фильтра флакон встряхивают в течение 10 мин с помощью шейкера, фильтр внутри пакета типа «Вихрь» растирают вручную в течение 1 мин, фильтр, помещенный в чашку Петри, разрезают на мелкие куски ножницами инкубируют при покачивании в течение 10 мин. Далее смыв с поверхности фильтра переносят в стерильную пробирку. Для исследования методом ПЦР отбирают 1 мл в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10000g в течение 10 мин. При выявлении бактериальных агентов оставляют 0,1 мл надосадочной жидкости, в которой ресуспендируют осадок. Из полученной суспензии проводят выделение ДНК. При выявлении вирусных агентов для выделения нуклеиновых кислот используют 0,1-0,2 мл надосадочной жидкости.

В соответствии с п. 2.1.

2. Центрифуга для пробирок объемом 5 - 100 мл до 3 тыс. об/мин.

3. Микроцентрифуга/вортекс.

4. Настольная центрифуга для микропробирок типа «Эппендорф» объемом 1,5 -2 мл до 10000g.

5. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур 25 – 100 ⁰С.

6. Термостатируемый шейкер для пробирок.

7. Установка для фильтрования воды с набором фильтров.

8. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.

9. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл или 2,0 мл.

10. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 200 и до 1000 мкл.

11. Штативы для наконечников, микропробирок объемом 1,5 мл.

12. Комбинированный холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 ⁰С и не выше минус 16 ⁰С (для хранения исследуемого материала). Возможно, отдельное использование холодильника с камерой поддерживающей температуру от 2 до 8 ⁰С и морозильника, с камерой поддерживающей температуру не выше минус 16 ⁰С.

13. Морозильная камера на минус 70 ⁰С (при необходимости, в случае длительного хранения материала).

14. Емкость с регламентируемым дезинфицирующим раствором.

15. Емкость с 70 % этиловым спиртом.