Сұраншиев Ж.Ә. «Ветеринарлық вирусология» пэоәК

Жұмыстың әрбір кезеңі міндетті түрде жеке бөлмелерде, санитарлық-
гигиеналық талаптар мен санитарлық-эпидемиологиялық ережелерді сақтай 
отыра ПТР-ға арналған нұсқаулыққа сәйкес тест-жүйе көмегімен жүргізілуі 
тиіс.
Вирустардың нуклеин қышқылдарын (ДНҚ) 0,1 мл құрамында вирусы бар 
суспензиядан ДНҚ бөліп алуға арналған комплект көмегімен бөліп алады.
І кезең – вирус ДНҚ бөліп алу. Вирус ДНҚ бөліп алудың мақсаты – аз 
мөлшердегі (0,1 мл) сынаманы концентрациялау, ПТР ингибиторларын жою 
және тазартылған ДНҚ препаратын бөліп алу. Ол үшін жасушаларды лизиске 
ұшыратушы және нуклеопротеидтік кешенді деструкциялаушы ерітіндісі бар 
түтікке 0,1 мл дайындалған сынаманы қосады. Содан кейін ДНҚ сорбентте 
сорбцияланады, 
эндогендік 
және 
экзогендік 
нуклеазалар 
(нуклеин 
қышқылдарын 
бұзатын ферменттер) инактивацияланады және 
ПТР 
ингибиторларын үш рет шаю арқылы жояды. ДНҚ элюциясынан кейін 
(десорбция) тазартылған суммарлық ДНҚ препараты алынады. Мұндай 
сынамалар ПТР қоюға дайын болып саналады.
ІІ кезең – амплификация реакциясын жүргізу. Тест-жүйе нұсқаулығына 
сәйкес амплификацияға арналған қоспа компоненттері бар түтіктер алдын-ала 
дайындалады. 
Зерттеуге алынған сынаманң белгілі бір мөлшерін арнайы «Eppendorf» 
түтікшелеріне енгізгеннен кейін үстінен амплификациялаушы қоспаларды, Tag-
полимераза ферментін және бір тамшы минералды майды қосады да, 
автоматтандырылған термостатта амплификация процесі 2-3 сағат аралығында 
жүргізіледі. Реакция қоспасының көлемі 0,025 мл құрайды. Зерттеуге алынған 
үлгілермен бірге бақылау үлгілері де қатар қойылады. Реакция аяқталғаннан 
кейін түтіктер ПТР өнімдерінің электрофорез әдісімен талдауға дайын болады.
ІІІ кезең – ПТР өнімдерінің детекциясы. Бұл әдіс 1%-ды агароза геліндегі 
электрофорез көмегімен ДНҚ фрагменттерін молекулалық салмақтары 
бойынша фрагменттерге бөлуден тұрады.
 
Ол үшін электрофорез буферін дайындап, агарозаны балқытады. Агароза 
гелін электрофорез пластинасына құяды, сонан соң оған сынамаларды енгізуге 
арналған шұңқыршаларды дайындау үшін тарақшаны орнатып, толық 
полимеризацияланғанша бөлме температурасында 30 минутқа қалдырады. 
Уақыт өткеннен кейін тарақшаны абайлап алады. Дайын гелі бар пластинаны 
электрофорез камерасына салады. Шұңқырсалар теріс зарядты электродқа 
жақын орналастырылуы қажет, өйткені ДНҚ оң зарядталған бағытқа қарай 
қозғалады. Камераға дайын буферлік ерітіндіні гель беткейінен 5,0 мм 
асатындай етіп құяды. 
Амплификациядан кейін алынған «Eppendorf» түтікшелерінен 0,010-0,015 
мл сынаманы алып гель шұңқыршаларына енгізеді. Гельдің әрбір жолағының 
(трек) жанында позитивті және негативті бақылау сынамалары міндетті түрде 
болуы керек.
Электрофорез аяқталғаннан кейін гельдің шұңқыршаларын жоғары 
қаратып трансиллюминаторға орналастырады. Гельді қарау кезінде көз бен бет 

арнайы маскамен немесе шыны пластинамен қорғалуы қажет. 
Нәтижелерді есепке алу және түсіндіру (интерпретация). ПТР 
нәтижелерін есепке алу электрофореграммада амплификацияланған ДНҚ-ның 
телімді жолақтарының болуы немесе болмауы арқылы жүзеге асырылады. 
Есепке алу жұмыстары бақылау сынамаларының амплификация нәтижелерінен 
басталуы тиіс. Позитивті бақылау ретінде алынған ДНҚ препараты мен 
зерттеуге алынған сынамалардың арасыннан оң нәтиже көрсеткен 
амплификация өнімдері (ДНҚ) енгізілген жол бойының белгілі бір деңгейінде 
ашық түсті болып жарқырап көрінетін жолақтар байқалады. Ал негативті 
бақылау сынамасы енгізілген жолда ондай жолақ байқалмайды (38-сурет). 

жүктеу/скачать 4.8 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: