Методом спектрофотометрии


Рисунок 1 - Электрофореграмма рестрикции векторов рестриктазами EcoR1, HindIII и BamHI



бет16/21
Дата18.07.2016
өлшемі3.36 Mb.
1   ...   13   14   15   16   17   18   19   20   21

Рисунок 1 - Электрофореграмма рестрикции векторов рестриктазами EcoR1, HindIII и BamHI
Проведено секвенирование фрагмента гена htrA, который был выделен с помощью рестриктаз EcoRI и BamHI из амплифицированного фрагмента гена. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей этих фрагментов позволило установить сходство между участками гена. Таким образом, можно утверждать, что модифицированная плазмида содержит необходимый ген htrA.

Таким образом, в ходе данной исследовательской работы подобран ген-мишень и клонирован его фрагмент размером 600 п.н., что должно обеспечить встраивание полученного вектора в хромосомальную ДНК бактерий E. faecalis.

ЛИТЕРАТУРА

1. Малик, Н.И. Ветеринарные пробиотические препараты / Н.И. Малик, А.И. Панин // Ветеринария. – 2001. – № 1 –– С. 46–51.

2. Куликова, Л.Е. Пробиотики: проблемы и перспективы / Л.Е. Куликова // Электронный сборник статей по материалам XIII студенческой международной заочной научно-практической конференции, г. Киров. - № 7 (10), - 2013. – С. 11 – 23.

3. Старовойтова, С.А. Пробиотики на основе трансгенных микроорганизмов / С.А. Старовойтова, О. И. Скроцкая // Микробиологический журнал. — 2013. — Т. 66, № 3. — С. 33–42.

УДК 579.222.3:543.421/.422

Студ. С. В. Лебедева, мл. науч. сотр. Е. Ф. Чернявская

Науч. рук. доц. Н. А. Белясова

(кафедра биотехнологии и биоэкологии, БГТУ)



ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРОТИНОИДОВ В КЛЕТКАХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

Каротиноиды представляют собой часть большой группы природных соединений, известных под общим названием изопреноиды. В их молекулах содержится большое число сопряженных двойных связей. Число двойных связей в молекуле варьирует от 7 до 15. Благодаря системе сопряженных двойных связей каротиноиды имеют интенсивную желтую, оранжевую или красную окраску и могут поглощать видимый свет в диапазоне 300-750 нм, что является главным признаком для идентификации данных пигментов.

Наличие сопряженных двойных связей обеспечивает каротиноидам способность ингибировать образование в клетках свободных радикалов, предупреждая их негативное действие на организм. Кроме того, каротиноиды выступают в роли антиоксидантов, защищая чувствительные ткани и лабильные соединения от окисления.

Растворы каротиноидов в органических растворителях при спектрофотометрических исследованиях дают характерные полосы поглощения – три сопряженных максимума, в основном, в видимой области спектра, а стереоизомеры показывают их также и в ультрафиолетовой области. Это один из наиболее точных показателей, используемых при идентификации этих веществ. Характерной является также особенность каротиноидов избирательно абсорбироваться на минеральных и некоторых органических абсорбентах, что позволяет разделять их при помощи методов хроматографирования.

Цель работы – выявление каротиноидобразующих микроорганизмов среди микробиоты ЖКТ кур.

Для качественного определения каротиноидов использовали ме-тод, описанный Хандлом [1], повысив его чувствительность с помо-щью модификации (рис. 1): клетки перед экстракцией механически разрушалиистиранием с Al2O3; проводили повторную экстракцию добавлением того же растворителя и выдерживали в течении 30 минут; спектры поглощения снимали в диапазонедлин волн 300-800 нм на спектрофотометре;определяли количественное содержание каротиноидов в клетках [2]; после подтверждения наличия каротиноидов в клетках микроорганизмов, экстракт упаривали под вакуумом до 0,5-1 мл при температуре не выше 35˚С; упаренный экстракт анализировали методом тонкослойной хроматографии.

Установлено, что практически все двадцать исследованных окрашенных штаммов микроорганизмов характеризуются способностью синтезировать каротиноиды. Из них пять образуют их в достаточно большом количестве. Для сравнения использовали дрожжи Rhodotorula mucilaginosa БИМ У-162, продуцируемых каротиноиды. В определенных условиях дрожжи рода Rhodotorula mucilaginosa синтезируют каротиноиды (β-каротин, торулин и торулородин) в количестве 190 мкг/г сухой массы, что обусловливает низкую способность к каротинообразованию[3].



Рисунок 1 – Сопоставление спектров поглощения бактериальных и дрожжевых каротиноидов

Из клеток наиболее продуктивных бактерий в одинаковых условиях экстрагировали каротиноиды, и после концентрирования упариванием использовали в тонкослойной хроматографии. В качестве подвижной фазы использовали смесь гексана с изопропиловым спиртом в соотношении 80:20. На хроматограммах всех экстрактов регистрировались пятна каротиноидов оранжевого и желтого цвета с различным значением Rf (табл.1), после чего, сопоставляя значения Rf и максимумы поглощения видимого света с литературными данными идентифицировали каротиноиды.

Для наиболее перспективных штаммов определено количественное содержание каротиноидов в клетках (табл. 1) по формуле [2]:

К=0,004·D·15/m, мг/г с.в.,

где К– количество каротиноидов;

D – значение оптической плотности при 440 нм;

15 – объем этанола, взятого для экстракции, мл;

m – сухая клеточная масса, г.



Таблица 1 – Сводная таблица полученных результатов

Микроорганизмы

Значение максимумов поглощения λ, нм

Значение Rf

Сухая клеточная масса m, г

Оптическая плотность A при 440нм

Количество каротиноидов К, мкг/г с.в.

Тип каротиноидов

бактерии штамма р8.1

392; 414; 442; 466

0,69; 0,93

0,081

0,102

76

неидентифицированные представители каротинов

бактерии штамма р8.2

430; 460; 484

0,69

0,043

0,238

332

γ-каротин

бактерии штамма ufp 16.1

419; 446; 464

0,67

0,121

0,420

208

зеинокстантин

бактерии штамма uf 35.4

422; 450; 475

0,95

0,041

0,159

233

β-криптокстантин

дрожжи RhodotorulamucilaginosaБИМ У-162

437; 464; 495; 525

0,8; 0,9; 0,93

0,063

0,106

101

торулин

β-каротин

торулородин

Данный расчет подразумевает оценку суммарного содержания каротиноидов в пересчете на β-каротин, то есть используя при расчетах величину удельного поглощения этого изомера.

Т.о. подобранные условия выделения каротиноидов из клеток можно считать удовлетворительными, ориентируясь на результат, достигнутый по отношению к коллекционным дрожжам: в оптимальных условиях они продуцируют 190 мкг/г с.в. каротиноидов [3], а в данном исследовании – 101 мкг/г с.в.

Выявлены активные продуценты каротиноидов, превосходящие коллекционные дрожжи Rhodotorula mucilaginosa по этому признаку.

ЛИТЕРАТУРА

1. Carotenoids of E. herbicola and an E. coli HB101 strain carryingthe E. herbicola carotenoid gene cluster/ B.S. Hundle [et al.] // PhotochemPhotobiol. – 1991. – Vol. 54. – P. 89-93.

2. Кислухина О.В. Витаминные комплексы из растительного сырья/ О. В. Кислухина. – Москва: ДеЛи принт, 2004. – 308 с.

3. Кирица, Е.А. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования: дис. …уч. степ. докт. биол.: 03.00.23/ Е.А. Кирица. – Кишинев 2005. – 248 л.

УДК 636.087.7

Студ. Е. В. Монич, мл. науч. сотр. Е. Ф. Чернявская

Науч. рук. доц. Н. А. Белясова

(кафедра биотехнологии и биоэкологии, БГТУ)



ВЫДЕЛЕНИЕ КАРОТИНОИДОБРАЗУЮЩИХ

МИКРООРГАНИЗМОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОБИОТИЧЕСКИМ ПОТЕНЦИАЛОМ

Птицы очень чувствительны к недостатку витаминов в кормах, что связано с их биологическими особенностями – высокой скоростью роста, быстрым продвижением корма по желудочно-кишечному тракту, недостаточным эндогенным синтезом этих веществ и ограниченным всасыванием их в пищеварительном тракте.

В условиях промышленного птицеводства часто регистрируется недостаточность витамина А и его предшественников каротиноидов [3]. Поэтому для нормального метаболизма, продуктивности, поддержания на оптимальном уровне функциональной активности иммунной системы в рацион птиц приходится вводить витамин А и каротиноиды в сбалансированных количествах.

В то же время все большую популярность завоевывает стратегия замены в рационе с/х животных, в том числе кур, биологически активных веществ на их продуценты – микроорганизмы, которые способны обеспечить в желудочно-кишечном тракте бесперебойный синтез подобных веществ. У данного подхода есть неоспоримые преимущества:



  • исключается передозировка препаратов, поскольку процесс синтеза биологически активных веществ, в частности ретинола, ферментативно лимитирован;

  • исчезает необходимость стабилизировать препараты биологически активных веществ. Стоит отметить, что стабилизация каротиноидов представляет определенную проблему, которая пока остается нерешенной [1];

  • естественный путь транспортировки веществ, синтезируемых микроорганизмами в желудочно-кишечном тракте животных, в клетки хозяев (в противоположность процессам обогащения кормов препаратами или их введения в организм с помощью инъекций);

  • существенное удешевление технологии выращивания с/х животных за счет исключения затрат на получение и очистку препаратов биологически активных веществ [1].

Целью настоящего исследования является выделение гомобиотических для кур микроорганизмов с пробиотическим потенциалом, способных продуцировать каротиноиды.

Для увеличения относительного содержания каротиноидобразующих микроорганизмов с привлекательными свойствами в числе изолятов использовали следующие элективные условия: облучение коротковолновым ультрафиолетом и пастеризацию, а также сочетание этих факторов. УФ-обработка должна была обеспечить инактивацию непигментированных микроорганизмов, которые гораздо более чувствительны к фотодинамическому действию ультрафиолета, чем пигментированные формы. Пастеризацию применяли для выделения устойчивых к нагреванию форм, среди которых интерес вызывают спорообразующие бактерии, чье широкое использование в качестве пробиотиков обусловлено удобством хранения и повышенной жизнеспособностью клеток [2].

Из трех проб помета цыплят контрольного птичника Смолевической птицефабрики в мае 2014 года выделено в виде чистых культур 78 штаммов пигментированных бактерий и дрожжей.

В таблице приведены результаты эффективности выделения пигментированных микроорганизмов из проб помета при использовании элективных условий.


Таблица 1 – Эффективность выделения пигментированных микроорганизмов из проб помета цыплят в разных условиях


Условия выделения микроорганизмов

Относительное содержание пигментированных колоний к общему их числу

Отобрано перспективных штаммов микроорганизмов

Пастеризация (80 0С,

15 мин)


19/9 = 47%

5

УФ-облучение (243 нм, 10 мин, 70 см)

7/6= 86%

6

Пастеризация + УФ

62/62 = 100%

11

Без элективных факторов

20/1 = 5%

1

Из полученных данных следует, что наибольшее содержание пигментов микроорганизмов наблюдается при комбинированном воздействии на клетки ультрафиолета и пастеризации – колонии всех микроорганизмов на плотной среде оказались окрашенными в желто-оранжевые и розоватые тона.

Все выделенные пигментированные микроорганизмы (78 штаммов) проанализированы по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, на основании которых можно судить об их пробиотическом потенциале.

Наиболее перспективными пробиотическими бактериями, продуцирующими каротиноиды, являются представители штаммов: р8.2, ufp16.3, KII35.1.2.4, р35.4.

Они отобраны на основании следующих, важных для пробиотиков, свойств:


  • антагонистической активности по отношению к санитарным условно-патогенным бактериям (Salmonella abony ATCCBAA-2162 и Staphylococcus aureus ATCC 6538);

  • устойчивость к фенолу (0,2%) и NaCl (4%), что свидетельствует об их способности выживать в желудочно-кишечном тракте кур;

  • температурному оптимуму роста 42 0С, – температуре организма курицы;

  • высокому уровеню продукции каротиноидов (минимум в 2 раза выше, чем у известных дрожжей рода Rhodotorula).

По результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что наиболее эффективным методом выделения каротиноидобразующих микроорганизмов является метод совмещающий пастеризацию и обработку УФ. При использовании этого метода было получено наибольшее количество пигментированных колоний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Курегян А.Г., Печинский С.В., Зилфикаров И.Н. Способы получения каротиноидов, лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище на их основе. Научно-техн. журн. –2014. – Т. 6, №1. – С. 45.

2. Старовойтова, С.А. Пробиотики на основе трансгенных микроорганизмов / С.А. Старовойтова, О. И. Скроцкая // Микробиологический журнал. – 2013. – Т. 66, № 3. – С. 33–42.

3. Востикова С.М. Влияние природных каротиноидов на витаминный и минеральный состав тканей и органов кур-несушек, пигментацию желтка: автореф. дис. …уч. степ. конд. биол. наук: 03.01.04/ С.М. Востикова. – Курск 2010. – 26 с.

УДК 621.385:542.63

Студ. М. Н. Киричук

Науч. рук. доц. А. В. Игнатенко

(кафедра биотехнологии и биоэкологии, БГТУ)

СВЧ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ ОСАДКОВ СТОЧНЫХ ВОД

Образующиеся в процессе очистки сточных вод осадки очистных сооружений должны подвергаться обязательному обеззараживанию для уничтожения возбудителей опасных заболеваний, которые в большом количестве содержатся в хозяйственно-бытовых стоках [1].

Для обеззараживания сточных вод и осадков применяются химические, физико-химические и биологические методы. Наиболее широко используется метод обеззараживания с помощью природных и искусственных биоценозов (активный ил очистных сооружений, биопруды, биоценозы почв и др.), где обеззараживание происходит под воздействием влияния внешних факторов среды, а также в результате антагонистических отношений между нормальной и патогенной микрофлорой. Недостатком данного способа является высокая длительность процессов обеззараживания, в результате чего некоторые патогены могут сохраняться в почве годами.

Для ускорения обеззараживания ОСВ используются химические способы подавления микроорганизмов. Для этого применяются хлор, гипохлорит, хлорная известь и др. Основными недостатками данного способа уничтожения микроорганизмов являются большой расход реагентов и дополнительное загрязнение ОСВ. Так для обеззараживании ОСВ 30%-ой хлорной известью требуется до 10 сут., и после обработки осадки не используются в качестве удобрений, а захораниваются [1].

Более перспективно применение физических способов обеззараживания термообработкой, инфракрасным, ультрафиолетовым, микроволновым, ионизирующим излучением, ультразвуковыми волнами и др. Несмотря на высокие энергетические затраты и необходимость в специальном оборудовании, они быстры, безреагентны и позволяют использовать обработанные ОСВ в качестве удобрений.

Одно из успешно развиваемых направлений физического обеззараживания связано с использованием СВЧ-волновой обработки. Основным ее достоинством является быстрый и равномерный нагрев образцов по всему объему, а также возможность автоматизации и регулирования процессов [2].

Цель работы – подбор режимов СВЧ-нагрева и анализ эффективности обеззараживания ОСВ по количеству мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФанМ).

В работе использовали ОСВ очистных карьера «Хотиславский».

СВЧ обработку ОСВ массой 10 г проводили в бытовой СВЧ-печи Samsung CE935GR, работающую на частоте 2450 МГц. Мощность СВЧ излучения изменяли от 300 до 900 Вт, время обработки – в интервале 15–90 с. Температуру осадков после обработки регистрировали при помощи термометра 0–100оС.

Для определения КМАФАнМ 1 г ОСВ вносили в 10 см3 физиологического раствора (ФР) и готовили их десятикратные разведения. В чашки Петри помещали по 1 см3 5-го и 6-го разведения образцов, заливали 1,5% ПА, охлажденным до 50оС. После застывания ПА засеянные чашки помещали в термостат и культивировали клетки при 30оС в течение 3-х сут.

Оценку физиологическую активность микроорганизмов и выживаемость после СВЧ обработки, при добавке 0,1 мл 10-2 моль глюкозы, проводили на МКМ–Ц методом микрокалориметрии.

На рис. 1 приведены результаты кинетики разогрева ОСВ в зависимости от мощности СВЧ обработки.





а)

б)


1 – Р = 300 Вт; 2 – 600 Вт; 3 – Р = 900 Вт

Рисунок 1 - Кинетика изменения температуры ОСВ (а) и ее зависимость от мощности СВЧ обработки (б) (t = 1 мин)

Как видно из рис. 1, СВЧ нагрев ОСВ позволяет быстро достигнуть температуры пастеризации 60–75оС по всему объему образцов, что имеет важное значение для обеззараживания ОСВ. Повышение времени или мощности СВЧ обработки приводит к вскипанию воды в ОСВ и ее быстрому испарению, в результате чего образцы высыхают и скорость разогрева образцов падает.

Анализ эффективности обеззараживания ОСВ при различных мощностях СВЧ обработки приведён в табл. 1. При статистической обработке данных КМАФАнМ и анализе значений эффективности обеззараживания, дальнейшие исследования целесообразно проводить при средних мощностях СВЧ обработки P = 600 Вт и времени 1 мин.

Таблица 1 – Оценка эффективности обеззараживания ОСВ

Режимы
обработки

Температура после обработки, оС

КМАФАнМ, КОЕ·104

Эффективность обеззараживания, %

Р, Вт

τ, с

контроль

20

2000

-

300

60

60

440

78,0

600

60

72

300

85,0

900

60

80

84

95,8

Характеристика параметров тепловыделения ОСВ после СВЧ обработки при P = 600 Вт и t = 1 мин приведена на рис. 2.

Рисунок 2 - Кинетика изменения мощности тепловыделения ОСВ при СВЧ обработке: 1 – до обработки; 2 – после обработки

Как видно из рис. 2, в результате обеззараживания ОСВ при СВЧ обработке, наблюдается быстрое падение интенсивности тепловыделения, что связано с гибелью микроорганизмов.

В результате выполненной работы установлено, что: СВЧ обработка является быстрым способом обеззараживания ОСВ, эффективность обеззараживания ОСВ зависит от мощности и времени обработки и достигает 95-100 % при P = 900 Вт, t = 1 мин, разработан микрокалориметрический экспресс метод, позволяет в течение 20 мин определить эффективность уничтожения микроорганизмов в ОСВ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Жмур, Н.С. Технологические и биохимические процессы очистки сточных вод на сооружениях с аэротенками / Н.С. Жмур. – СПб.: Акварос, 2003. – 506 с.

2. Рогов, И.А. Сверхвысокочастотный нагрев пищевых продуктов: уч. пособие / И.А. Рогов, С. В. Некрутман. – М.: Агропром, 1986. – 351 с.

УДК 666.972.16

Студ. М. Н. Киричук

Науч. рук. доц. А. В. Игнатенко

(кафедра биотехнологии и биоэкологии, БГТУ)



ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ АКТИВАЦИИ
ОТРАБОТАННОГО КОАГУЛЯНТ-ФЛОКУЛЯНТА В СОСТАВЕ ОСАДКОВ КАРЬЕРА «ХОТИСЛАВСКИЙ»

Одним из основных направлений совершенствования промышленного производства является ресурсо- и энергосбережение, обеспечение его экологической безопасности и использования отходов производства.

Для очистки сточных вод от тонкодисперсных частиц преимущественно используются методы коагуляции и флокуляции, с последующим удалением слипшихся частиц методом седиментации [1].

Коагуляционный процесс укрупнения коллоидных и взвешенных частиц дисперсной системы, происходит в результате нейтрализации электрического заряда, присутствующего на поверхности частиц, что способствует их слипанию [2].

Процесс коагуляции может быть значительно ускорен при использовании флокулянтов, представляющих собой полимеры, которые образуют мостиковые связи за счёт ионных и водородных взаимодействий и способствуют осаждению частиц.

При очистке дренажных сточных вод карьера расходуется большое количество дорогостоящих импортных коагулянтов и флокулянтов производства Франции. Среднесуточный расход реагентов составляет: 0,7 т/сут коагулянта и 0,0075 т/сут флокулянта. Основной производственный отход очистных сооружений карьера «Хотиславский» представляет собой осадок, образующийся в отстойниках в количестве


100 м3/сут [3].

Целью работы было исследование возможности активации отработанного коагулянт-флокулянта в составе осадков карьера «Хотиславский» СЗАО «КварцМелПром» для их повторного применения в очистке сточных вод.

В работе использовали не очищенные сточные воды после пескомойки карьера СЗАО «КварцМелПром» и осадки из отстойников с отработанным коагулянт-флокулянтом, а также чистые реагенты коагулянт Floguat–4540 и флокулянт Flopam–4440 (Франция), для обработки осадка применялись 0,1 н растворы HCl и NaOH.

Эффективность работы активированных коагулянт-флокулянтов в составе осадков изучалась методом седиментации сточных вод в результате их отстаивания в цилиндрах объёмом 250 см3 в течение 1 часа.

Концентрацию неосаждаемых частиц определяли методом турбидиметрии при измерении оптической плотности сточных вод на длине волны 600 нм [4].

В данной работе проверена возможность повторного использования отработанного коагулянт-флокулянта в составе осадков отстойников очистных сооружений для очистки сточных вод карьера от тонкодисперсной фракции частиц (рис. 1).





1 – с применением свежеприготовленного коагулянт-флокулянта;
2 – после первичного использования осадка; 3 – после вторичного
использования осадка; 4 – сточная вода (контроль)



Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   13   14   15   16   17   18   19   20   21


©dereksiz.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет