Негіздерімен "Ветеринариялық медицина", "Ветеринариялық санитария" мамандықтары бойынша ауыл шаруашылық жоғары оқу орындарына арналған оқу құралы Алматы, 2013 3

32 
Полимеразалық тізбектеу реакциясы бактерия немесе вирустардың генін in 
vitro жағдайында термостабильді ДНҚ-полимераза ферментінің көмегімен 
бірнеше миллион есе көбейтіп алып (амплификация), электрофорезбен 
анықтауға бағытталған. Бұл реакция ДНҚ репликациясы деп те аталады. 
Табиғи жағдайда ДНҚ репликациясы бірнеше сатыдан тұрады: 1) ДНҚ 
денатурациясы (ДНҚ қос жіпшесінің тарқалып, ажырауы); 2) ДНҚ-ның 
синтезделуіне қажетті қысқа екі тізбекті ДНҚ учаскесінің қалыптасуы; 3) 
ДНҚ-ның жаңа тізбегінің синтезделуі (қос жіпшенің комплементарлы 
құрастырылуы).
Бұл реакцияда микроорганизмдер генінің учаскесінің құрылымын 
қайталауға қатынасатын, жасанды жолмен синтезделген олигонуклеотид пен 
Tag-полимераза ферменті қолданылады. Tag-полимераза ферментінің 
көмегімен ДНҚ-ның телімді фрагменті қалыптасады. Жаңадан қалыптасқан 
ДНҚ фрагменттері нуклеин қышқылдарының жаңа тізбектерін синтездеуге 
арналған матрица ретінде амплификацияның келесі циклдерінде пайдала-
нылады. 
Полимеразалық тізбектеу реакциясының қойылымы үш кезеңнен 
тұрады: биологиялық материалдардан ДНҚ бөліп алу; полимеразалық 
тізбекті реакцияны қою; электрофорез немесе гибридизациялы-ферменттік 
детекция (амплификация өнімдерінің детекциясы).
Жұмыстың әрбір кезеңі міндетті түрде жеке бөлмелерде, санитарлық-
гигиеналық талаптар мен санитарлық-эпидемиологиялық ережелерді сақтай 
отыра, ПТР-ға арналған жиынтық көмегімен жүргізілуі тиіс. ПТР-ға арналған 
жиынтық құрамы үш комплекттен тұрады: №1 комплект – биологиялық 
материалдардан ДНҚ бөліп алуға, №2 комплект – ДНҚ амплификациясына, 
ал №3 комплект – ДНҚ детекциялауға арналған. 
ДНҚ бөліп алуға қажетті комплект құрамына лизиске ұшыратушы 
ерітінділер мен сорбент кіреді. Үлгілерді өңдеу жұмыстары көлемі 1,5 мл 
болатын микроцентрифуга түтіктерінде 90-120 минут бойы жүргізіледі. 
Центрифугаланған үлгі тұнбасын лизиске ұшыратушы ерітіндімен өңдеп, 
депротеинизацияланғаннан кейін сорбент көмегімен тазартады. 
Полимеразалық тізбектеу реакциясын қою үшін қолданылатын комплект 
құрамына ПТР-буфер, дезоксинуклеозидүшфосфаттар қоспасы, телімді қос 
олигонуклеотидті праймерлер, Tag-полимераза, минералды май кіреді. 
Зерттеуге алынған үлгінің белгілі бір мөлшерін арнайы «Eppendorf» 
түтікшелеріне енгізгеннен кейін үстінен амплификациялаушы қоспаларды, 
Tag-полимераза ферментін және бір тамшы минералды майды қосады да 
автоматтандырылған термостатта амплификация процесі 2-3 сағат аралы-
ғында жүргізіледі. Зерттеуге алынған үлгілермен бірге бақылау үлгілері де 
қатар қойылады. 
Нәтижелерді тіркеуге арналған комплект құрамына электрофорез 
буферлерінің қоспалары мен агароза гелі жатады. Жұмыстың бұл кезеңі 
амплификацияланған телімді ДНҚ фрагменттерін құрамында этидий бромиді 

33 
бар 1%-ды агароза геліндегі электрофорез көмегімен іске асырылады. 
Электрофореграмма нәтижесі ультракүлгін сәуле шығаратын трансиллюми-
наторда оң нәтиже көрсеткен амплификация өнімдері (ДНҚ) мен бақылауға 
алынған ДНҚ препаратында қызғылт-сары түсті болып жарқырап көрінеді.
Төменде сиыр бруцеллезінің балауына Қазақстанда өндірілетін диагнос-
тикалық препараттарды қолданып, практикалық жағдайда қолдануға ыңғай-
ландырылып, ұсынылған (Сайдулдин Т.С., Қасымов Е.И., 1990) ИФТ-ның 
жанама вариантын қою, нәтижесін есепке алу әдістемесі көрсетіледі (ҚР 
АШМ ғылыми-техникалық кеңесінде қаралып, қолданылуы бекітілген).

жүктеу/скачать 3.12 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: