Микробиологиялық зертхана. Микроскоптар сабақтың мақсаты



жүктеу 0.82 Mb.
бет5/5
Дата09.06.2016
өлшемі0.82 Mb.
1   2   3   4   5

Микроорганизмдердің биохимиялық белсенділігі әр түрлі болып келіп, жасушалар түзетін ферменттердің қасеттеріне және қоршаған ортаның жағдайларына байланысты болады. Бактериялардың биохимиялық қасиеттерін зерттеу жұқпалы аурудың қоздырғышын анықтау үшін орындалатын тәсілдердің бірі болып табылады.

Микроорганизмдердің ферментативтік (биохимиялық) қасиеттерін анықтау тәсілдері. Бактериялардың сахаролиттік қасиеттерін оларды әр түрлі көмірсулары мен индикаторы бар дифференциалды диагностикалық орталарға себу арқылы анықтайды. Осы мақсатта Гисса ортасы жиі қолданылады. Әр түрлі көмірсулары бар орталардың жиынтығы (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, дульцит, арабиноза, сорбит және т.б.), майсыздандырылған стерильді сүт, лакмусты сүт, метилен көгі бар сүт – «түрлі-түсті қатар» деп аталады. Микроорганизмдердің өсінділерін бактериологиялық ілмектің немесе Пастер пипеткасының көмегімен аталмыш қоректік орталарға себеді. Қоректік орталарды белгілі бір уақыт аралығында термостатта ұстағаннан кейін ферментациялану (өзгеріске ұшырау) деңгейін анықтайды: қоректік орта түсінің өзгеруі (Андредэ индикаторы болғанда қызыл түске өзгереді) көмірсулардың ыдырауы мен қоректік ортада қышқыл өнімдерінің түзілуінің дәлелі болып табылады. Егер көмірсудың ыдырауы кезінде қышқыл ғана емес, сонымен қатар, газ тәріздес заттар пайда болса, олар қалтқының ішіндегі сұйықтықтың белгілі бір бөлігін ығыстырып шығарады да, оның жоғарғы бөлігінде жиналады. Микробтардың сахаролиттік қасиеттерін анықтау үшін көбінесе көмірсулары мен ВР индикаторы бар қоймалжың, сонымен қатар көмірсулары мен индикаторлары бар тығыз қоректік орталар қолданылады (Эндо, Левин, Тлоскориев агарлар және т.б.)

Микроорганизмдердің протеолиттік қасиеттерін анықтау үшін зерттеуге алынған өсіндіні ЕПЖ, кәдімгі сүтке, кейде жылқының ұйыған қан сарысуына, тауық жұмыртқасының коагулирленген белогына себеді. Тік қатырылған ЕПЖ-не микробтарды бактериологиялық иненің көмегімен қоректік ортаның түбіне бойлай шаншу арқылы сеуіп, оларды термостатқа орналастырады, ал кейде (микробтың түріне байланысты) бөлме температурасында қалдырылады. Бактерия ферменттерінің әсерінен желатин протеолизге ұшыраған шыны түтіктердегі қоректік орта (ЕПЖ) сұйылады. Әр түрлі микроорганизмдер желатинді түрліше ыдыратады. Мысалы, сібір жарасының қоздырғышы ЕПЖ воронка түрінде, ал стафилококктар оны шұлық түрінде сұйылтады.

Микроорганизмдердің казеинді гидролиздеу қабілеті Эйкманның сүт қосылған агарында анықталады. Бұл агарды дайындау үшін су моншасында балқытылған стерильді 10 мл ЕПА-на 3 мл стерильді майсыздандырылған сүтті араластырып, Петри шыныларына құйғаннан кейін суытады. Микроб өсіндісін осы қоректік ортаға бактериологиялық ілмектің немесе шпательдің көмегімен себеді. Қоректік орталар 24-48 сағат бойы термостатта ұсталады. Казеиннің пептонизацияға ұшырауы – микроб колонияларының айналасындағы сүтті агардың мөлдірленуіне әкеледі. Бактерияларды сүтке себу кезіндегі протеолиз сүттің мөлдірленуіне және шыны түтіктің түбінде шырышты немесе борпылдақ тұнбаның түзілуімен сипатталады.

Бактериялардың белокты протеолизге ұшырату дәрежесін ферментация кезінде пайда болған ыдырау өнімдерінің түрлерін (индол, күкірт сутегін, аммиакты және т.б.) зерттеу арқылы анықтайды.



Индолды әр түрлі тәсілдермен зерттеуге болады. Олардың ішіндегі ең қолайлысы және ең қарапайым тәсілі төмендегі рецептер бойынша дайындалған индикаторлық қағаздарды қолдану.

1 Сүзгіш қағаздың тілімен қымыздық қышқылының 12%-дық судағы қаныққан ыстық ерітіндісімен ылғалдандырып, ауада кептіреді. Тілімнің мөлшері: 10 х 0,5 см. Олар тығыз тығыны бар шыны сауытта сақталады. Индолдың түзілуін анықтау үшін зерттеуге алынған микроб өсіндісін шыны түтіктегі ЕПС немесе Хоттингер сорпасы бар қоректік орталарға себеді де, индикаторлық қағаздардың тілімен тығынның көмегімен қыстырып қояды. Индикаторлық қағаздардың ұшын қоректік ортаға тигізбеу керек. Шыны түтіктер термостатта 130 С-та 1-3 тәулік ұсталады. Индолдың түзілуі индикаторлық қағаздың төменгі ұшының қызғылт түске боялуымен дәлелденеді.

2 Сүзгіш қағазды Эрлих реактивінің ерітіндісімен дымқылдандырады. Эрлих реактиві келесі қоспалардан тұрады: 3-5 г парадиметиламидобензальдегид, 50 мл 96%-дық спирт – ректификат, 10 мл таза концентрленген тұз қышқылы. Осы тәсілмен өңделген қағаздардың түсі сары болып, тығыз тығыны бар шыны сауытта сақталады. Индолдың түзілуі қағаздың ұшын қызғылт түстен қызыл күрең түске дейінгі аралықта боялуымен сипатталады. Басқс түс есепке алынбайды. Эрлих реактивінің көмегімен индолды басқа тәсілмен де анықтауға болады. Ол үшін 5 мл 2-3 тәуліктік бактериялардың өсіндісі бар шыны түтікке эфирдің 2-3 мл-ін қосады да оларды шайқап, тұндыруға қояды. Сонан соң Пастер пипеткасының көмегімен эфир қабатының астына Эрлих реактивінің 0,5-1 мл-ін қабаттайды. Бұл реакцияға керекті Эрлих реактиві басқаша дайындалады: 1 г парадиметиламидобензальдегид + 100 мл 96% этил спирті + 20 мл химиялық таза тұз қышқылы. Индол түзілгенде эфир мен сорпа өсіндісінің шекарасында 3-5 мин ішінде қызыл сақинаның пайда болады.

Күкірт сутегінің түзілуін анықтау үшін келесі тығыз қоректік орта дайындалады: 1 л стерильді 1,7-0,2% ЕПА-ға 0,2 г күкірт қышқылды темір (FeO4), 0,3 г гипосульфит натрий, 12 мл индикаторлық финохромның 3% судағы ерітіндісін қосады. Қоректік ортаны стерильденген шыны түтіктерге 5-6 мл мөлшерінде құйып, буымен 20 минут аралығында стерильдейді. Қоректік ортаны қолданар алдында балқытады да, жазықтықта суытады. Бактерияларды қоректік ортаны жазықтығына, сонан соң шаншу арқылы оларды тік қатырылған ортаның төменгі бөліміне себеді. Бактериялар күкірт сутегін бөліп шығаратын болса, тік қатырылған орта қызыл түске, ал оның төменгі жағы қара түске боялады.

Күкірт сутегін қоректік ортада анықтау үшін 10%-дық сірке қышқылды қорғасынның ерітіндісімен дымқылданған сүзгіш қағаздың тілімдері қолданылады. Күкіртті қорғасынның пайда болуынан тілімнің ұшы қара түске боялады.



Аммиакты анықтау тәсілдері. 1. Қызғылт лакмус қағазын бактерия өсіндісі бар шыны түтіктің ішіне тығынының көмегімен қыстырып қояды. Аммиак болған жағдайда қызғылт лакмус қағаз көк түске блялады. 2. Фарфордан жасалған шыны ыдысқа микробтардың сорпа культурасының бір тамшысын тамызып, оны бір тамшы Несслер реактивімен аралыстырады. Аммиактың барында культура мен индикатор сары немесе қоңыр түске (аммиактың мөлшеріне байланысты) боялады. Несслер реактиві екі ерітіндінің қоспасы болып табылады: а) калий йодиді мен сулеме (алисапен) және б) 50% КОН ерітіндісі.

Микробтардың редукциялау қасиеттерін зерттеу қоректік орталарға құйылған органикалық бояулардың (метилен көгінің, малахитті жасылдың, бейтарап қызылдың және т.б.) түсінің өзгеруін анықтауға негізделген. Қоректік орта ретінде көбінесе сүт қолданылады. Зерттеуге арналған өсіндіні бактериологиялық ілмектің көмегімен бояуы бар қоректік ортаға себеді де, термостатта 24 сағат бойы ұстайды. Микроб ферменттерінің әсерінен бояу түссізденеді немесе оның бастапқы түсі өзгереді.



Минкевич қоректік ортасында микробтардың редукциялау қасиеттерін анықтау. Минкевич ортасы – лакмус тұнбасы бар сүт. Микробтардың өсіндісін термостатта 10 күн бойы ұстап, күнде тексеріп отырады. Лакмустың редукциялануы сүттің толық ағаруымен дәлелденеді. Микробтардың қышқылды немесе сілтілі өнімдерді түзу қасиеттері де осы қоректік ортада анықталады. Бірінші жағдайда лакмусты сүт қызыл түске, ал екінші жағдайда көк түске боялады.

Нитраттарды редукциялау (денитрификация) үшін зерттеуге алынған өсіндіні құрамында 12%-дық азот қышқылды калий ерітіндісі бар ЕПС сеуіп, термостатта 48-72 сағат аралығында ұстайды (37-380 С). Сонан соң қоректік ортаға калий йоды мен 10%-дық күкірт қышқылы ерітіндісінің белгілі пропорциясынан құралған реактивтің 1 мл-ін қосады. Нитраттардың нитритке ауысуы (редукциялануы) ортаның көк түске боялуымен дәлелденеді. Каталаза бірнеше тәсілдермен анықталынады.

1 Бір тәуліктік агар өсіндісінің бетіне 2 мл 1%-дық сутегінің асқын тотығын таратады. Каталазаның барында бөлініп шыққанда қоректік ортаның бетінде көпіршіктер пайда болады.

2 Зат шынысының бетіне сутегінің асқын тотығының 3-10%-дық ерітіндісін тамызады да, оны ілмекпен алынған агар өсіндісінің массасымен араластырады. Газ көпіршіктерінің бөлініп шығуы каталазаның түзілуін дәлелдейді.

3 Каталазаны сорпа өсіндісінде анықтау үшін шыны түтікке өсіндінің 1 мл-ін құяды да оған 1 мл сутегі асқын тотығының 10%-дық ерітіндісін қосады. Каталаза барында газ көпіршіктері бөлініп шығады.

Бактериялардың гемолиттік қасиеттерін зерттеу. Кейбір бактериялар эриторциттерді талқандайтын ерекше заттар – гемотоксиндерді бөліп шығарады. Микроорганизмдердің осы қасиеттерін анықтау үшін оларды 5%- фибрині жоқ қаны бар қоректік ортаға себеді (қанды ЕПА). Гемолиттік қасиеттері бар микробтардың мекендерінің айналасында мөлдір аймақ (түссіз немесе боялған) пайда болады. Сұйық қоректік ортаға себілген мұндай микробтар эритроциттерді гемолизге ұшыратып, ортаны мөлдірлетеді.

Әдебиеттер:

1 Бұлашев А.Қ., Сұраншиев Ж.А., Жұмабаев Х.Ж. Жалпы микробиология пәнінен ветеринариялық медицина факультетінде оқитын студенттердің зертханалық тәжірибе сабақтарына арналған әдістемелік нұсқауы. Астана, 2005ж. 39-43 беттер. 2 Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии // Москва, «Агропромиздат». 1988. С. 76-80. 3 Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии // Москва, «Агропромиздат». 1989. С. 74-80.


Бақылау сұрақтары: 1 Микроорганизмдердің сахаролиттік қасиетін анытау тәсілі. 2 Микроорганизмдердің протеолиттік қасиеттерін анықтау тәсілі. 3 Индол, күкірт сутегі және аммиакты анықтау тәсілдері. 4 Бактериялардың гемолиттік қасиеттерін зерттеу.

Он төртінші зертханалық – тәжірибе сабағы

ҚҰРАМЫНДА ВИРУСЫ БАР МАТЕРИАЛДАРМЕН ЖҰМЫС ІСТЕУ ЕРЕЖЕСІ МЕН ҚАУІПСІЗДІК ТЕХНИКАСЫ
Сабақтың мақсаты: Вирусологиялық зертхана, құрамында вирусы бар материалдармен жұмыс істеу ережесі мен қауіпсіздік техникасы, міндеті, зерттеу әдістері, қондырғылары және вирустық материалдарды сақтау жұмыстарымен танысу.

Материалдар мен жабдықтар. Вирусологиялық зертхана ғимараты, вирусологиялық зерттеу жұмыстарын жүргізуге арналған қондырғылар – бокс, люминесцентті микроскоп, центрифугалар, тоңазытқыш, магнитті араластырғыштар, термостаттар. Спирт шамы. Шыны ыдыстар (түтіктер, колбалар, матрастар, Петри шынылары, түтікшелер). Негізгі реактивтер мен қоректік орталар. Зертхана құжаттары мен ветеринария мекемелерінің бекітілген негізгі ережелері.

Вирусологиялық зертхана. Вирустық инфекциялардың аса қауіптілігіне және вирусологиялық зертеу жұмыстарына арнайы техникалардың қажеттілігіне байланысты дербес вирусологиялық зертханалардың ұйымдастырылуы қажет.

Вирусологиялық зертханаларда өндірістік және ғылыми – зерттеу жұмыстарын орындпу үшін келесі принциптерді міндетті түрде сақтау қажет:

1 Зертхана мен экспериментальды жануарларды ұстауға арналған бөлмелер міндетті түрде бөлек болуы;

2 Зертханаға, өндірістік бөлмелер мен вивариге келетін және олардан шығатын ауалардың стерильденуі;

3 Зерттеу жұмыстарныан қалған жануарлардың, зертхананың және өндірістік ғимараттан шыққан қалдықтар рациональды жүйеде жойылуы;

4 Зертхана мен өндіріс қызметкерлеріне арналған санитарлық өткізгіш қондырғылары мен киім ауыстыру орындары болуы;

5 Вирусологиялық зертханада сумен қамтамасыз ету жүйесінің, залалсыздандырылмаған қалдықтардың ағын сулар мен су құбырларына түсуінен қорғайтын қондырғылардың болуы;

6 Белсенді агенттермен тікелей жұмыс істейтін зертхана қызметкерлерін залалданудан сақтайтын (тыныс жолдары мен ашық кілегейлі қабықшаларын) заттардың болуы керек.

Ірі Вирусологиялық зертхана бірнеше бөлімнен тұрады:

1 Вирустармен тікелей жұмыс істейтін бөлім;

2 Жасуша өсінділерін дайындау бөлімі;

3 In vitro және in vivo жағдайларында серологиялық зерттеулерді жүргізу бөлімі;

4 Вирустарды физикалық әдістермен зерттеу бөлімі. Бұл бөлімде ультрацентрифуга, электронды микроскоп болуы қажет.

5 Жуу – автоклав блогы.

6 Сау және жұқтырылған жануарларға арналған виварилер.

7 Қосалқы бөлім (душ, жануарларды жарып сою, стерильдеу, ауны желдету және т.б.).

Вирустармен тікелей жұмыс істейтін немесе жасушалар өсінділері бөлімдері екі бөлмеден тұруы қажет:

Бірінші бөлме – боксқа кіреберіс;

Екіншісі – бокс бөлмесі.

Боксқа кіреберіс бөлмесінде жұмысқа қажетті саймандар: резеңке қолғаптар, халаттар, жеңғаптар және т.б. болады. Боксқа кіреберіс пен бокс бөлмелері бактериоцидті лампалармен жабдықталуы тиіс. Бұл бөлмелерде дезинфекциялағыш ерітінділермен ылғалды уборка және бір мезгілде ауасы залалсыздандыру жүргізіледі.

Вирустар және жасуша өсінділерімен жұмыс істеу бокс бөлмесінде жүргізіледі. Бокстағы үстелдің беті дезинфекциялағыш ерітінділермен ылғалдандырылған дәкемен жабылады.

Жұмысты жүргізгеннен кейін барлық қалдықтар мен материалдарды стерильді ыдысқа салып, темір жәшікте залалсыздандырады. Сосын барлық материалдарды қайтара дезинфекциялау үшін стерильдеу бөліміне жөнелтеді.



Вирусы бар материалдармен жұмыс істеу кезіндегі техника қауіпсіздігі. Вирусологиялық зертхананың барлық қызметкерлері ішкі тәртіпті, жеке сақтық м пен олардың алдын алу мен инфекцияның таралуына тосқауыл қою үшін келесі ережелерді сақтау қажет:

1 Ғимаратта халатсыз жүргізеге,жұмыс істеуге болмайды;

2 Зертхананың бір бөлімінен екінші бөліміне себепсіз өтуге болмайды; 3 Әрбір қызметкер тек өзіне бекітілген жұмыс орнында отыруы, өзіне тиісті қондырғыларды пайдалануы, сонымен қатар материалдарды бір бөлмеден екінші бір бөлмеге тасымалдамауы қажет;

4 Зертханада тамақ ішуге, темекі шегуге тыйым салынады;

5 Жұқпалы материалдармен және өсінділермен жұмыс істеу кезінде пинцет, ілмек, шпатель тәрізді саймандарды қолданып, жұмыс аяқталғаннан кейін міндетті түрде залалсыздандыру қажет;

6 Сұйық күйіндегі жұқпалы материалдарды сорып алу груша көмегімен іске асырылуы керек;

7 Материалдармен себінді жасау, препараттарды дайындау жұмыстармен спирт шамының жалынында жүргізілуі тиіс,

8 Жұмыс орнына немесе заттардыың бетіне шашылған жұқпалы материалдарды тез арада дезинфекциялау және стерильдеу қажет. Бұл жұмыстар зерхана жетекшісінің бақылауымен жүргізіледі.

9 жұмыс уақыты кезінде залалданған саймандар мен материалдар арнайы ыдыстарға (қақпағы бар шелек, бак) салынып, оларды залалсыздандыру үшін автоклав бөліміне жөнелтіледі;

10 Жұмыс аяқталғаннан кейін барлық материалдар мен өсінділер құлыптанатын бөлмелерге қойылады, ал жұмыс орындарының ретке келтірілуі қажет;

11 Жұмыс орындарында тазалық сақталуы тиіс. Жұмыс кезінде немесе жұмыс аяқталғаннан кейін қолды жақсылап жуып, дезинфекциялайды;

12 Зертхана бөлмелерін дезинфекциялағыш сұйықтықтармен ылғалдандырылған заттармен жуады;

13 Жұқпалы материалдар мен тірі өсінділерді кілтпен жабылатын шкафтарға, термостаттарға, сақтау қоймаларына салып, пломба салып қояды;

14 Тірі өсінділер мен жұқтырылған жануарлар күнделікті есептеліп, дәптерге немесе кітапқа тіркеліп отырады;

15 Зертхана қызметкерлерін міндетті түрде негізгі жұқпалы ауруларға қарсы егеді;

16 Физикалық әдістермен зерттеу бөлімінің (электрондық микроскопия, ультрацентрифугалау) қызметкерлері ультракүлгін сәулелерімен зақымдалудан сақтану шараларын ұстануы қажет.

17 Өрт пен жарылуды болдырмау үшін бір спирт шамымен екінші спирт шамын тұтатуға тыйым салынады, оларды тұтату үшін сіріңке немесе оттық қолдану тиіс;

18 Электр қондырғыларының контакты бөліктерін ұстауға, оқытушы немесе қызмет көрсетуші персоналдардың рұқсатынсыз электр қондырғылар мен аппаратураларды тоқ көзіне қосуға болмайды;

19 Химиялық және басқа дар реактивтермен жұмыс істеу ережелерін сақтау керек.

Әдебиеттер:

1 Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А Практикум по ветеринарной вирусологии // Москва, «Агропромиздат». 1989. С. 3-12.


Бақылау сұрақтары: 1 Ветеринариялық зертханада жұмыс істеу ережесі. 2 Ірі вирусологиялық зертханаларда қандай бөлімдер болады? 3 Вирусы бар материалдармен жұмыс істеу кезіндегі техника қауіпсіздігі.
Он бесінші зертханалық – тәжірибе сабағы

ТАУЫҚ ЭМБРИОНДАРЫ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ВИРУСОЛОГИЯДА ҚОЛДАНУ
Сабақтың мақсаты: Тауық эмбриондарының құрылысымен, тауық эмбриондарын жұқтыруға дацындау, вирусы бар материалдармен тауық эмбриондарын жұқтыру және жұқтырылған тауық эмбриондарын жарып тексеру тәсілдерімен танысу.

Материалдар мен жабдықтар. 9-11 күндік тауық эмбриондары, овоскоптар, эмальданған кюветалар. Физиологиялық ерітінді. Шыны түтіктерге арналған штативтер, эмбриондары салуға арналған ұяшықтар, спирт шамдары, резеңке грушалар, таяқшаға оралған тампондар, спирт, Петри шынылары, мөлшері 2-5 мл болатын шыны түтікшелер. Стерильді саймандар (шприцтер, иньекциялық инелер, көзге арналған және анатомиялық пинцеттер, қайшылар мен скальпельдер) салынған стерилизаторлар. Балқытылған парафин, шыныға жазатын қарындаш, лейкопластырь. Термостат, тоңазытқыш. Центрифуга, таразы, су моншасы.

Тауық эмбрионын зертхана жағдайында вирустарды өсіруде пайдалану ХХ ғасырдың 30-жылдарынан бастап іске асырыла бастады. Зертханалық жануарларға қарағанда тауық эмбриондарының артықтылықтары бар. Олардың қауызы мен қауызының астыңғы қабықшасы эмбриондардың сыртқы ортадан түсетін бактериялармен залалдануынан сақтайды және вирустарға өте сезімтал келеді. Тауық эмбриондары вирустарды өсіруге қолайлы орта, күтім мен азықты қажет етпейді және вирустарға қарсы антиденелерді түзбейді. Зертханалық жануарлар тәрізді тауық эмбриондарын вирусологияда келесі мақсаттар үшін: патологиялық материалдардан белсенді вирустарды анықтауда; биосынама қоюда; вирустарды бөліп алуда; вирустарды титрлеуде; вакцина дайындау үшін көп мөлшерде вирустарды жинауда; бейтараптау реакциясына қажетті тест – объект ретінде қолданады. Вирусы бар материалдармен жұқтыруға арналған тауық эмбриондарын келесі талаптар бойынша таңдап алады: тауық эмбриондарын жұқпалы аурулардан таза құс шаруашылығынан алады; жұмыртқа қауыздарында пигменттері болмау және таза болу (жууға болмайды) керек; Эмбриондардың жасы таңдап алған жұқтыру әдістеріне сәйкес болуы тиіс.

Тауық эмбрионының құрылысы. Әдетте тауықтар ұрықтанған, яғни ұрықтың бластула немесе ерте гаструла сатысындағы жұмыртқа шығарады. Осындай жұмыртқаны тауықтың дене қызуының температурасына дейін қыздырғанда ұрықтың ары қарай дамуы байқалады.

5 күн мен 12 күн аралығында инкубацияланған тауық эмбриондарын вирустарды жұқтыру жұмыстарныда пайдалануға болады. Эмбриондар дамып жатқан жұмыртқаның сырты ұсақ саңылаулары бар қауызбен қапталған, қауыздың ішкі жағында жанаса қабықша (қауызының астыңғы қабықшасы) орналасқан. Жұмыртқаның доғал жағында ауа камерасы болады. Ұрық (зародыш) денесі қауызға жақын, ал ұрықтың басы ауа камерасына қарай бағыттала орналасқан. Ұрық сұйықтыққа толы амнион қуысының ортасында орналасады, оның кіндігі саруызға жалғасып жатады. Қауыздың астыңғы қабықшасының ішкі жағында амнион мен сарыуыз қапшығын қоршап тұратын аллантальды қуыс бар. Ұрықтың дамуы кезінде аллантоис қабықшасы хорионмен қосылып, хорион – аллантоис қабықшасын (ХАҚ) құрайды.

Тауық эмбриондарында өсірілген вирустардың көпшілігі аллантоис және амнион сұйықтықтарында жиналып, дайын вирустық суспензияны құрайды. Инкубацияның бастапқы кезінде сарыуыз қапшығында ұрықтың дамуына қажетті қоректік заттар көп жиналып, эмбриогенездің 12 күндерінде ондағы қоректік заттар азаяды. Сондықтан вирусы бар материалдармен сарыуыз қапшығын жұқтыру инкубацияның 5-7 күндерінде жүргізіледі.

Амнион қуысы ұрықтардың дамуына қажетті буферлік орта болып есептеледі. Инкубация кезеңінің ортасына қарай бұл жерге 1 мл-ге дейін сұйықтық жиналады. Амнион қуысына жұқтыру үшін 6-10 күндік эмбриондар пайдаланылады.

Аллантоис қуысында зәр қышқылды тұздар, фосфорлы және азотты қосылыстар жиналады. Ұрықтардың дамуы, өсуі кездерінде аллантоис сұйықтығында қышқылды реакция жүреді. Аллантоис қуысы көлемінің максимальды ұлғаюы эмбриондар дамуының 9-12 күндері байқалады. Осыған байланысты аллантоис қуысына жұқтыру үшін 9-11 күндік эмбриондарды алады.

Хорион – аллантоис қабықшасындағы қан тамырлары қауыздың ішкі жағына бойлай орналасып, ұрықты оттегімен қамтамасыз етіп отырады, яғни эмбриондардың тыныс мүшесі қызметін атқарады. ХАҚ-ның максимальды жетілуі 11-13 күндері байқалатындықтан, жұқтыруға 10-12 күндік тауық эмбриондарын қолданады.



Тауық эмбриондарын жұқтыруға дайындау. Инкубаториялардан әкелінген эмбриондардың ауа камерасын жоғары қаратып, арнайы штативтерге салады да ылғалдылығы 60-70%-ды құрайтын, +370 С-ге реттелген термостаттарда инкубациялайды.

Тауық эмбриондарын жұқтыруға дайындау жұмыстарына овоскопиялау, қауыздарын дезинфекциялау және жұмыс орындарын дайындау жатады. Қараңғы жерде овоскопиялау арқылы жұмыртқаның ішкі құрылымын, ауа камерасын, ұрықтың орнаналасқан жері мен қан тамырлары жоқ зоналарды (0,5х0,5 см) анықтап, графитті қарындашпен белгі салады. Бұл белгілер арқылы вирусы бар материалдармен жұқтыратын орындарды таңдайды. Сонымен қатар, овоскопиялау арқылы ұрықтың тірі (ХАҚ қан тамырлары қанға толы, ұрық белсенді қозғалады) немесе өлі екендігін де анықтайды.

Тауық эмбриондарын бокс бөлмелерінде, асептикалық жағдайда жұқтырады. Боксқа кіреберіс бөлмесінде эмбрионның сырты қабығын йодталған спиртпен өңдегеннен кейін боксқа кіргізіп қайтара өңдейді.

Эмбриондарды дезинфекциялағыш ерітіндімен ылғалдандырылған 3-4 қабат дәкесі бар эмальданған кюветаның ішіне орналастырылған арнайы штативке бекітеді.

Жұмыста қайнату арқылы стерильденген саймандарды спиртке батырып, жалында күйдіргеннен кейін қолданады.

Тауық эмбриондарына экспериментальды жолмен жұқтыру әдістері. Тауық эмбриондарынавирусты жұқтырудың алты әдісі бар. Олардың ішінен ең жиі қолданатындары аллантоис қуысы мен хорион – аллантоис қабықшасына жұқтыру, сирегірек амнион қуысы және сарыуыз қапшығына, ал өте сирек жағдайда ұрық денесі және ХАҚ қан тамырларына жұқтырады. Жұқтыру әдістерін вирустың тропизмі мен жұқтыру мақсатына қарай таңдайды. Жұқтырудың барлық тәсілдерінде инфекциялық материалды 0,1-0,2 мл көлемінде енгізеді.

Аллантоис қуысына жұқтыру әдісінде тұмау, Ньюкасл ауруы, жылқылардың ринопневмониясы, везикулярлы стомаитінің вирустары жақсы көбейеді. Бұл жұқтыру әдісінің бірнеше нұсқасы (варианты) бар.

Тауық эмбрионының доғал жағын жоғары қаратып бекітеді. Ауа камерасының шекарасынан 5-6 мм жоғарыға қарай диаметрі 1 мм көлемінде қауызды ойып, вирустық материалы бар шприц инесін жұмыртқа осін бойлай 10-12 мм тереңдікке енгізу арқылы жұқтырады. Жұқтырғаннан кейін инені алып, қауыздағы тесікті бекіту үшін балқытылған стерильді парафинді тамызады. Бұл әдістің екінші нұсқасында ауа камерасының үстіңгі жағын ауаның біраз бөлігін шығару үшін теседі. Ал материалды жұқтыру үшін ХАҚ аймағының қан тамырлары жоқ жерінің қауызын тесіп, иненің ұшын небәрі 2-3 мм-ге дейін енгізген соң 0,1-0,2 мл вирустық материалды жұқтырып, ол жерді парафинмен бекітеді.



Хорион-аллантоис қабықшасына жұқтыру әдісін эпителитропты және пантропты вирустарды: шешек, құстардың жұқпалы ларинготрахеитін, ет қоректілер обасын, Ауески ауруын, қойлардың катаральды қызбасын және т.б. өсіру үшін қолданады. Жұқтырудың бұл түрінде вирустық материалды табиғи ауа камерасы мен жасанды ауа камералары арқылы енгізеді.

Табиғи ауа камерасы арқылы жұқтыру үшін штативка эмбрионның доғал жағын қаратып (ауа камерасы жоғарғы бетінде болуы керек) бекітеді. Ауа камерасының ортасынан диаметрі 15-20 мм көлемінде қауызды ойып, пинцеттің көмегімен қауыздың астыңғы қабықшасын ашады. ХАҚ-ның жалаңаштанған жеріне 0,2 мл вирус суспензиясын енгізіп, тесікті лейкопластырьмен немесе жапқыш шыныны балқытылған парафинмен бекіту арқылы жабады.

Жасанды ауа камерасы арқылы жұқтыру біріншісіне қарағанда жиі қолданылады. Бұл әдісте эмбрионды штативке горизонталды жағдайда, ұрықтың арқасын жоғары қаратып бекіткеннен кейін, қауызды екі жерден теседі. Біріншісінде ауа камерасының ортасынан кішкене ғана, ал екіншісінде қауыздың ұрық жатқан жағынан диаметрі 2-5 мм болатын тесік жасап, ХАҚ-ын жарақаттамай қауыздың астыңғы қабықшасын ауа кіретіндей етіп ажыратады. Сонан соң бірінші тесіктен табиғи ауа камерасы арқылы ХАҚ бетіне жұқтыратын материалды енгізіп, тесікті лейкопласырьмен бекітеді. Табиғи ауа камерасы жағындыға тесікті бекітпесе де болады. Себебі ондағы қауызының астыңғы қабықшасы бұзылмағандықтан қоршаған ортаның микрофлораларының түсуіне жол бермейді. Мұндай әдіспен жұқтырылған тауық эмбриондарын горизонтальды жағдайда, жанындағы тесікті жоғары қаратып инкубациялайды.

Сарыуыз қапшығына жұқтыруды хламидияларды, сонымен қатар Марек ауруының, жылқылардың ринопневмониясы, қойлардың катаральды қызбасы және т.б. вирустарын өсіруде пайдаланады. Бұл әдісте 5-7 күндік, кейде 2-3 күндік эмбриондар (Риф алқабының қызбасы вирусын өсіруге) қолданылады. Жұқтырудың екі жолы бар. Біріншісінде эмбрионды вертикальды жағдайда бекітіп, ауа камерасының ортасының тесігі арқылы инені 3,5-4 см тереңдікке, ұрықтың қарама-қарсы жағына қарай 450С-қа қиғаштап енгізу арқылы вирустық материалды жұқтырады. Екіншісінде горизонтальды күйде (ұрық астыңғы жағында, ал сарыуызқапшығы үстіңгі бетінде болуы керек) бекітілген жанынан жұқтырылады.

Амнион қуысына жұқтыруға 6-10 күндік эмбриондарды алады. Аталмыш әдісті тұмау, Ньюкасл ауруының, жылқылардың ринопневмониясының және т.б. вирустарын өсіруде қолданады. Жұқтырудың жабық және ашық әдісі болады.

Жабық әдісімен жұқтыру қараңғыланған бокста жүргізеді. Жұмыртқаны овоскопқа горизонталды жағдайда (ұрық жоғарғы жағында болуы тиіс) орналастырады. Ауа камерасының үстіндегі тесіктен ұшы мұқал инені ұрыққа бағыттай амнион қуысына енгізу арқылы жұқтырады. Иненің амнионға енгендігін ұрық денесінің қозғалысынан білуге болады.

Ашық әдісте вертикальды орналасқан жұмыртқаның ауа камерасы бетінен диаметрі 1,5-20 см болатын тесік жасайды. Осы жерден пинцет көмегімен қауыздың астыңғы қабықшасын ашады да анатомиялық пинцетпен амнион қабықшасын ХАҚ-мен бірге тартып тұрып, вирусы бар материалды шприцпен енгізеді. Қабықшаларды босатып, тесікті лейкопластырьмен бекіткен соң вертикальды жағдайда термостатта өсіреді.

Ұрықтың денесіне жұқтыру тәсілін амнион қуысына жұқтырған әдістер тәрізді 7-12 күндік тауық эмбриондарында жүргізеді. Бұл әдістерде енгізілген инені қозғалтқан кезде ұрық инемен бірге қозғалады. Жұқтыратын материалдар бас миына, дененің белгілі бір бөлімдеріне енгізіледі.

Хорион-аллантоис қабықшасының қан тамырларына жұқтыру.11-13 күндік тауық эмбриондарын овоскопиялау нәтижесінде қан тамырлары көрінген жерінің қауызын ашады да, сол жерге 1-2 тамшы спирт тамызып (қауыздың астыңғы қабықшасын біраз уақытқа дейін мөлдірлендіру үшін), қан тамырына жұқтыратын суспензияны енгізеді. Қауыздың жалаңаштанған жерін лейкопластырьмен бекітеді.

Жоғарыдағы әдістермен жұқтырылған тауық эмбриондарын +33-370С температураға реттелген термостатта инкубациялайды. Жұқтырылған эмбриондарды күнделікті овоскоппен бақылап отырады. Жұқтырғаннан кейін алғашқы 24 сағат аралығында өлімге ұшыраған эмбриондар алып тастайды. Себебі бұл уақыт аралығында бөгде микрофлоралармен ластанған, жұқтыру кезінде жарақаттанудан өлген эмбриондар жарамсыз болып есептеледі. Одан кейінгі эмбриондардың өлімге ұшырауы вирустардың көбеюі әсерінен болады. Мұндай эмбриондарды таңдап алып, тез арада тоңазытқышқа (+40С) ауыстырады. Тоңазытқыштағы эмбриондардың құрамындағы вирутардың белсенділігі ұзақ сақталады және ұлпалар тығыздалып, тамырлары босап, оларды жарып алуға жеңілдік тудырады.



Вирустар көбейген тауық эмбриондарының белгілері. Вируспен жұқтырылған тауық эмбриондары белгілі бір мерзімде өлімге ұшырайды. Құстардың шешегі мен ларинготрахеиті вирусымен зақымданған эмбрионның ХАҚ ісінеді, қанталайды, түйіндер пайда болады. Тауықтардың жұқпалы бронхитінің вирусымен зақымданған эмбрион сусызданады немесе мумияланады, мойыны бұралып кетеді, терісі гиперемияланады, ұрықтың ішкі мүшелерінде де вирустардың өсіп-өну белгілерінің байқалуы мүмкін.

Гемагглютинация реакциясының көмегімен эмбрионның құрамынан вирустар мен олардың титрлерін анықтауға болады.



Тауық эмбриондарын ашу және вирусы бар материалдарды алу. Тауық эмбриондарын вирустардың көбею белгілерін анықтау және вирусы бар материалдарды алу үшін асептикалық жағдайларды сақтай отырып ашады. Құрамында вирусы бар материалдар ретінде ХАҚ, ұрықтың ұлпалары, сарыуыз қапшығы, аллантоис пен амнион сұйықтықтары алынады. Аллантоис пен амнион сұйықтықтары құрамында вирусы бар дайын суспензия болып табылады.

Эмбрионды ашардан бұрын қауызды йодталған спиртпен өңдейді. Стерильді саймандардың көмегімен ауа камерасының үстіңгі жағындағы қауызды кесіп алады. Бұл жағдайда қайшыны ауа камерасының астындағы қабықшасына тигізбеу және қауыз ішкі жағына түспеуі керек.

Жалаңаштанған ХАҚ-ын пинцетпен көтеріп патологоанатомиялық өзгеріске ұшырағандығын байқап, сол жерін қайшымен кесіп алады. Ал ХАҚ-ының барлық жерлерін қарау үшін ұрықты, сарыуыз қапшығы мен белогын алып тастаған соң ХАҚ-ын қауыздан ажыратып, стерильді физиологиялық ерітінді құйылған Петри шынысына салады. ХАҚ шайып, екі пинцеттің көмегімен жазып, тексереді. Қабықшаның патологоанатомиялық өзгеріске ұшыраған жерлерін анық көру үшін Петри шынысының астына қара түсті қағаз қояды.

Қауыздың астыңғы қабықшасы мен ХАҚ-ын тесіп, аллантоис сұйықтығын (10 мл) Пастер түтікшемен сорып алады.

Аллантоис сұйықтыығн алғаннан кейін ұрықтың мойнының тұсынан түтікшемен амнион сұйықтығын (1 мл) сорып алады.

Сарыуыз қапышығын Петри шынысына салып, қайшымен кескеннен кейін физиологиялық ерітіндімен шаяды да сарыуыз қапшығының қабырғасын вирусы бар материал ретінде алады. Ұрықты пинцеттің көмегімен алып шығады.

Тауық эмбриондарын ашқаннан кейін міндетті түрде вирусы бар материалдардың тазалығын анықтау үшін бактериологиялық зерттеу жүргізеді. Ол үшін материалдардан ЕПС, ЕПА, ЕПБС және Сабура ортасына себінді жасайды. Вирусы бар материалдарды минус 250С немесе одан төменгі температурада сақтайды.
Әдебиеттер:

1 Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А Практикум по ветеринарной вирусологии // Москва, «Агропромиздат». 1989. С. 59-79.


Бақылау сұрақтары: 1 Вирусологияда тауық эмбриондарын қандай мақсаттарда қолданады? 2 Тауық эмбрионының құрылысы. 3 Тауық эмбриондарын жұқтыруға дайындау тәсілдері. 4 Тауық эмбриондарына экспериментальды жолмен жұқтыру тәсілдері. 5 Вирустар көбейген тауық эмбриондарының белгілері. 6 Тауық эмбриондарын ашу және вирусы бар материалдарды алу.
1   2   3   4   5


©dereksiz.org 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет