Орындаған: Бб18-03к Тексерген: Алтыбаева Н. Жоспары
ПТР кезеңдеріне сипаттама
жүктеу/скачать 2.11 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Thermusaquaticus(Taq-полимераза), Pyrococcusfuriosus[en] (Pfu-полимераза) Pyrococcuswoesei(Pwo-полимераза) Thermusthermophilus(Tth-полимераза)
| ПТР кезеңдеріне сипаттама
дәрігер пациенттен зерттеу үшін материал алып, оны арнайы өңдеуге жібереді. өңдеу процесінде ДНҚ қос спиралы жеке жіптерге бөлінеді Науқастың материалына реакцияның "тазалығына" кедергі келтіретін органикалық заттарды ерітетін арнайы сұйықтық қосылады ДНҚ шаблондарын-ДНҚ — ның "клондалуы" болатын инфекциялардың ДНҚ молекулаларын қолданады. ДНҚ күшейтілуінің негізі ДНҚ-ның бір тізбегін екі есе көбейту арқылы жүзеге асырылатын ДНҚ — ның ДНҚ репликациясын аяқтаудың табиғи процесіне негізделген. ДНҚ полимераза матрицалық тізбекті тұқым ретінде праймерді қолдана отырыпкөбейтеді. Жиі қолданылатын TaqжәнеPfu полимеразалары72°C-табелсенді. Әдетте, ұзарту уақыты әр мың базалық жұп үшін бірминутқа тең қабылданады. Элонгация температурасы полимеразаға байланысты. Бұл кезең 7-10 минутқа созылады. Элонгация. Барлық циклдар аяқталғаннан кейін, барлық Бір тізбекті фрагменттерді аяқтау үшін көбінесе соңғы элонгацияның қосымша кезеңі жасалады. Қарапайым жағдайда ПТРжүргізу үшін келесі компоненттер қажет: Термостабельді ДНҚ полимераза-ДНҚ полимерлеу реакциясынкатализдейтін фермент Қажетті ДНҚ фрагментінің әртүрлі тізбектерінің қарама-қарсы ұштарына қосымша екіпраймер. ПТР қолдану үшін полимераза ұзақ уақыт бойыжоғары температурада белсенді болуы керек,сондықтан термофилдерден оқшауланған ферменттер қолданылады Дезоксирибо[fr] нуклеозидтрифосфаттары (dATP,dGTP,dCTP,dTTP). Полимераза жұмыс істеуі үшін қажет Mg2+иондары. Реакцияның қажетті жағдайларын қамтамасыз ететін буферлік ерітінді—рН,ерітіндінің иондық күші. Реакциялық қоспаның булануын болдырмау үшін пробиркаға жоғары қайнаған май,мысалы, вазелин қосылады. Thermusaquaticus(Taq-полимераза), Pyrococcusfuriosus[en] (Pfu-полимераза) Pyrococcuswoesei(Pwo-полимераза) Thermusthermophilus(Tth-полимераза) ПТРүшін праймерлерді жобалау кезінде бірнеше параметрлерді ескеру қажет.Олардың ішінде ең маңыздылары бар: праймердің қосымша тізбегі; праймерұзындығы; мақсатты сайттың екіншіқұрылымы; G / Cмазмұны және полипиримидинді(Т, С)немесеполипуринді(A, G)созылған учаскелер; "балқу температурасы(Tm)және күйдіру температурасы; праймердің қайталама құрылымы; праймерлердіңгомо -және гетеродимеризациясы. Праймерұзындығы Ең дұрысы, праймердің мөлшері15-тен 30нуклеотидке дейін болуы керек.Праймерлер тым қысқа болмауы керек,егер бұл арнайы қолдану үшін қажет болмаса. Балқу температурасы.Олигонуклеотидті праймерлердің екеуіде бірдей балқу температурасына ие болатындайетіп жасалуы керек.Егер праймерлерTm –ге сәйкес келмесе,күшейту аз болады немесе мүлдем жұмыс істемеуі мүмкін,өйткені жоғарыTm праймері төмен температурада дұрыс жұмыс істемейді. Біржұптың екі праймеріарасындағы Тм айырмашылығы4-6градустан аспауы керек.Егер екі праймердің Тм айтарлықтай өзгерсе, онда ең аз Тм бар праймерді 3& apos; ұшынан(соңғы өнімнің мөлшерін сақтай отырып)немесе 5& apos; ұшынан(эквивалентті)ұзартуғаболады.соңғы өнімнің мөлшерін ұлғайту). Праймерді"тазарту"температурасы. Ta праймері-бұл праймерді матрицамен будандастыратын температура.Ta 4-5оС(және кейбір авторлардың пікірінше, 1-2оС)TM праймерінен төмен. жүктеу/скачать 2.11 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|