Рисунок 1 - Электрофореграмма рестрикции векторов рестриктазами EcoR1, HindIII и BamHI

Таким образом, в ходе данной исследовательской работы подобран ген-мишень и клонирован его фрагмент размером 600 п.н., что должно обеспечить встраивание полученного вектора в хромосомальную ДНК бактерий E. faecalis.

ЛИТЕРАТУРА

1. Малик, Н.И. Ветеринарные пробиотические препараты / Н.И. Малик, А.И. Панин // Ветеринария. – 2001. – № 1 –– С. 46–51.

2. Куликова, Л.Е. Пробиотики: проблемы и перспективы / Л.Е. Куликова // Электронный сборник статей по материалам XIII студенческой международной заочной научно-практической конференции, г. Киров. - № 7 (10), - 2013. – С. 11 – 23.

3. Старовойтова, С.А. Пробиотики на основе трансгенных микроорганизмов / С.А. Старовойтова, О. И. Скроцкая // Микробиологический журнал. — 2013. — Т. 66, № 3. — С. 33–42.

УДК 579.222.3:543.421/.422

Студ. С. В. Лебедева, мл. науч. сотр. Е. Ф. Чернявская

Науч. рук. доц. Н. А. Белясова

(кафедра биотехнологии и биоэкологии, БГТУ)

Каротиноиды представляют собой часть большой группы природных соединений, известных под общим названием изопреноиды. В их молекулах содержится большое число сопряженных двойных связей. Число двойных связей в молекуле варьирует от 7 до 15. Благодаря системе сопряженных двойных связей каротиноиды имеют интенсивную желтую, оранжевую или красную окраску и могут поглощать видимый свет в диапазоне 300-750 нм, что является главным признаком для идентификации данных пигментов.

Наличие сопряженных двойных связей обеспечивает каротиноидам способность ингибировать образование в клетках свободных радикалов, предупреждая их негативное действие на организм. Кроме того, каротиноиды выступают в роли антиоксидантов, защищая чувствительные ткани и лабильные соединения от окисления.

Растворы каротиноидов в органических растворителях при спектрофотометрических исследованиях дают характерные полосы поглощения – три сопряженных максимума, в основном, в видимой области спектра, а стереоизомеры показывают их также и в ультрафиолетовой области. Это один из наиболее точных показателей, используемых при идентификации этих веществ. Характерной является также особенность каротиноидов избирательно абсорбироваться на минеральных и некоторых органических абсорбентах, что позволяет разделять их при помощи методов хроматографирования.

Цель работы – выявление каротиноидобразующих микроорганизмов среди микробиоты ЖКТ кур.

Для качественного определения каротиноидов использовали ме-тод, описанный Хандлом [1], повысив его чувствительность с помо-щью модификации (рис. 1): клетки перед экстракцией механически разрушалиистиранием с Al₂O₃; проводили повторную экстракцию добавлением того же растворителя и выдерживали в течении 30 минут; спектры поглощения снимали в диапазонедлин волн 300-800 нм на спектрофотометре;определяли количественное содержание каротиноидов в клетках [2]; после подтверждения наличия каротиноидов в клетках микроорганизмов, экстракт упаривали под вакуумом до 0,5-1 мл при температуре не выше 35˚С; упаренный экстракт анализировали методом тонкослойной хроматографии.

Установлено, что практически все двадцать исследованных окрашенных штаммов микроорганизмов характеризуются способностью синтезировать каротиноиды. Из них пять образуют их в достаточно большом количестве. Для сравнения использовали дрожжи Rhodotorula mucilaginosa БИМ У-162, продуцируемых каротиноиды. В определенных условиях дрожжи рода Rhodotorula mucilaginosa синтезируют каротиноиды (β-каротин, торулин и торулородин) в количестве 190 мкг/г сухой массы, что обусловливает низкую способность к каротинообразованию[3].



Рисунок 1 – Сопоставление спектров поглощения бактериальных и дрожжевых каротиноидов

Из клеток наиболее продуктивных бактерий в одинаковых условиях экстрагировали каротиноиды, и после концентрирования упариванием использовали в тонкослойной хроматографии. В качестве подвижной фазы использовали смесь гексана с изопропиловым спиртом в соотношении 80:20. На хроматограммах всех экстрактов регистрировались пятна каротиноидов оранжевого и желтого цвета с различным значением R_f (табл.1), после чего, сопоставляя значения R_f и максимумы поглощения видимого света с литературными данными идентифицировали каротиноиды.

Для наиболее перспективных штаммов определено количественное содержание каротиноидов в клетках (табл. 1) по формуле [2]:

К=0,004·D·15/m, мг/г с.в.,

где К– количество каротиноидов;

D – значение оптической плотности при 440 нм;

15 – объем этанола, взятого для экстракции, мл;

m – сухая клеточная масса, г.

Данный расчет подразумевает оценку суммарного содержания каротиноидов в пересчете на β-каротин, то есть используя при расчетах величину удельного поглощения этого изомера.

Т.о. подобранные условия выделения каротиноидов из клеток можно считать удовлетворительными, ориентируясь на результат, достигнутый по отношению к коллекционным дрожжам: в оптимальных условиях они продуцируют 190 мкг/г с.в. каротиноидов [3], а в данном исследовании – 101 мкг/г с.в.

Выявлены активные продуценты каротиноидов, превосходящие коллекционные дрожжи Rhodotorula mucilaginosa по этому признаку.

ЛИТЕРАТУРА

1. Carotenoids of E. herbicola and an E. coli HB101 strain carryingthe E. herbicola carotenoid gene cluster/ B.S. Hundle [et al.] // PhotochemPhotobiol. – 1991. – Vol. 54. – P. 89-93.

2. Кислухина О.В. Витаминные комплексы из растительного сырья/ О. В. Кислухина. – Москва: ДеЛи принт, 2004. – 308 с.

3. Кирица, Е.А. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования: дис. …уч. степ. докт. биол.: 03.00.23/ Е.А. Кирица. – Кишинев 2005. – 248 л.

УДК 636.087.7

Студ. Е. В. Монич, мл. науч. сотр. Е. Ф. Чернявская

Науч. рук. доц. Н. А. Белясова

(кафедра биотехнологии и биоэкологии, БГТУ)

Птицы очень чувствительны к недостатку витаминов в кормах, что связано с их биологическими особенностями – высокой скоростью роста, быстрым продвижением корма по желудочно-кишечному тракту, недостаточным эндогенным синтезом этих веществ и ограниченным всасыванием их в пищеварительном тракте.

В условиях промышленного птицеводства часто регистрируется недостаточность витамина А и его предшественников каротиноидов [3]. Поэтому для нормального метаболизма, продуктивности, поддержания на оптимальном уровне функциональной активности иммунной системы в рацион птиц приходится вводить витамин А и каротиноиды в сбалансированных количествах.

В то же время все большую популярность завоевывает стратегия замены в рационе с/х животных, в том числе кур, биологически активных веществ на их продуценты – микроорганизмы, которые способны обеспечить в желудочно-кишечном тракте бесперебойный синтез подобных веществ. У данного подхода есть неоспоримые преимущества:

• 
  исключается передозировка препаратов, поскольку процесс синтеза биологически активных веществ, в частности ретинола, ферментативно лимитирован;
  
• 
  исчезает необходимость стабилизировать препараты биологически активных веществ. Стоит отметить, что стабилизация каротиноидов представляет определенную проблему, которая пока остается нерешенной [1];
  
• 
  естественный путь транспортировки веществ, синтезируемых микроорганизмами в желудочно-кишечном тракте животных, в клетки хозяев (в противоположность процессам обогащения кормов препаратами или их введения в организм с помощью инъекций);
  
• 
  существенное удешевление технологии выращивания с/х животных за счет исключения затрат на получение и очистку препаратов биологически активных веществ [1].
  

Для увеличения относительного содержания каротиноидобразующих микроорганизмов с привлекательными свойствами в числе изолятов использовали следующие элективные условия: облучение коротковолновым ультрафиолетом и пастеризацию, а также сочетание этих факторов. УФ-обработка должна была обеспечить инактивацию непигментированных микроорганизмов, которые гораздо более чувствительны к фотодинамическому действию ультрафиолета, чем пигментированные формы. Пастеризацию применяли для выделения устойчивых к нагреванию форм, среди которых интерес вызывают спорообразующие бактерии, чье широкое использование в качестве пробиотиков обусловлено удобством хранения и повышенной жизнеспособностью клеток [2].

Из трех проб помета цыплят контрольного птичника Смолевической птицефабрики в мае 2014 года выделено в виде чистых культур 78 штаммов пигментированных бактерий и дрожжей.

В таблице приведены результаты эффективности выделения пигментированных микроорганизмов из проб помета при использовании элективных условий.

Из полученных данных следует, что наибольшее содержание пигментов микроорганизмов наблюдается при комбинированном воздействии на клетки ультрафиолета и пастеризации – колонии всех микроорганизмов на плотной среде оказались окрашенными в желто-оранжевые и розоватые тона.

Все выделенные пигментированные микроорганизмы (78 штаммов) проанализированы по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, на основании которых можно судить об их пробиотическом потенциале.

Наиболее перспективными пробиотическими бактериями, продуцирующими каротиноиды, являются представители штаммов: р8.2, ufp16.3, KII35.1.2.4, р35.4.

Они отобраны на основании следующих, важных для пробиотиков, свойств:

• 
  антагонистической активности по отношению к санитарным условно-патогенным бактериям (Salmonella abony ATCCBAA-2162 и Staphylococcus aureus ATCC 6538);
  
• 
  устойчивость к фенолу (0,2%) и NaCl (4%), что свидетельствует об их способности выживать в желудочно-кишечном тракте кур;
  
• 
  температурному оптимуму роста 42 0С, – температуре организма курицы;
  
• 
  высокому уровеню продукции каротиноидов (минимум в 2 раза выше, чем у известных дрожжей рода Rhodotorula).
  

2. Старовойтова, С.А. Пробиотики на основе трансгенных микроорганизмов / С.А. Старовойтова, О. И. Скроцкая // Микробиологический журнал. – 2013. – Т. 66, № 3. – С. 33–42.

3. Востикова С.М. Влияние природных каротиноидов на витаминный и минеральный состав тканей и органов кур-несушек, пигментацию желтка: автореф. дис. …уч. степ. конд. биол. наук: 03.01.04/ С.М. Востикова. – Курск 2010. – 26 с.

УДК 621.385:542.63

Студ. М. Н. Киричук

Науч. рук. доц. А. В. Игнатенко

(кафедра биотехнологии и биоэкологии, БГТУ)

СВЧ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ ОСАДКОВ СТОЧНЫХ ВОД

Образующиеся в процессе очистки сточных вод осадки очистных сооружений должны подвергаться обязательному обеззараживанию для уничтожения возбудителей опасных заболеваний, которые в большом количестве содержатся в хозяйственно-бытовых стоках [1].

Для обеззараживания сточных вод и осадков применяются химические, физико-химические и биологические методы. Наиболее широко используется метод обеззараживания с помощью природных и искусственных биоценозов (активный ил очистных сооружений, биопруды, биоценозы почв и др.), где обеззараживание происходит под воздействием влияния внешних факторов среды, а также в результате антагонистических отношений между нормальной и патогенной микрофлорой. Недостатком данного способа является высокая длительность процессов обеззараживания, в результате чего некоторые патогены могут сохраняться в почве годами.

Для ускорения обеззараживания ОСВ используются химические способы подавления микроорганизмов. Для этого применяются хлор, гипохлорит, хлорная известь и др. Основными недостатками данного способа уничтожения микроорганизмов являются большой расход реагентов и дополнительное загрязнение ОСВ. Так для обеззараживании ОСВ 30%-ой хлорной известью требуется до 10 сут., и после обработки осадки не используются в качестве удобрений, а захораниваются [1].

Более перспективно применение физических способов обеззараживания термообработкой, инфракрасным, ультрафиолетовым, микроволновым, ионизирующим излучением, ультразвуковыми волнами и др. Несмотря на высокие энергетические затраты и необходимость в специальном оборудовании, они быстры, безреагентны и позволяют использовать обработанные ОСВ в качестве удобрений.

Одно из успешно развиваемых направлений физического обеззараживания связано с использованием СВЧ-волновой обработки. Основным ее достоинством является быстрый и равномерный нагрев образцов по всему объему, а также возможность автоматизации и регулирования процессов [2].

Цель работы – подбор режимов СВЧ-нагрева и анализ эффективности обеззараживания ОСВ по количеству мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФанМ).

В работе использовали ОСВ очистных карьера «Хотиславский».

СВЧ обработку ОСВ массой 10 г проводили в бытовой СВЧ-печи Samsung CE935GR, работающую на частоте 2450 МГц. Мощность СВЧ излучения изменяли от 300 до 900 Вт, время обработки – в интервале 15–90 с. Температуру осадков после обработки регистрировали при помощи термометра 0–100^оС.

Для определения КМАФАнМ 1 г ОСВ вносили в 10 см³ физиологического раствора (ФР) и готовили их десятикратные разведения. В чашки Петри помещали по 1 см³ 5-го и 6-го разведения образцов, заливали 1,5% ПА, охлажденным до 50^оС. После застывания ПА засеянные чашки помещали в термостат и культивировали клетки при 30^оС в течение 3-х сут.

Оценку физиологическую активность микроорганизмов и выживаемость после СВЧ обработки, при добавке 0,1 мл 10^-2 моль глюкозы, проводили на МКМ–Ц методом микрокалориметрии.

На рис. 1 приведены результаты кинетики разогрева ОСВ в зависимости от мощности СВЧ обработки.

Как видно из рис. 1, СВЧ нагрев ОСВ позволяет быстро достигнуть температуры пастеризации 60–75^оС по всему объему образцов, что имеет важное значение для обеззараживания ОСВ. Повышение времени или мощности СВЧ обработки приводит к вскипанию воды в ОСВ и ее быстрому испарению, в результате чего образцы высыхают и скорость разогрева образцов падает.

Анализ эффективности обеззараживания ОСВ при различных мощностях СВЧ обработки приведён в табл. 1. При статистической обработке данных КМАФАнМ и анализе значений эффективности обеззараживания, дальнейшие исследования целесообразно проводить при средних мощностях СВЧ обработки P = 600 Вт и времени 1 мин.

Таблица 1 – Оценка эффективности обеззараживания ОСВ

Режимы обработки		Температура после обработки, оС	КМАФАнМ, КОЕ·104/г	Эффективность обеззараживания, %
Р, Вт	τ, с
контроль		20	2000	-
300	60	60	440	78,0
600	60	72	300	85,0
900	60	80	84	95,8

Характеристика параметров тепловыделения ОСВ после СВЧ обработки при P = 600 Вт и t = 1 мин приведена на рис. 2.

Рисунок 2 - Кинетика изменения мощности тепловыделения ОСВ при СВЧ обработке: 1 – до обработки; 2 – после обработки

Как видно из рис. 2, в результате обеззараживания ОСВ при СВЧ обработке, наблюдается быстрое падение интенсивности тепловыделения, что связано с гибелью микроорганизмов.

В результате выполненной работы установлено, что: СВЧ обработка является быстрым способом обеззараживания ОСВ, эффективность обеззараживания ОСВ зависит от мощности и времени обработки и достигает 95-100 % при P = 900 Вт, t = 1 мин, разработан микрокалориметрический экспресс метод, позволяет в течение 20 мин определить эффективность уничтожения микроорганизмов в ОСВ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Жмур, Н.С. Технологические и биохимические процессы очистки сточных вод на сооружениях с аэротенками / Н.С. Жмур. – СПб.: Акварос, 2003. – 506 с.

2. Рогов, И.А. Сверхвысокочастотный нагрев пищевых продуктов: уч. пособие / И.А. Рогов, С. В. Некрутман. – М.: Агропром, 1986. – 351 с.

УДК 666.972.16

Студ. М. Н. Киричук

Науч. рук. доц. А. В. Игнатенко

(кафедра биотехнологии и биоэкологии, БГТУ)

Одним из основных направлений совершенствования промышленного производства является ресурсо- и энергосбережение, обеспечение его экологической безопасности и использования отходов производства.

Для очистки сточных вод от тонкодисперсных частиц преимущественно используются методы коагуляции и флокуляции, с последующим удалением слипшихся частиц методом седиментации [1].

Коагуляционный процесс укрупнения коллоидных и взвешенных частиц дисперсной системы, происходит в результате нейтрализации электрического заряда, присутствующего на поверхности частиц, что способствует их слипанию [2].

Процесс коагуляции может быть значительно ускорен при использовании флокулянтов, представляющих собой полимеры, которые образуют мостиковые связи за счёт ионных и водородных взаимодействий и способствуют осаждению частиц.

При очистке дренажных сточных вод карьера расходуется большое количество дорогостоящих импортных коагулянтов и флокулянтов производства Франции. Среднесуточный расход реагентов составляет: 0,7 т/сут коагулянта и 0,0075 т/сут флокулянта. Основной производственный отход очистных сооружений карьера «Хотиславский» представляет собой осадок, образующийся в отстойниках в количестве

Целью работы было исследование возможности активации отработанного коагулянт-флокулянта в составе осадков карьера «Хотиславский» СЗАО «КварцМелПром» для их повторного применения в очистке сточных вод.

В работе использовали не очищенные сточные воды после пескомойки карьера СЗАО «КварцМелПром» и осадки из отстойников с отработанным коагулянт-флокулянтом, а также чистые реагенты коагулянт Floguat–4540 и флокулянт Flopam–4440 (Франция), для обработки осадка применялись 0,1 н растворы HCl и NaOH.

Эффективность работы активированных коагулянт-флокулянтов в составе осадков изучалась методом седиментации сточных вод в результате их отстаивания в цилиндрах объёмом 250 см³ в течение 1 часа.

Концентрацию неосаждаемых частиц определяли методом турбидиметрии при измерении оптической плотности сточных вод на длине волны 600 нм [4].

В данной работе проверена возможность повторного использования отработанного коагулянт-флокулянта в составе осадков отстойников очистных сооружений для очистки сточных вод карьера от тонкодисперсной фракции частиц (рис. 1).