қалады (оң нәтиже). Субстраттың ыдырауы
стоп-реагент ерітіндісімен
тоқтатылып, реакция нәтижелері фотоколориметриялық әдіспен анықталады.
Сабақ жоспарының үлгісі: 1 Білім алушыларға сауалнама жүргізу; 2
Сабақ тақырыбы бойынша оқытушының түсіндіруі; 3 ИФТ түрлі қойылым
әдістерін көрсету; 4 Студенттердің өзіндік жұмысы; 5 Сабақты қорытындылау;
6 Келесі сабаққа тапсырма.
Бақылау сұрақтары: 1 ИФТ қоюдың жалпы принциптері? 2 ИФТ-дың әр
түрлі варианттарын қою кезіндегі негізгі этаптарын атаңыз? 3 ИФТ-дың
«жанама», «сэндвич», «бәсекелі» қойылымдарына сипаттама беріңіз? 4 ИФТ-
дың нәтижелерін бағалау қалай жүргізіледі?
16 тақырып. ПОЛИМЕРАЗАЛЫҚ ТІЗБЕКТІ РЕАКЦИЯ және
ДНҚ-ЗОНД ӘДІСІ
Сабақтың мақсаты: вирустардың
нуклеин қышқылдарын бөліп алу,
полимеразалық тізбекті реакция (ПТР) және ДНҚ-зонд әдістерін қою, ПТР
нәтижелерін горизонтальды электрофорез көмегімен және ДНҚ-зонд
нәтижелерін анықтау тәсілдерімен танысу.
Сабақтың материалдық қамтамасыз етілуі
Вирустық ауруларды ПТР әдісімен балауға арналған тест-жүйелер, ПТР-
бокс, амплификатор, «Эппендорф» түтіктеріне арналған термостат (25-100°С),
колбасы
бар вакуумдық сорғыш, «Эппендорф» микротүтіктеріне арналған
микроцентрифуга (12 000-16 000 g), центрифуга/вортекс, горизонтальды
электрофорезге арналған камера, тұрақты тоқ көзі (150-460 V), ультракүлгінді
жарық сәуле
шығаратын трансиллюминатор, дозаторлар, бір реттік
полипропиленді түтіктер (1,5 мл), микротүтіктерге арналған штативтер, мкл
дозаторларға арналған ұштамалар (200,0-1000,0), дезинфекциялағыш ерітіндісі
бар ыдыс.
ПТР әдісі зерттеуге алынған сынама құрамынан вирустардың генін
in vitro
жағдайында термостабильді ДНҚ-полимераза ферментінің
көмегімен бірнеше
миллион есе көбейтіп алып (амплификация), электрофорезбен анықтауға
бағытталған. Бұл реакция ДНҚ репликациясы деп те аталады. Табиғи жағдайда
ДНҚ репликациясы бірнеше сатыдан тұрады: 1) ДНҚ денатурациясы (ДНҚ қос
жіпшесінің тарқатылып, ажырауы); 2) ДНҚ-ның синтезделуіне қажетті қысқа
екі тізбекті
ДНҚ учаскесінің қалыптасуы; 3) ДНҚ-ның жаңа тізбегінің
синтезделуі (қос жіпшенің комплементарлы құрастырылуы).
Бұл реакцияда ауру қоздырғыш генінің учаскесінің құрылымын қайталауға
қатынасатын, жасанды жолмен синтезделген олигонуклеотид пен
Tag-
полимераза ферменті қолданылады.
Tag-полимераза ферментінің көмегімен
ДНҚ-ның телімді фрагменті қалыптасады.
Жаңадан қалыптасқан ДНҚ
фрагменттері нуклеин қышқылдарының жаңа тізбектерін синтездеуге арналған
матрица ретінде амплификация циклдерінде пайдаланылады. Ветеринария
практикасында ПТР әдісімен жануарлардың вирустық ауруларын балау
жұмыстарында коммерциялық тест-жүйелер қолданылады.
ПТР-ға арналған тест-жүйелер құрамы төрт жинақтан тұрады: №1 жинақ –
биологиялық материалдардан ДНҚ бөліп алуға арналған,
оның құрамына
лизиске ұшыратушы ерітінділер, сорбент суспензиясы және ДНҚ элюцияға
арналған буфер кіреді; №2 жинақ – ДНҚ амплификациясына немесе ПТР қоюға
арналған. Бұл жинақ құрамы ПТР-буфер, дезоксинуклеозидүшфосфаттар
қоспасы, телімді қос олигонуклеотидті праймерлер,
Tag-полимераза,
минералды
майдан тұрады; №3 жинақ – ПТР өнімін детекциялауға арналған,
оған этидий бромиді бар буферлік ерітінді концентраты және 1%-ды агароза
гелі кіреді; №4 жинақ – бақылау сынамалары, оның құрамы позитивті (ПБС),
негативті (НБС) және ішкі бақылау (ІБС) сынамаларынан тұрады.
Достарыңызбен бөлісу: