Кафедра меңгерушісі, а.ш.ғ.к. Дошманов Е. Қ

ГРАММ ӘДІСІ БОЙЫНША МИКРООРГАНИЗМДЕР

Грам әдісі (бояу тәссілі )

Кептірілген және май шам жалынында фиксирленген микроорганизмдер препаратын күлгін генциан феголының ерітіндісінде 1минут бойы бояйды. Бояуды құйып алып , препаратты сумен жумастан , оған люголия ерітіндісін қосып 1 минут (мазок толық қарайғанша ) ұстап тұрады . Препаратты (сумен жумастан ) 96 спиртте 15-20 секунт , шайқап тұрып өңдейді . Түсін өзгерту уақыты өте маңызды , белгілі мерзімнен артып кетсе грам оңның өзі ағкарып кетеді , ал препаратты өңдеу уақыты жетпей қалса қатты боялып кетеді .

Препаратты сумен жуып, гоны Пфейфера фусинімен бояйды . Грам оң микроорганизмдер қара –күлгін түске боялады , Грам теріс боялмайды.

Морфологиялық белгілеріне : формасы , көлемі, орналасуы (таяқша тәрізділердің клеткасының соңы ), қозғалысы және жіпшелерінің орналасуы , спора түзуі , спораның орналасуы мен формасы , капсуласы , клеткасы , Грам бойынша бояуы . Ал актиномициттердің морфологиялық белгілері осыған ұқсас ұрықтану органдары ; Мицелидің құрылысы , оның бұтақтану сипаты , спора тасушы формасы және спора .

Морфологиялық белгілерін зерттеу үшін жасанды және табиғи ортада өсіреді .

Культуралы белгілері ;ЕПС культурасында өсу сипаты; ЕПА және басқа қатты ортада (сусла-агар т.б. )колониясының өсу сипаты .

ЕПС және сұйық ортада өсуі : Қабығының даму сипаты (жұқа , құрғақ , қатпарлы, шырышты , қабық түсі ) ;тұнба түзуі (әлсіз ,орташа , күшті ); тұну (шөгу) сипаты (мол , тығыз, тұну түсі ) .

Тығыз немесе қатты ортада (ЕПА т.б.) өсуі: колония көлемі (ірі 10 мм , орташа 1 ден 10 –ға дейін , кіші 1мм ) , колония өсу сипаты (төселіп , саңырау құлақ тәрізді , жалпақ , дөңгелек ) .

Физиолого – биохимиялық белгісі : ферменттердің актифтілігі ; көміртегін және азотты сіңіруі ;ортадағы өміршеңдігі (қышқылды , спиртті , газды );оттегіне және сілтігек қатынасы ; сыртқы ортаның әр түрлі факторларына әсері.

№7 – лабороториялық жұмыс .

Құрғақ ыстықпен стерилдеу . Оны ыдыстарды және құрғақ материалдарды (крахмал мела) Пастер пешінде 170 С (қажетті температураға жеткен соң ) екі сағат немесе электронды құрғтқышта 200 С қыздыру арқылы өңдейді.

Қыздырар алдын шыны ыдыстарды вата тығынмен

жабады, колба сыртын қағазбен орайды , таяқша , пробитрка , пипетка , вата , дәкені барлллығын қағазбен орапқорапқа салып қояды.

Бумен стерилдеу . Кейбір қоректік горта құрғақ жоғарғы ыстыққа шыдамайды. Мұндай стерилдеу Кох қайнтқышында 30 минуттан үш күн бойы күніге жүргізіледі .

Бірінші 100 С 30 минут қыздырғанда вегетативті клеткалар өледі, көптеген микроптардың споралары тіршілігін сақтап қалады . Осыдан кейін ортаны термостатта 28-30 С темспературада 24 сағат ұстайды . Бірінші қыздырудан тірі қалған споралардан бұл уақытта вегетативті формалары өсіп шыға ды , олар кеғйінгі қыздыруларда өледі . Бұл операция 3 рет қайталанады .

Пастеризация -- жартылай стерилдеу (70-80 С дейін 30 минут қыздырады да тез арада 10-11 С дейін салқындатады ) . Бұл әдісті Пастер ұсынған .

№9 - лабороториялық жұмыс

Микроскоптық кептірілген сүзгіні кедр майымен майлаймыз

Препаратты көріп көру алаңындағы ұрықтар санын анықтаймыз. Мұндай көру алаңын 100 деп аламыз , кейін арифметика бойынша бір алаңның орташасын шығарамыз. Осыдан кейін мембраналық сүзгідегі жалпы жұмыс ауданы қанша ұрық бар екенін санаймыз.

Мембраналық сүзгідегі жұмыс клеміне ғана көру алаңы сиятыны анықтаймыз.

р-көру алаңының көлемі. Сонымен Р және Р шеңбір ауданы. Көру алаңы диаметрі микрометрмен, ол сүзгінің жұмыс алаңы –милиметр қағаз көмегімен өлшенеді .

Сүзгіден алынған ұрық санын сүзгіден өткізілген сұйықтық көлеміне бөледі де 1мл судағы немесе сұйықтықтағ ұрықтың санын алады.
№10 - лабороториялық жұмыс .
Топырақтағы микроорганизмдердің жалпы санын тікелей микроскопта анықтау .
С.Н.Винодратский әдісіне О.Г. Шульгин модификациясы . Топырақтан 5г аламыз , 250 м колбаға салып , 50мл стерилденген кран суын құйып суспензия дайындаймыз . Топыраққа 0,1 % пирофосфат натри ерітінді қосып үгеміз . Оны суға қосып 5 минут шайқаймыз , 2-5 секунт тынытамыз , стеилді пипеткамен 0,01 мл алып тазартылған заттық әйнекке тамызамыз . Суспензия мен бірге әйнекке 0,1%тік агар тамшысын араластырамыз . Агар мен суспензияны әйнекте араластырылады және стерилді жабын әйнекпен трафарет бойынша 4 см2 жаяды(трафаретті дайындау : милиметрлік қағазға 4см 2белгілейді және қағазды заттық әйнекке кілейлейді ) .

Препаратты кептіреді , 96 % тік спиртпен фиксирлейді және карболовым эритрозинмен (30 минуттан 1-тәулікке дейін ) бояйды . Әйнектегі бояу қалдығын сыртқы жағынан сумен жуады , кейін препаратты кептіреді де микроскопта көреміз . Дәлірек нәтиже алу үшін 100 көру алаңы ұрықтар санын санайды және бір көру алаңындағы (р) санының орташасын шығарады . Көру алаңының диаметірін объек тивтік микрометрімен өлшейміз . Көру алаңының көлемін анықтап болған соң мазок көлеміне неше көру алаңы сыйатынын табамыз --- 400 мм² (р), .

Егер көру алаңының диаметірі 0,16 мм, көру алаңының көлемі – 0,02мм² тең болса , онда
(К) ==20000

Көру алаңындағы клетканың орташа санын 20000 көбейтеді де 0,01 мл суспензиядағы клетка санын анықтайды . 1 мл суспензиядағы олардың санын анықтау үшін алынған санды 100 ге көбейтеді .

Нитрификация – аммиакты азотты қышқылға және азот қышқылына айландырады . Бұл екі фазада жүреді . Нитрификацияның бірінші фазасы –амми актың азотты қышқылғ а ашуы 2 NH₃ +3O₂ = 2HNO₂ + 2H₂ O .Аммиак ыдырағанда бактериялар өміртегін көмір қышқыл газынан алады .

Мұны Виноградский әдісі бойынша жасауға болады . Бұл үшін жуылған , қайнатылған Петри табақшасындағы кремни қышқылы геліне 3-5 мл мына құрамдағы қоректік ортаны сіңіреді :

(NH ₄ )₂ SO₄ -- 2.0г Fe SO₄ ---0.4г

K₂ HPO₄ -- 1.0г Mg CO немесе Ca CO --5.0 г

Mg SO₄ –0.5г дистилденген су –200мл

Na CL --2.0г

Қоректік ортаны жоғарғы жағы ағарғанша булайды (50⁰ С )ал Mg CO₃ немесе Ca CO₃ қабатының бір қалыпты таралуынан болады . Бұл екі тұз нитрификация процесінің индикаторы қызметін атқарады , нитрификациялаушы бактериялардан түзілген азотты қышқыл мелді немесе Mg CO₃ ерітеді. Нәтижесінде табақшадағы бұл бактериялар дамыған жерде карбанаттардың еру аймағы пайда болады , ал жерде нитрификациялаушы бактери ялар табылады .

Эмаль пластинкаға жаңа топырақтың 50 түйірін орналастырамыз . Ыңғайлы болу үшін стерилденген шыны ыдысқа орналастырылады , екінші шыныға дистилденген су құямыз . Соңы иілген таяқшамен топырақ түйірін (диаметрі 1мм ) трафарет бойынша гелдің жоғарғы жағына төсейміз .

Табақшаны ылғал камераға және 28-30 С температурада термостатқа қоямыз . Біршама уақыттан соң нитрификациялаушы қабілетіне байланысты (7,14,21 күннен соң) топырақ түйірінің айналасында мелдің еру аймағыпайда болады . Бұл аймақта аммиактың жойылып азотты қышқыл пайда болғаны байқалады .

Гелден мелдің (немесе Mg CO )еріген аймағынан бір түйір кесіп алып Несслер рактивинде бояймыз , ол боялмайды . Грисса реактивинде ал қызыл түске , ал цинк –йод – крахмал қосып бояғанда –қышқыл ортада – тоқ көк түске боялады, бұл азотты қышқылдың түзілуін дәлелдейді .

Бірінші фазаның қоздырғышы – клеткасы нульге ұқсас Nitrosomonas және Nitrosospira . Біріншісі екі жыртындыда , ал екіншісі – тың жерде кездеседі

Нитрификацияның екінші фазасы

Бұл фазада азотты қышқылдың азот қышқылына айналуы:

HNO ₂ 1\2 O₂ = HNO₃

Микроорганизмдер нитрификацияның екінші фазасында нитриттер нитраттарға дейін ашиды, ал көміртегі көмір қышқылгазына айналдырады . Бұл процесті және қоздырғыштарды бірінші фазадағы табақшада жасалған культураны ұзақ тұрғызу арқылы байқауға болады. Аммиак жойылғаннан соң пайда болған нитриттер азот қышқылына дейін ашиды . Бұдан нитриттардың жоғалып нитраттарға пайда болғанын көруге болады . Гел түйірін кесіп алып ,фарфор пластинкаға салып нитриттардың жойылғанын Грисса реактивіне немесе цинк – йод – крахмалға кері әсерінен де көруге болады . Нитраттарға сынақты күшті күкірт қышқылы еретіндісіне дифениламинмен жасауға болады . Азот қышқылы болса гел тоқ-көк түске боялады Өсімдік аймағынан алынған материалдардан дайындалған препаратта , бұл кезеңде нитрификацияның екінші фазасының қоздырғыштарын табуға болады –Nitrobacter клеткасы сүйір , аздап иілген (майда ) өте ұсақ .

№12 - лабороториялық жұмыс

Денитрификация құбылысын анықтау .

Көміртегіне бай органикалық заттар шамадан тыс мол болғанда , топырақта азот қышқылы тұздарының азайып кеткені анықталды . Бұл кезде топырақта жүретін процестердің нәтижеснде , азот тотығына (нитаттар , нитриттар ), түрлі азотты тотықа , одан барып молекулалы азотқа айналады . Бұл процесті денитрификация деп атайды .

C₆ H₁₂ O₆ + 4NO₃ = 6CO₂ + 6H₂ O + 2 N₂

Денитрификация лаушы бактериялар аэробты жағдайда тыныс алуға молекулалы оттегін , ал анэроптыда оттегі нитраттарын жұмсайды .

Денитрификация процесін бақылау үшін Гильта ортасын қолданамыз , оның құрамы екі ерітіндіден тұрады .

KNO—2,1г

дистил су –250 мл

2 ерітінді лимон қышқылды натрий -5,0

KH PO --2,0

Mg SO -2,0

Ca CL -2,0

Fe CL қалдығы

Дистил су 500мл

Ерітіндіні бірге құяды рН6,8 –7,0 кептіреді және 1000мл дейін жеткізеді . Қарапайым ортада жақсы нәтижелер алуға болады . Қоректік ортада Pseudomonas fluorescens немесе Pseudomonas pyocyanea
№13 - лабораториялыќ ж±мыс.
Түйнек бактерияларын зерттеу. ¤сімдіктердіњ тамыр аймаѓындаѓы жєне тамырдаѓы бактерияларды зерттеу .
¤сімдіктіњ тамыр ж‰йесіндегі кµптеген бактериялар тіршілік етеді . Тамыр ж‰.йесініњ топыраќ бетіне жаќын орналас бµлігінде терењ ќабатќа ќараѓанда бактериялардыњ кµптеген т‰рлері кездеседі. Тамырда Pseudjmonas жєне микробактериялар тіршілік етеді .

¤сімдіктіњ тамырынан бµлінген сµлмен ќоректенеді жєне µсімдікке пайдалы да єсерін тигізеді . Органикалыќ ќалдыќтарды минерализациялап, оларды сіњімді т‰рге айналдырады . Астыќ т±ќымдас, Б±ршаќ т±ќымдас т.бµсімдік тамырында кездеседі .

Н.А.Красилников єдісімен ризосферадаѓы бактерияларды санау .

Стерилденген лопатамен µсімдікті топыраќтан ќазып, тамырын пинцетпен тартып алып , ондаѓы топыраќты стерилденген петри табаќшасына сілкиміз . Оны м±ќият араластырып 1 г аспа аламыз . Аспаны 100 мл стерилденген кран суына араластырып , таратпа (суспензия ) дайындаймыз . Себу кезінде алынѓан стерилді

пипеткамен 0,05 мл алып ќоректік пастинніњ (ЕПА, КАА )

жоѓарѓы жаѓына ќосамыз . Ал терењ себуде пипеткамен 1 мл суспензия алып Петри табаќшасына ќ±ямыз , кейін табаќшаѓы сєйкесінше агарландырылѓан ќоректк орта ќосамыз.

Агарда µскен колонияны кµзбен лупада санаймыз .

1г топыраќтаѓы ±рыќты санау ‰шін , терењ себу кезінде табаќшадаѓы µскен колония санын сєйкесінше ќосыл ќосындыѓа кµбейтеді жєне топыраќтыњ абсолюттік ќ±рѓаќ салмаѓына бµледі . Беткі себуде (1 мл ±рыќ санын аныќтау ‰шін) табаќшадаѓы колония санын алдымен 20- ѓа кµбейтеді .

Табаќшадаѓы бактерия колониясыныњ сапалыќ ќ±рамын аныќтау ‰шін культуралыќ белгілері бойынша топтастырады. Єрбір топтан препарат дайындайды жєне бактерия формасын табады . Ќай т‰рге жататынын аныќтау ‰шін морфологиялыќ жєне физиологиялыќ белгілерін зерттейді.

№14 - лабороториялық жұмыс .

Азотты органикалық формасын пайдаланатын микроорганизмдерді ет пептон агардан табуға болады .

Мироорганизмдердің бацлла формаларын табу үшін Е.Н.Милиустин аралас агарды қолдануды ұсынады –ЕПА+ сусло- агар 1:1қанасындай ЕПА қарапайым дайындау тәсілі , 7-баллды (рН 7,0 ) сусладан –сусло агар және 2%агар аламыз . ЕПА+сусло –агар себер алдын араластырады және Петри табақшаға құяды .

Бір-біріне сәйкестендіріліп араластырылған (10 және 10 ) топырақ суспензиясын себерден алдын 15 минут 70 Стемпературада пастерилдеиді (егер топырақта алдын ала бөлме температурасында кептірсе , бацилла формалары көбірек білінеді )Азоттық минералды формасын пайдалануға қабілетті микроорганизмдер (соның ішінде актиномициттер ) крахмал – аммиакты агарда (КАА) көп кездеседі .Қоректік ортаның құрамы (1л дистилденген суда г есебінде)

Крахмал(еритін ) –10г Na CL-1г

(H ₄)₂SO₄ -----------2 г CaCO –3г

K₂ HPO₄ -----------1г агар –20г

Mg SO ₄ -----------1г

Крахмалды алдын ала шамалы мөлшердегі суға араластырады және қалған ортаға құяды .

Бұл микроорганизмдер тобын білу үшін Чапека ортасын қолдануға болады , оның құрамы (1л дистилденген суда гр есебінде ) :

Сахароза немесе глюкоза –20,0 KCL-0.5

Na NO₃ -2.0 CaCO₃–3.0

K₂ HPO₄ -1.0 агар –20,0

Mg SO₄ - 0.5

Дайындайды , Алынған таратпа суспензиядан қоректік ортаға беткі немесе терең себуде пайдаланады . Бұл ризосфера бактерияларынан культура жасауда қолданылады .

Колонияны 3-5 күннен соң санайды.

Қазақстан Республикасы Білім және ғылым министрлігі.