Методические указания му 2569 -09 Издание официальное

2. Микроцентрифуга/вортекс.

3. Настольная центрифуга для микропробирок типа «Эппендорф» объемом 1,5 -2 мл до 10000g.

4. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур 25 - 100 ⁰С.

5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой.

6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.

7. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл или 2,0 мл.

8. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 200 и до 1000 мкл.

9. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мкл.

10. Штативы для наконечников, микропробирок на 1,5 мл.

11. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 ⁰С и не выше минус 16 ⁰С (для хранения наборов, предназначенных для выделения нуклеиновых кислот). Возможно, отдельное использование холодильника с камерой поддерживающей температуру от 2 до 8 ⁰С и морозильника, с камерой поддерживающей температуру не выше минус 16 ⁰С.

12. Холодильник с камерой поддерживающей температуру от 2 до 8 ⁰С (для хранения препаратов нуклеиновых кислот). Не допускается хранение препаратов нуклеиновых кислот в одном холодильнике с компонентами набора для выделения нуклеиновых кислот;

13. Емкость с дезинфицирующим раствором.

14. При исследовании материала, подозрительного на зараженность возбудителями III-IV групп патогенности, не образующими спор, допускается использование автоматизированного оборудования для выделения нуклеиновых кислот.

2. Программируемые термоциклеры (персональные, многомодульные, с функцией амплификации в режиме «реального времени») и автоматизированные станции.

2.1. Выбор термоциклера или автоматизированной станции определяется методами амплификации нуклеиновых кислот и коммерческими наборами реагентов, используемыми в лаборатории, характером выполняемых задач и финансовыми возможностями.

3. Флуориметр (флуоресцентный детектор), только при использовании учета продуктов амплификации гибридизационо – флюоресцентным методом детекции по конечной точке.

4. Микроцентрифуга/вортекс.

5. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.

6. Одноразовые полипропиленовые пробирки для амплификации объемом 0,5 (0,2) мл.

7. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 10 мкл, 100 мкл и 200 мкл, свободные от РНКаз.

8. Штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 (0,2) мл.

9. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 ⁰С и от минус 18⁰С до минус 25 ⁰С (для хранения наборов, предназначенных для проведения обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот). Возможно, отдельное использование холодильника с камерой поддерживающей температуру от 2 до 8 ⁰С и морозильника, с камерой поддерживающей температуру от минус 18⁰С до минус 25 ⁰С.

10. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.

11. С целью автоматизации процедуры приготовления реакционных смесей для амплификации допускается использование автоматизированного оборудования для раскапывания реагентов.

1. 
   Камера для горизонтального электрофореза.
   
2. 
   Источник постоянного тока с напряжением 150 - 460 В.
   
3. 
   Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей.
   
4. 
   Видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов.
   
5. 
   Компьютер (должен быть связан через компьютерную сеть с компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для анализа результатов электрофореза).
   
6. 
   Аквадистиллятор.
   
7. 
   Микроволновая печь или другой нагревательный прибор для плавления агарозы.
   
8. 
   Колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы объемом 250 мл.
   
9. 
   Мерные цилиндры объемом 100 мл и 1000 мл.
   
10. 
    Столик и набор гребенок для приготовления геля.
    
11. 
    Штатив для микропробирок на 0,5 мл.
    
12. 
    Отдельная автоматическая пипетка переменного объема до 100 мкл.
    
13. 
    Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мкл в штативе.
    
14. 
    Холодильник с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 8 ⁰С (для хранения наборов электрофоретической детекции).
    
15. 
    Емкость с дезинфицирующим раствором для сброса отработанных расходных материалов.
    
16. 
    Пластиковая емкость объемом 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.
    

*Дополнительное оборудование и расходные материалы, требуемые для осуществления очистки продуктов амплификации (секвенирование).

• 
  стерильный ламинарный шкаф;
  
• 
  твердотельный термостат для пробирок типа «Эппендорф» на 25-100 °С;
  
• 
  микроцентрифуга от 10000g до 12000g для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл или 2,0 мл;
  
• 
  микроцентрифуга/вортекс;
  
• 
  вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости;
  
• 
  отдельный набор автоматических пипеток переменного объема;
  
• 
  одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки объемом 1,5 мл или 2,0 мл;
  
• 
  штативы для микропробирок объемом 1,5 мл или 2,0 мл и наконечников;
  
• 
  одноразовые наконечники для пипеток переменного объема в штативах до 200 мкл и до 1000 мкл;
  
• 
  одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл;
  
• 
  холодильник от 2 до 8 С с морозильной камерой не выше минус 16 °С;
  

Для гибридизационно-ферментной детекции продуктов амплификации.

2. Вошер (не обязательно).

3. Планшетный спектрофотометр.

4. Компьютер (должен быть связан через компьютерную сеть с компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для анализа результатов гибридизации).

5. Восьмиканальная пипетка до 200 мкл.

6. Отдельный набор одноканальных автоматических пипеток переменного объема.

7. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема.

8. Мерный цилиндр объемом 1 л.

9. Комбинированный холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 ⁰С (для хранения наборов ГиФА) и не выше минус 16 ⁰С (для хранения ампликонов).

10. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.

1. Автоматический секвенатор;

2. Компьютер (должен быть связан через компьютерную сеть с компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для анализа результатов секвенирования);

3. Источник постоянного тока с напряжением 150 - 460 В.

4. Вортекс;

5. Флуориметр или спектрофотометр;

6. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» на 25-100 °С;

7. Холодильник с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 8 ⁰С;

8. Центрифуга;

9.Отдельный набор одноканальных автоматических пипеток переменного объема.

10. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема.

11. Штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 (0,2) мл.

12. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.

Для гибридизации и анализа продуктов амплификации с помощью ДНК-чипов.

1. Термостат планшетный, поддерживающий температуру 37-60⁰С.

2. Термостат для пробирок на 200, 500 мкл, поддерживающий температуру 24-99⁰С.

3. Вошер-инкубатор специализированный для биочипов.

4. Мультиканальный флуоресцентный сканер для биочипов в комплекте с управляющим компьютером (должен быть связан через компьютерную сеть с компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для анализа результатов анализа)..

5. Центрифуга низкоскоростная (до 1200g) для больших пробирок (50 мл).

6. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 ⁰С и от минус 18⁰С.

7. Отдельный набор одноканальных автоматических пипеток переменного объема.

8. Восьмиканальная пипетка до 200 мкл.

9. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема.

10. Штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 (0,2) мл.

11. Емкость для сброса отработанных материалов.

2. Обработка исследуемого материала, инфицированного бактериями I–IV групп патогенности и возбудителями глубоких микозов.

2.1. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами I–II групп патогенности (бактериями, не образующими споры, хламидиями, риккетсиями и возбудителями глубоких микозов), проводится следующим способом:

К исследуемому образцу добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) и прогревают его при 56 ⁰С в течение 30 мин. Затем, 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинизотиоцианата, в объеме указанном в инструкции по применению к набору реагентов и инкубируют 15 мин при 65 ⁰С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

2.2. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами III-IV групп патогенности (вирусами, хламидиями, риккетсиями и бактериями, не образующими споры) проводится одним из следующих способов:

2.2.1. Способ-1. Прогревание исследуемого образца при 100 ⁰С в течение 30 мин.

2.2.2. Способ-2. К 100 мкл исследуемого образца добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов (тест-системе) с последующей его инкубацией в течение 15 мин. при 65 ⁰С.

После выполнения процедуры 2.2.1. или 2.2.2. материал считается обеззараженным.

2.3. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) бактериями II–IV групп патогенности, образующими споры, проводится следующим способом:

Исследуемый материал в количестве 0,1 мл засевают в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера, рН 7,2 и инкубируют с аэрацией при 37 ⁰С в течение 2,5 ч. Добавляют пенициллин до конечной концентрации 1000 ед/мл и инкубируют при 37 ⁰С в течение 15 мин. После инкубации с пенициллином, исследуемый материал прогревают на водяной бане в течение 10 мин. при температуре 100 ⁰С. Затем 100 мкл обработанного образца переносят в пробирки объемом 1,5 мл и добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинтиоизоцианата в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов, и инкубируют 15 мин при 65 ⁰С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3. Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусами I–II групп патогенности.

3.1. Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусом натуральной оспы, проводится следующим способом:

Материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 400 мкл лизирующего буферного раствора, содержащего 100 мМ Tрис-HCl (pH=8), 100 мM ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1% SDS, и инкубируют 10 мин при температуре 65 ^оС. Добавляют 50 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл), перемешивают и инкубируют в течение 1 часа при 56 ^оС. Центрифугируют в течение 5 мин при 14000 об/мин для осаждения нерастворенных частиц. Супернатант переносят в стерильные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют равный объема смеси фенол/хлороформ (pH 8,0) и тщательно перемешивают. Затем центрифугируют в течение 5 мин при 10000 g. Переносят верхнюю водную фазу, содержащую раствор фенола и ДНК, в новую пробирку, добавляют 1/10 по объему 3 М ацетата натрия (pH 5.5), 30–40 мкг РНК-носителя (1 мкл раствора РНК-носителя с концентрацией 30–40 мкг/мкл) и равный объем изопропанола. Затем центрифугируют в течение 15 мин при 10000 g при 4 ⁰С. Полученный осадок промывают добавлением 1 мл 70 % этанола и центрифугированием в течение 5 мин при 14000 об/мин при 4 ⁰С.

После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3.2. Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусами I–II групп патогенности (кроме вируса оспы), содержащего инфекционную (позитивную) РНК, проводится следующим способом:

Материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл лизирующего буфера на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и фенола (1:1), и инкубируют 20 мин при температуре 65 ⁰С. Затем выделяют РНК, используя метод нуклеосорбции на силикагеле, начиная с этапа добавления сорбента, либо метод осаждения РНК этанолом в присутствии 0,3 М ацетата натрия. Обратную транскрипцию выполняют в соответствии с инструкцией по применению к набору реагентов. Затем в образцы с кДНК добавляют РНКазу А до конечной концентрации 25 мкг/мл. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3.3. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) вирусами I-II групп патогенности, содержащих неинфекционную (негативную) РНК или ДНК проводится следующим образом:

Материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл лизирующего буфера, на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и фенола (1:1) и инкубируют 20 мин при температуре 65 ⁰С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

3.4. Обработка исследуемого материала, подозрительного на
инфицирование высокопатогенным неизвестным возбудителем, проводится в соответствии с пп. 2.3. и (или) 3.1. Работа с таким материалом, на всех этапах исследования, осуществляется с применением специальных средств индивидуальной защиты согласно Приложению 4.

4. В Рабочие зоны 2, 3, 4-1 и 4-2 передаются только обработанные пробы, не содержащие инфекционный материал.

5. Обеззараживание остатков исследуемого материала в Рабочей зоне 1 осуществляют в соответствии с СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08.
Приложение 6
Порядок обеззараживания и утилизации отработанного исследуемого

материала и отходов после проведения исследований.

Обработка рабочей одежды.
1. Дезинфицирующие растворы, после обработки ими исследуемого материала и истечения времени их экспозиции, сливают в канализацию, открытую емкость с обработанным материалом помещают в плотный термостойкий пакет (контейнер) для последующего автоклавирования под давлением 2,0 кГс/кв. см (0,2 МПа) при температуре 132 ± 2 ⁰С в течение 60 мин.

1.1. После автоклавирования пакет с инактивированным материалом выносят в контейнер для мусора с последующим вывозом на полигон бытовых отходов или на сжигание в специальных печах.

2. Обеззараживание пробирок с ампликонами, расходного материала, перчаток в Рабочей зоне 3 (помещении):

2.1. Использованные пробирки с ампликонами (исключая пробирки с ампликонами, передаваемые для анализа в Рабочие зоны 4-1 и 4-2), наконечники, перчатки, ветошь для обработки поверхностей в боксе биологической защиты или ПЦР-боксе собирают в пластиковые закрывающиеся емкости, выносят в Рабочую зону 4-1 с целью последующей инактивации.

При ее отсутствии отходы переносят в специально-предназначенное вспомогательное помещение, где проводят их инактивацию.

2.2. Утилизацию остатков растворов, содержащих гуанидинизотиоцианат, осуществляют путем их двадцатикратного разбавления водой с последующим сливом жидкости в канализацию.

3. В Рабочих зонах 4-1 и 4-2 или при их отсутствии во вспомогательном помещении использованные наконечники, пробирки с ампликонами (не открывать), перчатки, ветошь после окончания работы помещают в плотный термостойкий пакет (контейнер) для последующего автоклавирования в соответствии с п.1.

4. Дезактивацию буферов и гелей, содержащих бромид этидия, осуществляют следующими способами:

4.1. Первый способ - отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и затем 1 объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4 - 6 ч. Добавляют 1 объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.

Необходимые реагенты для обработки 1 л буфера и гелей: 0,5 М перманганат калия - 1 л; 2,5 М соляная кислота - 1 л; 2,5 М NaOH - 1 л.

4.2. Второй способ:

Обработку растворов (буферов), содержащих этидиум бромид осуществляют путем добавления к ним деконтаминирующего раствора до его конечной концентрации 25% (например, 25 мл деконтаминирующего раствора добавить к 75 мл раствора, содержащего этидиум бромид), аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре в течение 20 часов. Раствор нейтрализуют (pH между 5-9) натрием бикарбонатом. Нейтрализованные растворы сливают в канализацию

Обработку твердых материалов, содержащих этидиум бромид (наконечники и гели) осуществляют путем помещения их в пластмассовую емкость, содержащую деконтаминирующий раствор. Далее процедуру выполняют как при деконтаминации растворов (буферов), содержащих этидиум бромид.

Приготовление деконтаминирующего раствора: добавить 20 мл 50% гипофосфорной кислоты к раствору содержащего 4.2 грамма натрия нитрита в 300мл дистиллированной воды, аккуратно перемешать. Раствор используют в день приготовления.

4.3. Третий способ - заполнить колонку активированным углем и пропускать отработанный буфер через нее небольшими порциями. Дезактивированный раствор можно сливать в канализацию. Гели дезактивировать первым способом.

Необходимые реагенты: стеклянная колонка емкостью на 1 - 2 л; активированный уголь.

5. Обработка рабочей одежды

5.1. При работе с микроорганизмами I - IV групп патогенности обработку рабочей одежды осуществляют в соответствии с СП 1.3.1285-03 и (или) СП 1.3.2322-08.

5.2. Рабочую одежду сотрудников лаборатории маркируют индивидуально и в соответствии с зональным распределением, ее смену проводят не реже одного раза в неделю. В зоне детекции результатов желательно использовать одноразовую рабочую одежду, которую обрабатывают способом, описанным в пункте 6.1.

5.3. Стирку рабочей одежды сотрудников проводят в прачечной организации. Не допускается одновременно производить стирку рабочей одежды разных рабочих зон. Обработку рабочей одежды из учета результатов (детекции) продуктов амплификации нуклеиновых кислот проводят отдельно от одежды из других зон.

5.4. Сдачу "грязной" и выдачу "чистой" рабочей одежды производят с соблюдением поточности и разделяют во времени.

Приложение 7
Действия при контаминации лаборатории, использующей МАНК,

нуклеиновыми кислотами и ампликонами.
1. Сотрудников, проводящих мероприятия по деконтаминации, обеспечивают отдельными халатами (желательно одноразовыми), шапочками, одноразовыми бахилами и перчатками, одноразовой ветошью, емкостями для приготовления необходимых количеств моющих и дезинфицирующих растворов.

2. Каждую зону лаборатории обрабатывают сотрудники, работающие в ней.

3. Для обработки каждой зоны используют отдельный набор уборочного инвентаря, подвергаемы после уборки обработке регламентируемыми дезинфицирующими средствами.

4. Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки, например:

участок 1 - бокс биологической безопасности и оборудование внутри него;

участок 2 - внешние поверхности бокса биологической безопасности;

участок 3 - шкафы для расходного материала;

участок 4 - холодильники для хранения реактивов, образцов проб;

участок 5 - оборудование, которое используют в работе, но стоит вне бокса биологической безопасности;

участок 6 - поверхности помещения (стены, окна, батареи, потолок, двери и т.д.);

участок 7 - пол.

5. Обработку проводят от участка к участку последовательно. Каждый участок обрабатывают отдельной ветошью. Перед обработкой готовят моющие и дезинфицирующие растворы.

6. Поверхности каждого участка вначале обрабатывают моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего средства удаляются ветошью, смоченной водой.

7. Затем на поверхность наносят на 30 мин 0,2%-ный раствор ДП-2Т или аналогичные ему растворы, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке. Остатки дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой.

8. После завершения указанной обработки проводят обеззараживание влажных поверхностей ультрафиолетовым излучением в течение 45 мин.

9. Мероприятия, описанные в пункте 7 и пункте 8, повторяют еще раз.

10. По завершении деконтаминации берут повторные смывы, которые исследуют на наличие нуклеиновых кислот и (или) ампликонов возбудителей инфекционных заболеваний, диагностика которых наиболее часто осуществляется в данной лаборатории, с учетом длины специфических фрагментов амплификации нуклеиновых кислот возбудителей, указанных в инструкциях по применению к набору реагентов.

11. Для проведения смывов используют отдельные стерильные зонды с ватным тампоном, которые смачивают в 0,9%-ный раствор натрия хлорида или ТЕ-буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА) и вращательными движениями протирают рабочие поверхности оборудования, мебели, дверных ручек, косяков, телефонов и т.п. в течение 10 - 15 с, особое внимание, уделяя помещениям совместного посещения работников зоны детекции продуктов амплификации и других сотрудников лаборатории (столовая, санузел и т.п.). После взятия смыва зонд помещают в микропробирки объемом 1,5мл с 300-400 мкл ТЕ-буфера или 0,9%-ным раствором натрия хлорида, вращают в течение 10-15 с, избегая разбрызгивания раствора, и, отжав избыток жидкости о стенки пробирки, удаляют. Полученные суспензии перемешивают на вортексе в течение 1 мин. Для постановки реакции амплификации используют необходимый объем жидкости в соответствии с соответствующей инструкцией по применению к набору реагентов. После получения результатов смывов оформляются протокол.

12. В случае получения в образцах смывов положительных результатов амплификации, обработку повторяют.

13. Загрязненный расходный материал (пробирки, наконечники, реактивы и т.п.) и контаминированный рабочий исследуемый материал (кроме исходного материала) обеззараживают через автоклавирование, в соответствии с п.1.Приложения 6.

14. Случаи контаминации регистрируют в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов внутрилабораторного контроля.

15. Проведение работ связанных с амплификацией нуклеиновых кислот до завершения деконтаминационных мероприятий в лаборатории не допускается.