ПӘннің ОҚУ-Әдістемелік кешені өсімдіктер биотехнологиясы 5В070100



жүктеу 1.94 Mb.
бет9/10
Дата17.06.2016
өлшемі1.94 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

молекулалык будаңдастыру әдісі де пайдаланылады. Бүл әдіс ДНК денатурациялануына негізделген, яғни жоғары температуранын әсерімен екі тізбектері ажырап, жеке-жеке күйінде калып кояды. Буданнан және ата-анадан бөлініп алынған ДНК үксас беліктерінің бар-жоғын тексеруге болады. Алдын ала ата-ана өсімдіктеріне күрамында радиоактивтік атомы бар коректік зат беріледі (мысалы С14, Р32 ). Одан кейін осы өсімдіктерден және будан өсімдіктерінен ДНҚ бөлініп алынған, шағын фрагменттерге арнаулы ферменттермен үзіп, оларды жеке тізбектерге денатурациялайды. Будан өсімдіктердін тізбектерін арнайы матрицаға түгелдей бекітеді. Сол матрица аркылы кейін әлгі радиоактивтік тізбектерді өткізеді. Егер будан ДНҚ фрагменттері мен ата-анасынын фрагменттері толык үксас болса, радиоактивтік

бөлшектер матрицада калып кояды. Әр түрлі организмдерден алынған үксас ДНҚ бөлшектерінін бір-бірімен кос тізбек күруын молекулалык будандастыру деп атайды. Молекулалык будандастыру белгісі филогенезде типтері алыс түрлердің будандарын және асимметриялык будаңдарды зерттеу үшін өте

маңызды. Сонымен, атап өткен талдау әдістерінін барлығы прото-пластарды косу нәтижесінде алынған нағыз будан клеткалар (немесе будан өсімдіктер) екендігін, олардын фенотипі буданға үксас мутант емес екендігін дәлелдеу үшін колданылады. Сомалык будаңцарды ирактикада пайдалану

Сомалык будандастыру цитология, генетика, молекулалык биология, физиология салаларында теориялык мәселелерді зерттеу үшін, сондай-ак практикалык селекцияда колданылады. Сомалык будаңдастыру селекция үшін өте жана технологая. Ол жыныстык жолмен будандаса алмайтын өсімдіктердін формалары мен түрлерін будандастыруға мүмкіндік береді, яғни түраралык гибридизация процесін шектейтін генетикалык сыйымсыздыкты жеңе алады. Тіпті жыныстык будандастыру мүмкін болған кездін өзінде де, сомалык будандардын жыныстык будандардан өз артыкшылыктары бар. Себебі, сомалык будандарда цитоплазмалык гендер ата-ананың екеуінен де түкым куалайды. Ал жыныстык будандарда цитоплазмалык гендер тек кана аналыктан түкым куалайды. Сомалык будандарды селекция процесінде пайдалану үшін олар гүлдеуге және түкым беруге кабілетті болулары кажет, ойткені сорт шығару үшін бірнеше үрпак кері кайтара аталык немесе аналыкпен будандастыруға түседі. Үрпақсыз будандардын селекцияға пайдасы жок. Әдетте сомалык клеткалар косылғанда, алынған буданда хромосомалар саны екі еселенеді. Вегетативтік жолмен көбейетін кейбір өсімдіктерге (картоп, кант камысы т.б.) хромосомалардын саны өзгергендігі кауіп туғызбайды. Ал көптеген ауыл шаруашылык дакылдары жыныстык жолмен көбейетіндіктен, оларға бүндай хромосомалык өзгерістер зиян болады. Сондыктан сомалык буданның плоидтылығы өзгермеу үшін, гаплоидтык өсімдіктін протопластарын косу керек немесе сомалык буданнын тозанкаптарын іп уігго өсіріп олардан гаплоидтык өсімдік шығарып алу керек.



Сомалык будандастырудын практикалыкжетістіктері ІЧісойапа, Зоіапшп, ОаШга туыстары ішіндегі түраралык будандарды шығарумен байланысты болды. Мысалы, практикалык селекция үшін бағалы темекінін кейбір жабайы түрлері шаруашылыкка

251үлкен және 8 кіші бөлшектерден түрады. Үлкен бөлшектердін полипептидтер күрамы хлоропластык ДНК бойыңца генетикалык кодпен жазылады, ал кішкенелердікінін - ядролык ДНК. бойында. Полиакриламид гелінде изоэлектрофокустау әдісімен бөлшектерінің полипептидтік күрамын зерттеу аркылы әр түрлі өсімдіктердін ферментінің полипептидтерінін күрылымындағы айырмашылыктарын аныктауға болады. Осындай талдау буданнын шығу тегін зерттеу үшін біркатар түраралык парасексуальдык будандарда өткізілген. Сонымен бірге РуБФК-нын талдауы ядродан тыс орналаскан гендерді зерттеу үшін де колданылады.

Осы максатпен будандар мен ата-аналарының хлоропластык ДНҚ және митохондриялык ДНҚ бөлініп алынып зерттеледі. Ол үшін ДНК нуклеазалармен өнделеді. Ол ферменттер ДНК-ны әр түрлі ерекше жерінен үзеді, ыдыратады. Кесілген ДНК фрагментт-ерін электрофорезбен талдағанда, түріне тән ерекшелігі айкында-лады. Сөйтіп, оны буданнын және ата-аналардын органоидтарын зерттеу үшін колданып, олардың табиғатын аныктауға болады. Сомалык будандарды талдау үшін нуклеин кышкылдарын

молекулалык будаңдастыру әдісі де пайдаланылады. Бүл әдіс ДНК денатурациялануына негізделген, яғни жоғары температуранын әсерімен екі тізбектері ажырап, жеке-жеке күйінде калып кояды. Буданнан және ата-анадан бөлініп алынған ДНК үксас беліктерінің бар-жоғын тексеруге болады. Алдын ала ата-ана өсімдіктеріне күрамында радиоактивтік атомы бар коректік зат еріледі (мысалы С14, Р32 ). Одан кейін осы өсімдіктерден және будан сімдіктерінен ДНҚ бөлініп алынған, шағын фрагменттерге арнаулы ерменттермен үзіп, оларды жеке тізбектерге денатурациялайды. Будан сімдіктердін тізбектерін арнайы матрицаға түгелдей бекітеді. Сол матрица аркылы кейін әлгі радиоактивтік тізбектерді өткізеді. Егер будан ДНҚ фрагменттері мен ата-анасынын фрагменттері толык үксас болса, радиоактивтік

бөлшектер матрицада калып кояды. Әр түрлі организмдерден алынған үксас ДНҚ бөлшектерінін бір-бірімен кос тізбек күруын молекулалык будандастыру деп атайды. Молекулалык будандастыру белгісі филогенезде типтері алыс түрлердің будандарын және асимметриялык будаңдарды зерттеу үшін өте

маңызды.Сонымен, атап өткен талдау әдістерінін барлығы прото-пластарды косу нәтижесінде алынған нағыз будан клеткалар (немесе будан өсімдіктер) екендігін, олардын фенотипі буданға үксас мутант емес екендігін дәлелдеу үшін колданылады.

Сомалык будаңцарды ирактикада пайдалану

Сомалык будандастыру цитология, генетика, молекулалык биология, физиология салаларында теориялык мәселелерді зерттеу үшін, сондай-ак практикалык селекцияда колданылады.



Сомалык будаңдастыру селекция үшін өте жана технологая. Ол жыныстык жолмен будандаса алмайтын өсімдіктердін формалары мен түрлерін будандастыруға мүмкіндік береді, яғни түраралык гибридизация процесін шектейтін генетикалык сыйымсыздыкты жеңе алады. Тіпті жыныстык будандастыру мүмкін болған кездін өзінде де, сомалык будандардын жыныстык будандардан өз артыкшылыктары бар. Себебі, сомалык будандарда цитоплазмалык гендер ата-ананың екеуінен де түкым куалайды. Ал жыныстык будандарда цитоплазмалык гендер тек кана аналыктан түкым куалайды.

Сомалык будандарды селекция процесінде пайдалану үшін олар гүлдеуге және түкым беруге кабілетті болулары кажет, ойткені сорт шығару үшін бірнеше үрпак кері кайтара аталык немесе аналыкпен будандастыруға түседі. Үрпақсыз будандардын селекцияға пайдасы жок.

Әдетте сомалык клеткалар косылғанда, алынған буданда хромосомалар саны екі еселенеді. Вегетативтік жолмен көбейетін кейбір өсімдіктерге (картоп, кант камысы т.б.) хромосомалардын саны өзгергендігі кауіп туғызбайды. Ал көптеген ауыл шаруашылык дакылдары жыныстык жолмен көбейетіндіктен, оларға бүндай хромосомалык өзгерістер зиян болады. Сондыктан сомалык буданның плоидтылығы өзгермеу үшін, гаплоидтык өсімдіктін протопластарын косу керек немесе сомалык буданнын тозанкаптарын іп уігго өсіріп олардан гаплоидтык өсімдік шығарып алу керек.

Сомалык будандастырудын практикалыкжетістіктері ІЧісойапа, Зоіапшп, ОаШга туыстары ішіндегі түраралык будандарды шығарумен байланысты болды. Мысалы, практикалык селекция үшін бағалы темекінін кейбір жабайы түрлері шаруашылыкка . Өсімдік клеткаларының іп унто жағдайында өзгергшггііі және оны селекцияда коддану

Өсімдік клеткалары іп уііго өсіргенде әр түрлі өзгерістерге ұшырайды. Ол генетикалык, морфологиялык, физиологиялык өзгерістер. Тіпті жеке бір клеткадан тараған оның ұрпағы да, яғни клетканын клоны, хромосомалык өзгергіштік салдарынан тез арада әркелкі болып кетеді.



Өсірген клеткаларда пайда болған өзгерістердін кейбірі түкым куалайды, кейбірі түкым куаламайды. Түкым куаламайтын өзгерістерді модификация деп атайды. Модификациялык өзгергіштік клеткалардын тіршілік жағдайына бейімделуіне көмектеседі. Түкым куалайтын, яғни генетикалык өзгерістердін практикада колдануға манызы зор. Генетикалык өзгерістердін негізінде жеке гендердін мутациялары, амплификация, делеция, ядродан тыс орналаскан гендердің өзгеруі, хромосомалар кұрылымындағы ауыткулар жатады. Түкым куалайтын өзгерістердің негізінде генетикалык өзгерістермен катар эпигенетикалык езгерістер де жатады, баска сөзбен айтканда, жалпы геномда өзгеріс болмайды, тек организмнін дамуы кезінде гендердін экспрессиясы ғана өзгереді. Клеткалардын өзгергіштігін әр түрлі мутагендермен әсер ету аркылы арттыруға болады. Өздігінен өтетін (спонтандык) және әдейі әсер ету аркылы коздырылатын (эксперименттік) мутагенез, клеткалык технологияларда және селекциялык жүмыстарда пайдалану үшін кажетті генетикалык алғашкы материалды (клеткалык штаммдар, өсімдіктін жаңа генотиптері т.б.) шығаратын әдіс. Іп уіГго өсетін клеткалардын түраксыздығы аркасында генетикалык өзгерген регенерант өсімдіктер шығады. Бұндай өсімдіктерді сомаклондык варианттар деп атайды.

Сонғы кезде өсімдіктердің жаңа формалары мен сорттарын шығару жолында сомаклондық варианттарға үлкен назар аударылуда. Сомаклондык варианттарды селективтік коректік ортада клетка денгейінде сүрыптап алу өте тиімді. Себебі клетка денгейінде сүрыптау селекциялык жүмыстын көлемін кыскартып, онын тиімділігін арттырады. Өйткені іп уііго өскен миллион клеткаларды талдаудан өткізу, миллион генотипті талдаумен тең. Бүндай жағдайда генетикалык өзгерістері селективтік ортаға сәйкес клеткалар ғана тіршілікке икемді келеді. Сондай сүрыпталып алынған клеткалар пайдалы касиеттері түкым куалайтын клеткалык линияларға бастама бола алады. Ол клеткалык линиялардан регенерация процесі аркылы әр түрлі стрестік факторларға төзімді өсімдікті сынактан өткізіп тандап алуға мүмкіндік туады.



Дәріс 12. Клеткалык селекция

Іп ұііго өсірілген клеткалардын арасынан нактылы бір селективтік жағдайға сәйкес өзгеріске үшырап, пайдалы қасиетке ие болған клеткаларды көбейтіп сүрыптап алуды клеткалык селекция дейді. Әрбір клеткадан өсімдік шыға алатын болғандыктан, клеткалык селекцияны колданып өсімдіктердін жана формаларын тез алуға болады. Оларға бастама болған клетка белгілі бір төтенше факторға төзімді келсе, одан шыккан өсімдікте көбінесе сол касиетті сактай алады.

Клеткалык селекциянын артыкшьглығы мынада: жыл он екі ай маусымға тәуелсіздік және уакыт пен егіс көлемінін үнемделуі. Іп уіГго өсетін клеткалык популяциянын әрбір клеткасын жеке организм деп тенесе, бір тәжірибенін өзінде-ак миллиондаған даракпен айналысуға болады. Ал дала жағдайында ең көп дегенде ғалым мындаған ғана өсімдіктермен жүмыс істей алады.

Молекулалык және хромосомалык денгейлердегі өзгерістері мен организм денгейінде белгілердін өзгергіштігі арасындағы байланыстар туралы мағлүматтардын жеткіліксіздігі клеткалык селекция жөніндегі зерттеулерге үлкен кедергі келтіреді, сондык-тан бүл жүмыстар көбінесе эмпирикалык жолмен жүргізіледі.


Дәріс .13-14. Гендік инженерия

Гендік инженерия - молекулалык және клеткалык генетика-нын колданбалы саласы. Белгілі касиеттері бар генетикалык материалдарды (гендерді) іп уііго жағдайында алдын ала курастырып, оларды тірі клеткаға енгізіп, көбейтіп, зат алмасу процесін өзгеше жургізу. Бүл әдіспен организмдердегі генетикалык информацияны көздеген максатка сай өзгертіп, олардьщ геномдарын белгіленген жоспармен кайта куруға болады.

Геңдік инженерия ол функционаддык активті генетикалык күрылымдарды рекомбинанттык (будан) ДНК молекулалары түрінде колдан күрастыру. Гендік инженериянын мәні жеке гендерді бір организмнен алып баска организмге көшіріп орналастыру. Бүған рестриктаза мен лигаза ферменттерінін ашылуы мүмкіндік туғызады. Рестриктазалар (рестрикциялык эндонуклеазалар) ДНК молекуласын белгілі жерлерден жеке узінділерге киып бөлшектейтін ыдыратушы фермент. Казір ДНҚ молекуласын бір-бірінен өзгеше 120 жерінен үзетін 500-ден астам рестриктазалар аныкталған. Алынған полинуклеотид бөлшектерінің (ДНК фрагменттерінін) комплементарлык немесе «жабыскыш» үштарын ДНҚ лигазасы бір-біріне «желімдеп» рет-теп жалғастырып косады. Осы ферменттердің көмегімен бір ДНК молекуласынан кажетті ген бөлініп алынып, баска ДНҚ молекуласынын үзінділерімен күрастырылып рекомбинанттык, яғни жана будан ДНҚ жасалады.

Одан кейін рекомбинанттык ДНК бірнеше әдістермең тірі клеткаға енгізіледі. Жана геннің экспрессиясы өтеді де, клетка сол ген белгілейтін белокты синтездей бастайды. Сонымен, клеткаға рекомбинанттык ДНК молекуласы түрінде жана гене-Агробактерия плазмидаларын вектор ретінде колдану

АцгоЬастегіа деген топыракта мекендейтін бактериялардьщ тобы. Олар өсімдіктерге жүғып тәж тәрізді өсіндіні, яғни ісікті, бүлтыкты пайда болғызады. Агробактерияньщ бірнеше түрі бар. Бүл бактерияларға косжарнакты кең жапыракты өсімдіктердін барлығы дерлік сезімтал келеді, ал астык түкымдастары мен баска да даражарнактыларға олар жүкпайды. Тәж тәрізді ісік клеткалары іп уііго шексіз өсе береді, тіпті коректік ортаға гормондарды косулы да кажет етпейді, себебі оларды өз клеткаларында тузеді.

Ісік ауруын ен онай коздыратын АвгоЬасіегіа {шпеіасіепз. Жалпы айтканда, бүл бактерия гендік инженерия көздеген максатты табиғатта іс жүзінде аткарады. Бүл бактерия өсімдіктін жаракаттанған үлпасы аркылы клеткаға кіргенде озінін гендерін бірге ала келіп, осімдік геномына енгізеді. Сонын салдарынан осімдікті жана белоктарды синтездеуге мәжбүр еткізеді. Нәтижесіиде бактерия гендерін кабылдаған осімдік клеткалары оге гез кобейіп, тамыр мойынында (тамыр мен сабактын арасында) ісік, бүлтык пайда болады.

Бул инфекния процесі шын мәнісінде табиғи гендік ипжеперия. Ісікті коздыратын агент осы бактериянын нлазмидасы, оны Ті-плазмида деп атайды. (ағ. Штог іпсіисіп§ -ісік гуғызатын). Бул плазмидалар сакина тәрізді массасы 1,2х108 кД (агробактерия хромосомасының көлемінің 3-5%) ДНК молекулалары. Олар бактерия клеткаларында өз бетімен репликацияланыл көбейеді.Американ генетиктары 1977 жылы аныктағандай, тәж тәрізді ісіктср өсімдік хромосомасының күрамына Ті-плазмиданын белгілі бір болігінің кіруі аркасында пайда болады. Бүл фрагментті Т-ДНК, деп атайды (ағ. гташгег - тасымалданған) Ісік клеткаларында сау клеткаларда болмайтын опиндер деген жапа класка жататын химиялык заттар табылды. Опиндер - оя аргинин амин кышкылынын туындылары. Жакеы зерттелгеңдер: октопин - аргинин мен пирожузім органикалык кышкылЫнын туындысы, нопалин - аргинин мен а-кетоглутараттын туындысы. Ауру туғызған бактерияның штамына байланысты ісік клеткалары октопіпіді немесе нопалинді синтездейді. Бүл заттарды осімдік клеткалары пайдаланбайды, ал бактериялар коміртегі мен азоттын козі регінле пайдаланады. Бактериялар ісіктерді туғызумен бірге,және хромосомалык ДНК күрамына кірістіру процесіне жауапты гендер плазмида бойында Т-ДНҚ-дан алшак орналаскан. Сол сиякты опиндерді ыдырататын гендер де Т-ДНҚ-дан алшағырак орналасады. Казір Т-ДНК-нын толык картасы жасалып, онда қандай гендер калай орналасатыны белгілі болды.Опинді ісік клеткаларында Т-ДНҚ-ы 7 геннен түрады. Олардын әр кайсысында өзіндік күрамы бар РНК-ы синтезделеді. Т-ДНК гендері бір-біріне жалғаса жакын орналасады және де бір-бірін жаппайды. Бүл әр геннін транскрипциясынын жекеден жеке бір-біріне байланыссыз, өз промоторынын бакылауымен өтетіндігін дәлелдейді. Олардын арасында 4-5 ген ісік клеткаларынын өркен мен тамыр түзушілік дифференциациясын тежейді. Бір ген опин синтезін кодтайды, баска екі гендер тамырдын пайда болуын тежейді. Сондыктан тәж тәрізді үлпаны іһ ұіпо өсіргенде ол дифференцияланбаған каллус күйінде калады. Ол гормон косылмаған ортада өсе алады, себебі ісік клеткаларынын өздері гормондарды көп мөлшерде синтездейді. Өсуді реттейтін заттардын балансы бүзылуы нәтижесінде дифференциялану тежеледі.

Ті-плазмидада Т-ДНК екі үшынан да бір-бірінен аумайтын, үксас үзындығы 25 нуклеотидтердін жүбынан түрады. Ол нуклеотид тізбектерінін, мүмкін, Т-ДНҚ-ны өсімдік клеткасына тасымалдауына катысы бар шығар. Ісіктін пайда болуына Ті-плазмида дәл өзі себепші екені (хромосомалык гендер емес), плазмидалары жок немесе мутанттык Ті-плазмидалары бар агробактерия штамдарын колдану аркылы дәлелденді. Ті-плазмидалары жок агробактериялар жүккан өсімдіктерде ісік пайда болмайды және де опиндер синтезі өтпейді. Мутанттармен өткізілген генетикалык зерттеулер көрсеткендей, Ті-шіазмиданың Т-ДНҚ фрагменті ғана ісіктін пайда болуына, огашдер синтезіне және дифференцияланудың тежелуіне жауапты.

Гсік тудыратын кабілеті төмен мутант - октопин түзгіш плазмида алынған. Онын бағалылығы, ол ісік үлпасына жакын орналаскан нормалы клеткалардың аномальдык дифференциров-касын арттырады. Мысалы, тамыр мен өркеннің күшті өсуіне себепкер болады. Осы плазмидамен трансформацияланған темекі клеткалар популяциясында кейбір жеке клеткалар (өте сирек болса да) регенерант өсімдігін берген. Бүл өсімдіктердің барлык үллалары октопинді синтездеу кабілетін Т-ДНҚ-нын болуы нәтижесінде сактаған. Осы трансформацияланған өсімдіктерді пормалы темекі өсімдігімен будандастырып, кейіннен сол буданнан алынған үрыктарды өсірген. Сонда көрсетілгендей, октопин синтездеуге кабілеттілік (яғни Т-ДНК) Мендель зандылығына сәйкес аналык және аталык жағынан да түкым куалаған. Демек, Т-ДНК хромосомаға тіркескеннен кейін өсімдіктін әдеттегі гені болып сініп кетеді.Өсімдікке енгізілген Т-ДНҚ Мендель зандары бойынша түкым куалайтын болғандыктан және оның гендерінің өздерінін промоторлары (сол промоторлардын бакылауында бөтен гендердін экспрессиясы өте алады) болу аркасында Ті-плазмиданын ДНҚ-сын гендік инженерия жүмыстарында вектор ретінде пайдалануға болады.

Агробактерияларды кабылдап, оларға пана бола алатын өсімдіктер өте көп, олар косжарнакты өсімдіктердің барлығы дерлік. Өкінішке орай, көптеген ауыл шаруашылығында манызы зор дакылдар, атап айтканда: бидай, кара бидай, сүлы, күріш, жүгері, даражарнакты өсімдіктерге жатады. Сондыктан олар агробактерияларға төзімді келеді. Даражарнакты өсімдіктердін тәж тәрізді ісік ауруына табиғи төзімділігі жөнінде түрлі пікірлер бар. Мүмкін, бактериялар олардын клеткаларына мулдем кіре алмайды немесе кіргеннін өзінде, Т-ДНҚ-ны олардын хромосомаларына тіркестіре алмайды.

Бірак әдебиеттегі бірен-саран деректер бойынша, кейбір даражарнакты өсімдіктер, мысалы каскыржем (спаржа), лалагүл, нәркес, жүтері, өздеріне агробактерияларды жүктырады және ісік ауруына шалдығады. Ісік үлпалары гормондар косылмаған ортада іп уііго өсе алады, олардың күрамында Т-ДНК кодтайтын опиндер гүзілетіндігі аныкталған. Сөйтіп, бүл деректер бойынша, тым болмаса кейбір даражарнакты өсімдіктердің де агробактерияның Т-ДНҚ-ны кабылдауы және оларда сол Т-ДНК гендерінің экспрессиясы өтуі мүмкін.

Плазмиданы вектор ретіңде пайдаланудын бір киыншылығы, °ның көлемінін үлкендігі (18 кД). Т-ДНК-ны өсімдік клеткасына тасымалдау және хромосомаға тіркестіру үшін онымен шекаралас жаткан нуклеотидтер тізбегінін және де оған коса ісік тудыратын вируленттік (уіг) бөлігінін кажет екендігі аныкталды. Сондыктан,казір бүтін Ті-плазмиданы толығымен емес, тек онын жоғарыда аталған ұіг бөлшегін ғана пайдаланады. Ті-плазмиданын Т-ДНК фрагментін вектор ретінде колданудағы тағы бір кедергі, ол Т-ДНҚ аркылы трансформацияланған клеткалардан бүтін регенерант өсімдіктердін шыкпауы.

Егер де Т-ДНҚ-ның орта шенін киып, бөліп алып тастаса, Т-ДНК өзінің ісік туғызатын онкогендік кабілетінен айырылады, бірак өсімдік клеткасы хромосомасымен тіркесе алады. Соның нәтижесінде, осылай трансформацияланған клеткалар регенерант өсімдіктерді жаксы түзе алады. Табиғи жағдайда Т-ДНҚ -ның «тамыр бергіш» деп аталатын мутанттары болады екен. Олар өсімдік клеткаларын трансформациялай алады және регенерацияны тежемейді. Сондай, «тамыр бергіш» мутацияға үшыраған Т-ДНК, транспозондар көмегімен де алынған. Бүл өзгеріске үшыраған Т-ДНК өсімдік клеткасынын хромосомасына оп-онай орналасып, оны трансформациялап, регенерация процесінің өтуіне кедергі жасамайды. Ол мутация Т-ДНК картасынын белгілі бір бөлімінде орналаскан.

Сонымен, вектор ретінде пайдалануға жарамды Т-ДНК мына талаптарға сай болуы керек:

1) ДНК-ны өсімдік клеткасынын ядросына ендіру үшін және оны хромосомаға түракты орныктыру үшін барлык сигналдары бар;

2) осы процестерді камтамасыз етуге кажет метаболиттік заттарды түзу үшін генетикалык информация «жазылған»;

3) клеткадан регенерант өсімдік шығаруға кедергі жасамау;

4) өсімдік геномына енгізілген бөтен гендердің экспрессиясын жүзеге асыру үшін арнайы жүйесі бар;

5) трансформацияланған клеткаларды сүрыптау үшін маркеры бар;

6) бөтен ДНК бөлшегін осы вектор ретінде колданылатын Т-ДНК-ға енгізу жүмысы оңай әдіспен орындалуы керек.

Күрамына кажетті ген тіркестірілген Т-ДНҚ-ны (рекомбинант-тык ДНҚ-ны) өсімдік клеткасына енгізудің екі әдісі жете зерттеліп дайындалған.

Бірінші әдіс - «екіаралык векторлар» әдісі - ішек таякшасы бактериясының (Е.соіі) рВК 322 плазмидасын колдануға негізделген (52-сурет). Рестриктазамен Т-ДНҚ Ті-плазмидадан



290

кесіп алынып, рВК 322 плазмидаға тіркестіріледі, яғни лигаза ферментімен тігіледі. Одан кейін сол Т-ДНК косылған рВК 322 плазмиданы Е.соіі клеткасына кіргізіп, бактериялардын көбеюше жағдай жасалады. Сонан соң көбейген (клонданған) плазмидаларды бактериядан бөліп алады. Құрамында Т-ДНК бар клонданған бактерия плазмидасына көзделген максатка сай бөтен кұрылымдык генді орналастырады. Осы плазмидадан, Т-ДНК-дан және бөтен кұрылымдык геннен күрастырылған рекомбинанттык ДНК-ны көбейту керек. Ол ұшін оны Е.соіі клеткаларына енгізіп бактерияларды өсіреді. Сол кезде рекомбинанттык ДНК да көбейеді, яғни клонданады. Е.соіі биомассасынан рекомбинанттык ДНҚ-сы бар плазмиданы, яғни екіаралык векторды мол мөлшерде бөліп алады. Осындай дайындык жұмыстар аткарылып болған сон, генетикалык грансформацияға тікелей кірісуге болады. Ол ұшін Е.соіі будан плазмидасын Ті-плазмидалары бар агробактерияларға кіргізеді. Бір бактериядан баска бактерияға генетикалык материалдын (ДНК) кіруін конъюгация деп атайды. Агробактериядағы табиғи Ті-плазмиданың Т-ДНК бөлігі мен Е.соіі будан плазмидасындағы екіаралык вектордын ертеректе оған орналастырылған т-днк бөлігі арасында гомологиялык рекомбинация өтеді, яғни олардын ұксас нуклеотид тізбектері бір-бірімен орын алмастырады. Сонын нәтижесінде күрылымдык ген тіркескен Е.соіі плазмидасындағы Т-ДНҚ агробактериянын Ті-плазмидасына кіріп, табиғи Т-ДНҚ-нын орнын басады. Акырында Ті-плазмидасының Т-бөлігінде көзделген максатка сай кажет ген орналастырылған А. штейсіеш бактериялары алынады. Өсімдік клеткаларына олар кейін әдеттегідей тасымалданады да генетикалык трансформация процесі өтуіне мүмкіншілік туады.Екінші әдіс - бинарлык (кос) векторлар жүйесін калыптасты-руға негізделген. Сонғы зерттеулер көрсеткендей, А. ште&сіепз аркылы өсімдіктерге ісік ауруын жұктырып, оларды трансформациялау үшін бұтін Ті-плазмида емес, онын екі бөлшегі ғана жеткілікті. Біріншісі - Т-ДНҚ-нын екі жағындағы тек шекаралык бөліктері, баскасы - Ті-плазмиданын вируленттік (УІГ) бөлігі. Және де бүл бөліктер бір плазмиданын күрамында ғана емес, әр түрлі плазмидаларда болуы мүмкін. Егер агробактериялардын бір плазмидасында уіг бөлігі болса, ал екіншісінде Т-ДНҚ бөлігі болса, олар өсімдік клеткаларын трансформациялауға кабілетті. Сонымен Т-ДНҚ-нын күрамында кандай да бөтен ген ендірілсе де, ол өсімдік геномына тіркесе алады. Бірак солай болғанның өзінде де, Ті-плазмидалык векторлар аркылы өсімдікке енгізілген бөтен гендердін экспрессиясы отпейді. Мысалы, темекі геномына Ті-плазмидалык векторлар хемегімен өз промоторларымен бірге енгізілген бактерия (антбиотиктерге карсы ферменттер гендері), жануар және өсімдік (деггемоглобин гені) гендерінін экспрессиясы жүрмеген. Әр ,еннін алдында 40-50 нуклеотидтен түратын тізбекті промотор деп атайды. Промотор геннің транскрипциясы (иРНҚ-ның сцнтезі) басталуына жауапты. Бөтен гендердің экспрессиясын кздағалау үшін міндетгі түрде Т-ДНК-ның күрамында ерекше Яромотор болады. Ті-плазмиданын нопалинсинтетазаны кодтайтын гені бөлініп алынып, оның күрамы зерттелді. Онын промотор бөлшегі де аныкталды және жеке бөлініп алынды. Осы промоторды октопинсинтетаза және хлорамфениколацетил-трансфераза күрылымдык гендерінін алдына кіргізіп койып будан ДНК жасалған. Сондай будан ДНК-ны клондап көбейткеннен кейін өсімдік клеткаларына енгізген. Тек сонда ғана бөтен і-ендердін экспрессиясы жүре бастаған, яғни бүл процесті нопалинсинтетаза генінің промоторы реттеп отырған.

Сөйтіп, Т-ДНК-нын промоторы күшті болғаны, яғни онын нуклеотид тізбегі РНҚ-полимераза ферментін тез танитындай цемесе онымен онай байланыска түсетіндей болып күралған. Тәжірибелер корсеткендей, нопалинсинтетазаның промоторы курылымдык гендермен Ті-плазмида онай тіркеседі және осімдік клеткаларында өз кызметін аткара алады. Бұл промотордың тағы бір артыкшылығы, ол каллустарда да, өсімдіктердің көптеген мүшелерінде де өз кызметін аткара алады. Т-ДНҚ-ға тігілген геннін экспрессиясын байкау ушін трансформацияланған және озгермеген клеткаларды ажырата білу керек. Бүл үшін селективтік маркер (белгісі) колданылады, щысалы антибиотиктерге төзімділік белгісі. Химералык гендер, яғни колдан күрастырылған нопалинсинтетазаның промоторы, бактериянын канамицинге төзімділік гені және нопалинсинтета-занын терминальдык сигнал гендері темекі клеткаларына

енгізілгенде жаксы нәтиже алынған. Трансформацияланған өсімдік клеткалары канамицинге төзімділік көрсеткен. Осы химералык гендер кейін трансформацияланған клеткаларды сұрыптау үшін селективтік маркер ретінде колданылып, фенотип жағынан нормалы және үрыктанушы регенерант өсімдіктерін алуға мүмкіндік берді. Бүл өсімдіктерде антибиотикке төзімділік генінін экспрессиясы барлык үлпаларында өткен, кейін ол касиет Мендель заны бойынша түкым куалаған. Сонымен, агробактерия-лардың модификацияланған Т-ДНҚ-сы көмегімен өсімдіктер клеткаларын трансформациялау әдісі казіргі уакытта ең тиімді болып табылады. «сакалды тамыр» аталатын ісік ауруын тудыратын топырак бактерияларының Кі-плазмидаларын (ағ. гооі іпсшсіпі - тамыр шығарғыш) да өсімдіктер гендік инженериясында вектор ретінде колдануға болады. Өсімдіктердін жараланған жерлерінен сол бактериялар жүкса, онда сакал кылшыктары сиякты жіңішке тамырлар өсе бастайды. Бактериялар болмағанның өзінде, ауру жүккан тамыршалар іп ұііго тез өседі, себебі олардын клеткаларында бактерия Кі-плазмидасының Т-ДНК-нын бірнеше көшірмелері және опиндер бар. «Сакалды тамыр» ауруынын салдарынан пайда болған тамыршалардың тәж тәрізді ісіктерден айырмашылығы, олардан іп ұііго жағдайында регенерант өсімдіктер онай шығады. Ол регенерант өсімдіктер аурудан сау және үрык бере алады, жапырактары мен тамырларыида опиндер болады. Олардын геномдарында Кі-плазмиданын Т-ДНК бөлігі жыныстык жолмен түкым куалайды.

Француз ғалымы ЖТампе сәбізбен мынадай тәжірибе өткізген. А.гһі20§епез бактериясын жүктыру нәтижесінде сәбіз кесіндісінде көптеген тамыр кылшыктары өсіп шыккан. Жеке тамыршаны кесіп алып агарлы ортаға көшіріп, одан каллус алған. Каллусты сүйык ортада өсіргенде эмбриоидтар түзілген. Кейін олардан регенерант өсімдіктер шыккан. Демек, Кі-плазмидалар табиғи, зиянсыз, гендер тасымалдаушылары бола алады. Кі-плазмида жүйесін колданудағы басты артыкшылык, ол үлпа емес, мүше өсіруге негізделген. Соның нәтижесінде әр өсімдік түріне тән хромосомалар саны (плоидтылығы) сакталады.



Сонымен, Ті-плазмидалар мен Кі-плазмидалар жоғары сатылы өсімдіктерге гендерді тасымалдайтын өте колайлы векторлар.

Бірак, өкінішке орай, агробактериялардың Т-ДНК-ны өсімдік клеткасынын ядросына тасымалдау механизмі жөнінде мәлімет өте аз. Октопин және нопалин плазмидаларының Т-ДНК сегменттері кожалык клетканын хромосомаларынын кездейсок жерлеріне барып тіркеседі. Сонымен катар, олар ешкашанда митохондриялар мен хлоропластар ДНК-мен әрекеттеспейді. Бүл жағдай агробактериялар аркылы жургізілетін генетикалык трансформация цитоплазмалык геном емес, тек кана ядролык геном аркылы ететінін дәлелдейді.Өсімдік клеткаларына Т-ДНК калай енгізілуі жөнінде әр түрлі көзкарастар бар. Мүмкін, агробактериянын өзінде Т-ДНК плазмидадан кесіп алатын ерекше фермент бар шығар. Одан кейін бос Т-ДНК өз бетімен өсімдік клеткасына еніп кетуі мүмкін. Т-Д НК плазмиданын ісіктерде түракты сакталатын жалғыз бөлігі болғанымен, онын ңуклеотидтік күрамында баска манызды геңдер (өсімдік клеткасын тану, онымен әрекеттесіп ішіне кіру, кейін хромосомаға Т-ДНК-нын тіркесуіне жауапты гендер) табылмаған. Шамасы, Т-ДНК-ның өсімдік геномына түракты тіркесуі ушін өсімдік гені активтелінеді, болмаса плазмиданың ұіг бөлігінде орналаскан гендер кодтайтын бірнеше белоктар Т-ДНК-мен коса тасымалдануы керек шығар. Бәрінен де дүрысы, тасымалдау процесі Ті-плазмидада және бактериянын хромосомасында орналаскан уіг гендерінің бакылауында өтетін болуы ыктимал. Ті-плазмиданын вируленттілік гендері өсімдіктің закымданған клеткаларындағы фенол косындысының әсерімен индукция-ланады.Баска гипотеза бойынша, Ті-плазмида түгелімен, тіпті бактерия геномы толығымен, өсімдік клеткасына тасымалданады, бірак өсімдік ДНК-мен тек кана бактерия плазмидасынын Т-ДНҚ-сы тіркеседі. Онын себебі, өсімдік хромосомаларына тек кана Т-ДНК орналасады. Т-ДНКядроға енген кезде, онын молекуласы әр күйде болуы мүмкін: линиялык немесе сакиналык, біртізбелік немесе костізбелік, бос, жеке өзі ғана немесе бактериялык белоктармен байланыскан түрде. Т-ДНҚ өсімдік клеткасында өз бетімен жеке репликациялана алады немесе лезде өсімдік геномына еніп кетеді де сонымен бірге көбейеді.Т-ДНҚ өсімдік клеткасына калай енеді және хромосоманын күрамына калай кіреді? Мүмкін, бактериялар осімдік клеткасына белгісіз бір жолмен әсер етіп, оны өзінін ДНК-сы оңай енетін ерекше күйге айналдырады немесе бактерияларды өздерін кабылдауға бейімділігі бар өсімдік клеткаларын тану үшін ерекше туыстығы болады. Сірә, Т-ДНК плазмидадан кесілуі және оның кожа клеткасынын хромосомасына енуі кезінде, Т-ДНК үштарындағы сигналдык тізбектері маңызды роль аткарады. Бірак осы сигналдарды танитын күрылым кандай екені және де кай организмге (бактерия немесе өсімдік) жататындығы әлі белгісіз. Колдан күрастырылған Ті-плазмидаларды өсімдік клеткасына кіргізу үшін бірнеше әдістер колданылады. Ен карапайымы, ол табиш әдіс - жасалған бактериялар штамдарын есімдіктерге жараланған жерлері аркылы жүктыру. Екінші әдісі, ол прото-пластарды бактериялармен бірге өсіру аркылы трансформациялау. Осылай бірге өсіру әдісі - бүл жасанды жағдайда ісікті туғызу әдісі. Егер агробактериялар жанадан алынған немесе біркүндік протопластармен бірге өсірілсе, бактериялардын оларға косылуы және трансформациялану процесі жүрмейді. Трансформация өтуі үшін кабыктары түзілген үш күндік протопластар кажет. Клетка кабығынын тузілуін тежейтін заттар бактериялардын прото-пластарға косылуын да тежейді. Бір тәулік бойынша бірге өсіргенде протопластар бактериялармен косылады, одан кейін косылмаған бактерияларды шайып алып тастайды. Сонан сон өсімдік клеткаларын гормондары жок ортаға кошіреді. Бүндай ортада тек трансформацияланған клеткалар тірі калады. Осы әдіспен темекі мен шырайгүлдін трансформацияланған регенерант өсімдіктері алынған. Бүл әдіс агробактерияларға кожа бола алатын өсімдіктердін санын кобейтуге мүмкіндік береді, солардың ішінде астык түкымдастар түрлері де болады. Бірге өсірудін тиімділігін арттыру үшін клеткалардын косылуын коздыратын заттарды колдануға болады (ПЭГ, кальций т.б.). Протопластардын трансформациясын оларды Ті-плазмидалармен бірге осіру аркылы да жүргізуге болады. Бүндай тәжірибелер шырайгүл, темекі протопластарымен жасалған. Бүл жүмыстарда химиялык заттарды (ПЭГ) колдану Т-ДНК протопластарға енуін едәуір арттырған. Осы әдісті колдану негізінде трансгендік өсімдіктер алынды. Бүл әдістін артыкшылығы, ол аралык векторлардын кажет болмауы.

Хлоропластык ДНК және митохоңцриялык ДНК вектор ретіңде колДЩУ

Хлоропластар мен митохондрияларда толык және дербес генетикалык жүйе бар (ДНҚ, ДНК-полимеразалар, РНҚ-полимеразалар және белок синтездейтін аппараттын рибосома-лары, тРНК, аминоацил-тРНҚ-синтетаза). Хлоропластык ДНҚ және митохондриялык ДНҚ вектор ретінде колдану мүмкіндігі ғалымдардың назарын аударады. Бүл органоидтардың генетикалык жүйелерінде озара айтарлыктай айырмашылыктары бар.

Хлоропластар мен барлық баска пластидалардың (лейкопласт, хромопласт) ДНҚ-ларындағы генетикаггык информация бірдей, оны пластом деп атайды. Жоғары сатыдағы өсімдіктерде хлоропластық ДНҚ молекуласы сакина тәрізді, үзындығы 150 мың жүп нуклеотидтерден (мжн) түрады. Онда орналаскан гендер жүздеи белоктарды кодтауға жарайды. Бірак пластидаларды толығымен күрастыру үшін одан едәуір коп белоктар кажет. Сондықтан, баска бірталай белоктар ядродағы ДНҚ гендерінде жазылып, цитоплазмада синтезделіп, кейін хлоропластарға гасымалданады. Хлоропластардын кейбір манызды белоктары бірнеше болшектен түрады. Ол болшектердін кейбірі хлоро-пластык ДНҚ-да кодталып, өзінің ішінде стромада синтезделеді, ал баскалары ядролық ДНҚ-да кодталып, цитоплазмада синтезделіп, кейін хлоропластка өтіп, бөлшектер бір-бірімен косылып, күрделі белок молекуласын күрайды. Сойтіп, активті хлоропласт пайда болу үшін ядролык геном мен пластомдык геном экспрессиясы үйлесімді жүруі керек.

Жоғары сатыдағы осімдіктердің митохондриялык ДНҚ көлемі 200 мжн 2400 мжн дейін жетеді. Бірак ДНҚ көлемімен оның синтездейтщ полипептидтер саны арасында ешкандай байланыс жок. Бүл күбылысты митохондриялык ДНК күрамында пайдасы жок ДНҚ («эгоистык», «надан» ДНҚ) мол болуы ыктимал деп түсщуге болар.

Митохондриялык ДНҚ 20-дан астам күрылымдык гендер (митохондрияда синтезделетін полипептидтерді кодтайды) және де РРНҚ гендерін камтиды. Бірақ митохондриядағы белоктардын көбі хлоропластардағыдай ядролык гендермен кодталады. ллоропластар геномы ірі сакина тәрізді ДНҚ молекулаларынан

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


©dereksiz.org 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет