Микроорганизмдердің биохимиялық белсенділігі

Микроорганизмдердің протеолиттік қасиеттерін анықтау үшін зерттеуге алынған өсіндіні ЕПЖ, кәдімгі сүтке, кейде жылқының ұйыған қан сарысуына, тауық жұмыртқасының коагулирленген белогына себеді. Тік қатырылған ЕПЖ-не микробтарды бактериологиялық иненің көмегімен қоректік ортаның түбіне бойлай шаншу арқылы сеуіп, оларды термостатқа орналастырады, ал кейде (микробтың түріне байланысты) бөлме температурасында қалдырылады. Бактерия ферменттерінің әсерінен желатин протеолизге ұшыраған шыны түтіктердегі қоректік орта (ЕПЖ) сұйылады. Әр түрлі микроорганизмдер желатинді түрліше ыдыратады. Мысалы, сібір жарасының қоздырғышы ЕПЖ воронка түрінде, ал стафилококктар оны шұлық түрінде сұйылтады.

Микроорганизмдердің казеинді гидролиздеу қабілеті Эйкманның сүт қосылған агарында анықталады. Бұл агарды дайындау үшін су моншасында балқытылған стерильді 10 мл ЕПА-на 3 мл стерильді майсыздандырылған сүтті араластырып, Петри шыныларына құйғаннан кейін суытады. Микроб өсіндісін осы қоректік ортаға бактериологиялық ілмектің немесе шпательдің көмегімен себеді. Қоректік орталар 24-48 сағат бойы термостатта ұсталады. Казеиннің пептонизацияға ұшырауы – микроб колонияларының айналасындағы сүтті агардың мөлдірленуіне әкеледі. Бактерияларды сүтке себу кезіндегі протеолиз сүттің мөлдірленуіне және шыны түтіктің түбінде шырышты немесе борпылдақ тұнбаның түзілуімен сипатталады.

Бактериялардың белокты протеолизге ұшырату дәрежесін ферментация кезінде пайда болған ыдырау өнімдерінің түрлерін (индол, күкірт сутегін, аммиакты және т.б.) зерттеу арқылы анықтайды.

1 Сүзгіш қағаздың тілімен қымыздық қышқылының 12%-дық судағы қаныққан ыстық ерітіндісімен ылғалдандырып, ауада кептіреді. Тілімнің мөлшері: 10 х 0,5 см. Олар тығыз тығыны бар шыны сауытта сақталады. Индолдың түзілуін анықтау үшін зерттеуге алынған микроб өсіндісін шыны түтіктегі ЕПС немесе Хоттингер сорпасы бар қоректік орталарға себеді де, индикаторлық қағаздардың тілімен тығынның көмегімен қыстырып қояды. Индикаторлық қағаздардың ұшын қоректік ортаға тигізбеу керек. Шыны түтіктер термостатта 13⁰ С-та 1-3 тәулік ұсталады. Индолдың түзілуі индикаторлық қағаздың төменгі ұшының қызғылт түске боялуымен дәлелденеді.

2 Сүзгіш қағазды Эрлих реактивінің ерітіндісімен дымқылдандырады. Эрлих реактиві келесі қоспалардан тұрады: 3-5 г парадиметиламидобензальдегид, 50 мл 96%-дық спирт – ректификат, 10 мл таза концентрленген тұз қышқылы. Осы тәсілмен өңделген қағаздардың түсі сары болып, тығыз тығыны бар шыны сауытта сақталады. Индолдың түзілуі қағаздың ұшын қызғылт түстен қызыл күрең түске дейінгі аралықта боялуымен сипатталады. Басқс түс есепке алынбайды. Эрлих реактивінің көмегімен индолды басқа тәсілмен де анықтауға болады. Ол үшін 5 мл 2-3 тәуліктік бактериялардың өсіндісі бар шыны түтікке эфирдің 2-3 мл-ін қосады да оларды шайқап, тұндыруға қояды. Сонан соң Пастер пипеткасының көмегімен эфир қабатының астына Эрлих реактивінің 0,5-1 мл-ін қабаттайды. Бұл реакцияға керекті Эрлих реактиві басқаша дайындалады: 1 г парадиметиламидобензальдегид + 100 мл 96% этил спирті + 20 мл химиялық таза тұз қышқылы. Индол түзілгенде эфир мен сорпа өсіндісінің шекарасында 3-5 мин ішінде қызыл сақинаның пайда болады.

Күкірт сутегінің түзілуін анықтау үшін келесі тығыз қоректік орта дайындалады: 1 л стерильді 1,7-0,2% ЕПА-ға 0,2 г күкірт қышқылды темір (FeO₄), 0,3 г гипосульфит натрий, 12 мл индикаторлық финохромның 3% судағы ерітіндісін қосады. Қоректік ортаны стерильденген шыны түтіктерге 5-6 мл мөлшерінде құйып, буымен 20 минут аралығында стерильдейді. Қоректік ортаны қолданар алдында балқытады да, жазықтықта суытады. Бактерияларды қоректік ортаны жазықтығына, сонан соң шаншу арқылы оларды тік қатырылған ортаның төменгі бөліміне себеді. Бактериялар күкірт сутегін бөліп шығаратын болса, тік қатырылған орта қызыл түске, ал оның төменгі жағы қара түске боялады.

Күкірт сутегін қоректік ортада анықтау үшін 10%-дық сірке қышқылды қорғасынның ерітіндісімен дымқылданған сүзгіш қағаздың тілімдері қолданылады. Күкіртті қорғасынның пайда болуынан тілімнің ұшы қара түске боялады.

Микробтардың редукциялау қасиеттерін зерттеу қоректік орталарға құйылған органикалық бояулардың (метилен көгінің, малахитті жасылдың, бейтарап қызылдың және т.б.) түсінің өзгеруін анықтауға негізделген. Қоректік орта ретінде көбінесе сүт қолданылады. Зерттеуге арналған өсіндіні бактериологиялық ілмектің көмегімен бояуы бар қоректік ортаға себеді де, термостатта 24 сағат бойы ұстайды. Микроб ферменттерінің әсерінен бояу түссізденеді немесе оның бастапқы түсі өзгереді.

1 Бір тәуліктік агар өсіндісінің бетіне 2 мл 1%-дық сутегінің асқын тотығын таратады. Каталазаның барында бөлініп шыққанда қоректік ортаның бетінде көпіршіктер пайда болады.

2 Зат шынысының бетіне сутегінің асқын тотығының 3-10%-дық ерітіндісін тамызады да, оны ілмекпен алынған агар өсіндісінің массасымен араластырады. Газ көпіршіктерінің бөлініп шығуы каталазаның түзілуін дәлелдейді.

3 Каталазаны сорпа өсіндісінде анықтау үшін шыны түтікке өсіндінің 1 мл-ін құяды да оған 1 мл сутегі асқын тотығының 10%-дық ерітіндісін қосады. Каталаза барында газ көпіршіктері бөлініп шығады.

Бактериялардың гемолиттік қасиеттерін зерттеу. Кейбір бактериялар эриторциттерді талқандайтын ерекше заттар – гемотоксиндерді бөліп шығарады. Микроорганизмдердің осы қасиеттерін анықтау үшін оларды 5%- фибрині жоқ қаны бар қоректік ортаға себеді (қанды ЕПА). Гемолиттік қасиеттері бар микробтардың мекендерінің айналасында мөлдір аймақ (түссіз немесе боялған) пайда болады. Сұйық қоректік ортаға себілген мұндай микробтар эритроциттерді гемолизге ұшыратып, ортаны мөлдірлетеді.

Әдебиеттер:

1 Бұлашев А.Қ., Сұраншиев Ж.А., Жұмабаев Х.Ж. Жалпы микробиология пәнінен ветеринариялық медицина факультетінде оқитын студенттердің зертханалық тәжірибе сабақтарына арналған әдістемелік нұсқауы. Астана, 2005ж. 39-43 беттер. 2 Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии // Москва, «Агропромиздат». 1988. С. 76-80. 3 Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии // Москва, «Агропромиздат». 1989. С. 74-80.

Вирусологиялық зертханаларда өндірістік және ғылыми – зерттеу жұмыстарын орындпу үшін келесі принциптерді міндетті түрде сақтау қажет:

1 Зертхана мен экспериментальды жануарларды ұстауға арналған бөлмелер міндетті түрде бөлек болуы;

2 Зертханаға, өндірістік бөлмелер мен вивариге келетін және олардан шығатын ауалардың стерильденуі;

3 Зерттеу жұмыстарныан қалған жануарлардың, зертхананың және өндірістік ғимараттан шыққан қалдықтар рациональды жүйеде жойылуы;

4 Зертхана мен өндіріс қызметкерлеріне арналған санитарлық өткізгіш қондырғылары мен киім ауыстыру орындары болуы;

5 Вирусологиялық зертханада сумен қамтамасыз ету жүйесінің, залалсыздандырылмаған қалдықтардың ағын сулар мен су құбырларына түсуінен қорғайтын қондырғылардың болуы;

6 Белсенді агенттермен тікелей жұмыс істейтін зертхана қызметкерлерін залалданудан сақтайтын (тыныс жолдары мен ашық кілегейлі қабықшаларын) заттардың болуы керек.

Ірі Вирусологиялық зертхана бірнеше бөлімнен тұрады:

1 Вирустармен тікелей жұмыс істейтін бөлім;

2 Жасуша өсінділерін дайындау бөлімі;

3 In vitro және in vivo жағдайларында серологиялық зерттеулерді жүргізу бөлімі;

4 Вирустарды физикалық әдістермен зерттеу бөлімі. Бұл бөлімде ультрацентрифуга, электронды микроскоп болуы қажет.

5 Жуу – автоклав блогы.

6 Сау және жұқтырылған жануарларға арналған виварилер.

7 Қосалқы бөлім (душ, жануарларды жарып сою, стерильдеу, ауны желдету және т.б.).

Вирустармен тікелей жұмыс істейтін немесе жасушалар өсінділері бөлімдері екі бөлмеден тұруы қажет:

Бірінші бөлме – боксқа кіреберіс;

Екіншісі – бокс бөлмесі.

Боксқа кіреберіс бөлмесінде жұмысқа қажетті саймандар: резеңке қолғаптар, халаттар, жеңғаптар және т.б. болады. Боксқа кіреберіс пен бокс бөлмелері бактериоцидті лампалармен жабдықталуы тиіс. Бұл бөлмелерде дезинфекциялағыш ерітінділермен ылғалды уборка және бір мезгілде ауасы залалсыздандыру жүргізіледі.

Вирустар және жасуша өсінділерімен жұмыс істеу бокс бөлмесінде жүргізіледі. Бокстағы үстелдің беті дезинфекциялағыш ерітінділермен ылғалдандырылған дәкемен жабылады.

Жұмысты жүргізгеннен кейін барлық қалдықтар мен материалдарды стерильді ыдысқа салып, темір жәшікте залалсыздандырады. Сосын барлық материалдарды қайтара дезинфекциялау үшін стерильдеу бөліміне жөнелтеді.

1 Ғимаратта халатсыз жүргізеге,жұмыс істеуге болмайды;

2 Зертхананың бір бөлімінен екінші бөліміне себепсіз өтуге болмайды; 3 Әрбір қызметкер тек өзіне бекітілген жұмыс орнында отыруы, өзіне тиісті қондырғыларды пайдалануы, сонымен қатар материалдарды бір бөлмеден екінші бір бөлмеге тасымалдамауы қажет;

4 Зертханада тамақ ішуге, темекі шегуге тыйым салынады;

5 Жұқпалы материалдармен және өсінділермен жұмыс істеу кезінде пинцет, ілмек, шпатель тәрізді саймандарды қолданып, жұмыс аяқталғаннан кейін міндетті түрде залалсыздандыру қажет;

6 Сұйық күйіндегі жұқпалы материалдарды сорып алу груша көмегімен іске асырылуы керек;

7 Материалдармен себінді жасау, препараттарды дайындау жұмыстармен спирт шамының жалынында жүргізілуі тиіс,

8 Жұмыс орнына немесе заттардыың бетіне шашылған жұқпалы материалдарды тез арада дезинфекциялау және стерильдеу қажет. Бұл жұмыстар зерхана жетекшісінің бақылауымен жүргізіледі.

9 жұмыс уақыты кезінде залалданған саймандар мен материалдар арнайы ыдыстарға (қақпағы бар шелек, бак) салынып, оларды залалсыздандыру үшін автоклав бөліміне жөнелтіледі;

10 Жұмыс аяқталғаннан кейін барлық материалдар мен өсінділер құлыптанатын бөлмелерге қойылады, ал жұмыс орындарының ретке келтірілуі қажет;

11 Жұмыс орындарында тазалық сақталуы тиіс. Жұмыс кезінде немесе жұмыс аяқталғаннан кейін қолды жақсылап жуып, дезинфекциялайды;

12 Зертхана бөлмелерін дезинфекциялағыш сұйықтықтармен ылғалдандырылған заттармен жуады;

13 Жұқпалы материалдар мен тірі өсінділерді кілтпен жабылатын шкафтарға, термостаттарға, сақтау қоймаларына салып, пломба салып қояды;

14 Тірі өсінділер мен жұқтырылған жануарлар күнделікті есептеліп, дәптерге немесе кітапқа тіркеліп отырады;

15 Зертхана қызметкерлерін міндетті түрде негізгі жұқпалы ауруларға қарсы егеді;

16 Физикалық әдістермен зерттеу бөлімінің (электрондық микроскопия, ультрацентрифугалау) қызметкерлері ультракүлгін сәулелерімен зақымдалудан сақтану шараларын ұстануы қажет.

17 Өрт пен жарылуды болдырмау үшін бір спирт шамымен екінші спирт шамын тұтатуға тыйым салынады, оларды тұтату үшін сіріңке немесе оттық қолдану тиіс;

18 Электр қондырғыларының контакты бөліктерін ұстауға, оқытушы немесе қызмет көрсетуші персоналдардың рұқсатынсыз электр қондырғылар мен аппаратураларды тоқ көзіне қосуға болмайды;

19 Химиялық және басқа дар реактивтермен жұмыс істеу ережелерін сақтау керек.

Әдебиеттер:

1 Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А Практикум по ветеринарной вирусологии // Москва, «Агропромиздат». 1989. С. 3-12.

5 күн мен 12 күн аралығында инкубацияланған тауық эмбриондарын вирустарды жұқтыру жұмыстарныда пайдалануға болады. Эмбриондар дамып жатқан жұмыртқаның сырты ұсақ саңылаулары бар қауызбен қапталған, қауыздың ішкі жағында жанаса қабықша (қауызының астыңғы қабықшасы) орналасқан. Жұмыртқаның доғал жағында ауа камерасы болады. Ұрық (зародыш) денесі қауызға жақын, ал ұрықтың басы ауа камерасына қарай бағыттала орналасқан. Ұрық сұйықтыққа толы амнион қуысының ортасында орналасады, оның кіндігі саруызға жалғасып жатады. Қауыздың астыңғы қабықшасының ішкі жағында амнион мен сарыуыз қапшығын қоршап тұратын аллантальды қуыс бар. Ұрықтың дамуы кезінде аллантоис қабықшасы хорионмен қосылып, хорион – аллантоис қабықшасын (ХАҚ) құрайды.

Тауық эмбриондарында өсірілген вирустардың көпшілігі аллантоис және амнион сұйықтықтарында жиналып, дайын вирустық суспензияны құрайды. Инкубацияның бастапқы кезінде сарыуыз қапшығында ұрықтың дамуына қажетті қоректік заттар көп жиналып, эмбриогенездің 12 күндерінде ондағы қоректік заттар азаяды. Сондықтан вирусы бар материалдармен сарыуыз қапшығын жұқтыру инкубацияның 5-7 күндерінде жүргізіледі.

Амнион қуысы ұрықтардың дамуына қажетті буферлік орта болып есептеледі. Инкубация кезеңінің ортасына қарай бұл жерге 1 мл-ге дейін сұйықтық жиналады. Амнион қуысына жұқтыру үшін 6-10 күндік эмбриондар пайдаланылады.

Аллантоис қуысында зәр қышқылды тұздар, фосфорлы және азотты қосылыстар жиналады. Ұрықтардың дамуы, өсуі кездерінде аллантоис сұйықтығында қышқылды реакция жүреді. Аллантоис қуысы көлемінің максимальды ұлғаюы эмбриондар дамуының 9-12 күндері байқалады. Осыған байланысты аллантоис қуысына жұқтыру үшін 9-11 күндік эмбриондарды алады.

Хорион – аллантоис қабықшасындағы қан тамырлары қауыздың ішкі жағына бойлай орналасып, ұрықты оттегімен қамтамасыз етіп отырады, яғни эмбриондардың тыныс мүшесі қызметін атқарады. ХАҚ-ның максимальды жетілуі 11-13 күндері байқалатындықтан, жұқтыруға 10-12 күндік тауық эмбриондарын қолданады.

Тауық эмбриондарын жұқтыруға дайындау жұмыстарына овоскопиялау, қауыздарын дезинфекциялау және жұмыс орындарын дайындау жатады. Қараңғы жерде овоскопиялау арқылы жұмыртқаның ішкі құрылымын, ауа камерасын, ұрықтың орнаналасқан жері мен қан тамырлары жоқ зоналарды (0,5х0,5 см) анықтап, графитті қарындашпен белгі салады. Бұл белгілер арқылы вирусы бар материалдармен жұқтыратын орындарды таңдайды. Сонымен қатар, овоскопиялау арқылы ұрықтың тірі (ХАҚ қан тамырлары қанға толы, ұрық белсенді қозғалады) немесе өлі екендігін де анықтайды.

Тауық эмбриондарын бокс бөлмелерінде, асептикалық жағдайда жұқтырады. Боксқа кіреберіс бөлмесінде эмбрионның сырты қабығын йодталған спиртпен өңдегеннен кейін боксқа кіргізіп қайтара өңдейді.

Эмбриондарды дезинфекциялағыш ерітіндімен ылғалдандырылған 3-4 қабат дәкесі бар эмальданған кюветаның ішіне орналастырылған арнайы штативке бекітеді.

Жұмыста қайнату арқылы стерильденген саймандарды спиртке батырып, жалында күйдіргеннен кейін қолданады.

Тауық эмбриондарына экспериментальды жолмен жұқтыру әдістері. Тауық эмбриондарынавирусты жұқтырудың алты әдісі бар. Олардың ішінен ең жиі қолданатындары аллантоис қуысы мен хорион – аллантоис қабықшасына жұқтыру, сирегірек амнион қуысы және сарыуыз қапшығына, ал өте сирек жағдайда ұрық денесі және ХАҚ қан тамырларына жұқтырады. Жұқтыру әдістерін вирустың тропизмі мен жұқтыру мақсатына қарай таңдайды. Жұқтырудың барлық тәсілдерінде инфекциялық материалды 0,1-0,2 мл көлемінде енгізеді.

Аллантоис қуысына жұқтыру әдісінде тұмау, Ньюкасл ауруы, жылқылардың ринопневмониясы, везикулярлы стомаитінің вирустары жақсы көбейеді. Бұл жұқтыру әдісінің бірнеше нұсқасы (варианты) бар.

Тауық эмбрионының доғал жағын жоғары қаратып бекітеді. Ауа камерасының шекарасынан 5-6 мм жоғарыға қарай диаметрі 1 мм көлемінде қауызды ойып, вирустық материалы бар шприц инесін жұмыртқа осін бойлай 10-12 мм тереңдікке енгізу арқылы жұқтырады. Жұқтырғаннан кейін инені алып, қауыздағы тесікті бекіту үшін балқытылған стерильді парафинді тамызады. Бұл әдістің екінші нұсқасында ауа камерасының үстіңгі жағын ауаның біраз бөлігін шығару үшін теседі. Ал материалды жұқтыру үшін ХАҚ аймағының қан тамырлары жоқ жерінің қауызын тесіп, иненің ұшын небәрі 2-3 мм-ге дейін енгізген соң 0,1-0,2 мл вирустық материалды жұқтырып, ол жерді парафинмен бекітеді.

Жоғарыдағы әдістермен жұқтырылған тауық эмбриондарын +33-37⁰С температураға реттелген термостатта инкубациялайды. Жұқтырылған эмбриондарды күнделікті овоскоппен бақылап отырады. Жұқтырғаннан кейін алғашқы 24 сағат аралығында өлімге ұшыраған эмбриондар алып тастайды. Себебі бұл уақыт аралығында бөгде микрофлоралармен ластанған, жұқтыру кезінде жарақаттанудан өлген эмбриондар жарамсыз болып есептеледі. Одан кейінгі эмбриондардың өлімге ұшырауы вирустардың көбеюі әсерінен болады. Мұндай эмбриондарды таңдап алып, тез арада тоңазытқышқа (+4⁰С) ауыстырады. Тоңазытқыштағы эмбриондардың құрамындағы вирутардың белсенділігі ұзақ сақталады және ұлпалар тығыздалып, тамырлары босап, оларды жарып алуға жеңілдік тудырады.

Гемагглютинация реакциясының көмегімен эмбрионның құрамынан вирустар мен олардың титрлерін анықтауға болады.

Эмбрионды ашардан бұрын қауызды йодталған спиртпен өңдейді. Стерильді саймандардың көмегімен ауа камерасының үстіңгі жағындағы қауызды кесіп алады. Бұл жағдайда қайшыны ауа камерасының астындағы қабықшасына тигізбеу және қауыз ішкі жағына түспеуі керек.

Жалаңаштанған ХАҚ-ын пинцетпен көтеріп патологоанатомиялық өзгеріске ұшырағандығын байқап, сол жерін қайшымен кесіп алады. Ал ХАҚ-ының барлық жерлерін қарау үшін ұрықты, сарыуыз қапшығы мен белогын алып тастаған соң ХАҚ-ын қауыздан ажыратып, стерильді физиологиялық ерітінді құйылған Петри шынысына салады. ХАҚ шайып, екі пинцеттің көмегімен жазып, тексереді. Қабықшаның патологоанатомиялық өзгеріске ұшыраған жерлерін анық көру үшін Петри шынысының астына қара түсті қағаз қояды.

Қауыздың астыңғы қабықшасы мен ХАҚ-ын тесіп, аллантоис сұйықтығын (10 мл) Пастер түтікшемен сорып алады.

Аллантоис сұйықтыығн алғаннан кейін ұрықтың мойнының тұсынан түтікшемен амнион сұйықтығын (1 мл) сорып алады.

Сарыуыз қапышығын Петри шынысына салып, қайшымен кескеннен кейін физиологиялық ерітіндімен шаяды да сарыуыз қапшығының қабырғасын вирусы бар материал ретінде алады. Ұрықты пинцеттің көмегімен алып шығады.

Тауық эмбриондарын ашқаннан кейін міндетті түрде вирусы бар материалдардың тазалығын анықтау үшін бактериологиялық зерттеу жүргізеді. Ол үшін материалдардан ЕПС, ЕПА, ЕПБС және Сабура ортасына себінді жасайды. Вирусы бар материалдарды минус 25⁰С немесе одан төменгі температурада сақтайды.
Әдебиеттер:

1 Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А Практикум по ветеринарной вирусологии // Москва, «Агропромиздат». 1989. С. 59-79.