Программа курса по выбору «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской биотехнологии»

Коллагены – обширное семейство одного из главных гликопротеинов ЭцМ. Структурно-механическая роль коллагенов в организации ЭцМ. 12 типов коллагенов высших позвоночных: фибриллярные и нефибриллярные коллагены. Роль коллагенов в контроле адгезии клеток; взаимодействие интегринов с соответствующими типами коллагена.

Структура коллагена I типа. Трехспиральность, размеры субъединицы; особенности организации их первичной структуры, повторяемость триплетов аминокислотных остатков, роль остатков глицина в возникновении -спирали субъединицы. Обогащенность субъединицы коллагена I типа остатками пролина и гидроксипролина; роль этих «жестких» аминокислотных остатков в дополнительной стабилизации полипептидной цепи -спирали субъединицы; стабилизирующая роль лизиловых и гидроксилизиловых остатков в возникновении межцепочечных поперечных сшивок. Формирование коллагеновых фибрилл. Синтез коллагена I типа. Препроколлаген, структура. Проколлаген; ферменты гидроксилирования лизиновых и пролиновых остатков. Роль аскорбиновой кислоты; цинга. Последовательность гликозилирования проколлагена. Образование трехспиральной молекулы проколлагена: N- и С-концевые пропептиды; роль S-S-связей в возникновении глобулярной структуры пропептидов. Особенности гликозилирования и процессов скручивания проколлагенов в тройную спираль в аппарате Гольджи. Экзоцитоз трехспиральных молекул проколлагена в ЭцМ. Роль внеклеточных пептидаз в отщеплении N- и С-концевых пропептидов. Тропоколлаген. Сборка фибрилл коллагена в ЭцМ. Агрегация фибрилл в коллагеновые волокна. Поперечная исчерченность коллагеновых фибрилл и волокон; механизм возникновения.

Особенности организации и структуры гена коллагена I типа. Мутации генов коллагена, затрагивающие его структуру или синтез; их многообразие; характерный пример - синдром Марфана. Коллагенозы.

Особенности структуры фибрилл коллагенов III и V типов. Коллаген III типа – эмбриональный коллаген. Ассоциация коллагена I типа с III и V типами. Относительная тканеспецифичность продукции коллагенов I, III и V типов у взрослых млекопитающих. Коллаген II типа – специфический тип для хрящевой ткани. Особенности организации коллагенов IX и XI типов. Ассоциация коллагена II типа с IX и XI типами; значение для структурной организации хрящевого матрикса. Гетеротипические фибриллы, встречаемость и возможная роль. Смена типов коллагена в ходе нормального развития; смена типов - как отражение патологических процессов в ткани, на примерах развития атеросклеротического поражения сосудистой стенки, ранозаживления и регенерации ткани.

Нефибриллярные коллагены: IX, XII и XIV типы – так называемые коллагены с прерывистой тройной спиралью; ассоциация этих типов с фибриллярными коллагенами. Особенности структуры коллагена IX типа, взаимодействие с коллагеном II типа; роль в формировании гиалинового хряща и стекловидного тела глаза. Особенности экспрессии XII и XIV типов в ходе эмбрионального развития человека; близость к структуре IX типа, особенности ассоциации с коллагенами I и III типов.

IV, VIII и X типы коллагенов – способны образовывать структуры типа “сетей”. Структура VIII типа; роль несовершенных последовательностей в сетеобразовании. Десцеметова мембрана ретины глаза. Структура X типа. Паттерн экспрессии. Образование гексагональных решеток при эндохондральном окостенении; устойчивость к коллагеназам. Структура IV тип - молекулярного маркера базальных мембран. VI тип; особенности структуры; способность образовывать филаментоподобные структуры типа «четок»; RGD-последовательности; их возможная роль. Особенности экспрессии; изоформы VI типа коллагена в различных тканях. Возможная роль коллагена VI типа в организации ЭцМ. Изменение уровня экспрессии VI типа коллагена при фиброзных изменениях различной этиологии; остеохондрозах; при синдроме Дауна, при синдроме рыхлой кожи.

Базальная мембрана

Базальная мембрана – высокоспециализированный ЭцМ. Продукция базальных мембран эпителиями, мезенхимой и ее производными, эндотелием, скелетной, гладкой и сердечной мускулатурой. Роль базальных мембран в ходе эмбрионального развития и в поддержании структурной целостности и функциональных особенностей тканей в постнатальный период. Соотношение компонентов в составе базальных мембран; типоспецифичность базальных мембран. Базальная меммбрана – как адгезионная платформа для клетки; роль в движении клеток и их распластывании. Роль базальных мембран в ходе воспаления, ранозаживления, неоваскуляризации. Устойчивость базальных мембран к протеолитической деградации. Роль в предотвращении метастазирования.

Просвечивающая и электронная микроскопия структуры базальных мембран. Особенности организации базальных мембран в различных тканях и органах. Два слоя базальных мембран с различной плотностью – Lamina lucida и Lamina densa. Роль базальных мембран в поддержании цитоархитектоники тканей и их функциональной гетерогенности.

Самосборка базальной мембраны из «протомеров»; состав протомера – коллаген IV типа, ламинин, нидоген/энтактин, протеогликаны. Взаимодействие протомеров и два этапа возникновения супрамолекулярной архитектоники базальной.

Структура кора низкоплотного ГСПГ. Биологические свойства гепарина и гепарансульфата, входящих в состав ГСПГ; их роль в связывании с молекулой ламинина. Гепарансульфат – уникальный накопитель в ЭцМ фибробластного фактора роста (FGF); роль FGF и базальных мембран в ангиогенезе; роль активного гепарина или гепариназы в высвобождении с последующей активацией FGF.

Коллаген VII типа, структура, особенности доменной организации. Димеризация коллагена VII типа и сборка сети «заякоривающих фибрилл»; локализация сайтов связывания с коллагеном IV типа. Роль сети «заякоривающих фибрилл» во взаимодействии с коллагеном I типа и в дополнительном механическом укреплении базальной мембраны.

Современная модель организации и сборки базальной мембраны (Yurchenco P. и Schittny J.C., 1995-1997).

Положение сайтов сплайсинга в молекуле фибронектина. Варианты альтернативного сплайсинга большой ядерной мРНК фибронектина – основной механизм возникновения многообразия форм фибронектина на примере плазменного и матриксного фибронектина, варианты возникновения фибронектина, отвечающего за взаимодействие с иммунными лимфоцитами. Особенности экзон-интронной организации гена фибронектона млекопитающих. Возможная роль различных вариантов фибронектина, продуцируемых разными типами клеток. Особенности взаимодействия фибронектина с фибриллярными коллагенами, ассоциированными с различными протеогликанами. Роль рецепторов фибронектина во взаимодействии клеток с различными по составу внеклеточными матриксами, продуцируемыми раличными типами клеток. Формирование сайтов фокальной адгезии и фокальных контактов клетки с внеклеточным матриксом; участие RGD-последовательности IV домена и роль III домена в этом процессе. Сравнение доменной организации двух важнейших адгезионных гликопротеинов – фибронектина и ламинина.

Протеогликаны и гиалуроновая кислота– важнейшие компоненты ЭцМ. Распространение в царстве животных. Сравнение химического состава, размеров и молекулярных масс олигосахаридов, протеогликанов и гликопротеинов.

Структура протеогликанов: белковый кор и гликозаминогликаны. Структура гликозаминогликанов; дисахаридные компоненты, образованные аминосахарами (D-глюкозамином и D-галактозамином); сульфатированность аминосахаров; второй компонент – уроновые кислоты (L-глюкуроновая и L-идуроновая). Три типа связи полисахаридов с полипептидной цепью (кором) протеогликанов. Роль шероховатой эндоплазматической сети и аппарата Гольджи в синтезе и процессинге протеогликанов. Роль нуклеотидсахаров в процессе элонгации полисахаридных цепей. Химические модификации полисахаридных цепей – включение сульфатных групп, эпимеризация.

Структура семи типов гликозаминогликанов – хондроитин-6-сульфата, кератансульфата, хондроитин-4-сульфата, гепарансульфата, гепарина, двух форм дерматансульфата. Различия гликозаминогликанов по составу мономеров, гликозидным связям и числу сульфатных заместителей. Гликозаминогликаны – это полианионы; функциональные свойства гликозаминогликанов и их роль в создании высокоотрицательной по заряду среды в ЭцМ и поддержании равновесной среды в ЭцМ. Участие протеогликанов в создании в ЭЦМ гелей с различным размером пор и различной плотностью зарядов; роль как биологических фильтров.

Гиалуроновая кислота; уникальность структуры; состав дисахарида: глюкуроновая кислота и N-ацетилглюкозамин. Возникновение конформации «рыхлого клубка»; положение отрицательно заряженных карбоксильных групп. Размеры молекулы. Химическая основа гидрофильности гиалуроновой кислоты; гиалуроновая кислота – обязательный компонент большинства изученных ЭцМ и основа создания гидратированного геля в матриксе. Механическая роль гиалуроновой кислоты в создании давления набухания (тургора), в соединительнотканном матриксе. Регулирующее влияние клеток и коллагена матрикса в регуляции тургора. Участие гиалуроновой кислоты в ингибировании межклеточной адгезии и в инициации миграции клеток на примере морфологичесикх изменений в склеротомах; контролирующая роль гиалуронидазы в этих процессах.

Протеогликаны клеточной поверхности; особенности и типы заякоривания в плазматической мембране. Роль различных протеогликанов, представленных на поверхности клетки: механическая, регуляторная, «санитарная», метаболическая, информационная, рецепторная. Представленность на поверхности сходных типов клеток одного типа корового белка, связанного с определнным типом олигосахаридных цепей; исключения из этого правила. Различные типы клеток содержат различные по молекулярной массе и структуре коровые белки, связанные с различными по составу гликозаминогликанами; возможная роль таких различий. Эндоцитоз матриксных и связанных с плазматической мембраной протеогликанов; роль специфической по структуре группы протеогликанов, встроенных в плазматическую мембрану. Вовлеченность клеточно-поверхностных протеогликанов в межклеточные взаимодействия, влияние гепарансульфатпротеогликанов клеточной поверхности на конформационные изменения N-CAM. Самоассоциация гепарансульфатпротеогликанов; роль в кластеризации протеогликанов клеточной поверхности; значение этого явления для распластывания клеток, мигрирующих в очаг воспаления. Роль гепарансульфатпротеогликана в контроле клеточного роста; высокое сродство фибробластного фактора роста к этому типу протеогликанов; роль в морфогенезе капилляров.

Особенности взаимодействия гепарансульфат- и хондроитин-4-сульфат-протеогликанов с липопротеинами плазмы крови. Роль хондроитин-4-сульфата в возникновении пенистых клеток из макрофагов сосудистой стенки в атерогенезе. Роль хондроитин-4-сульфата в оседании в матриксе рыхлой соединительной ткани гранулоцитов, лимфоцитов и NK-клеток; взаимодействие хондроитин-4-сульфат-протеогликана клеточной поверхности с растворимыми коллагенами I и III типов и эластином матрикса.

Протеоглаканы хрящевой ткани; структура и молекулярная организация; роль гиалуроновой кислоты; нековалентное присоединение хондроитинсульфат- и кератинсульфат-протеогликана; участие и роль линкерных белков. Молекулярная организация матрикса хрящевой ткани – основа ее уникальных свойств. Гепарин. Уникальность первичной структуры белкового кора гепарина. Химический состав олигосахаридных цепей; высокий отрицательный заряд гепарина. Особенности взаимодействия гепарина с факторами свертывания крови IX иXI. Антикоагулянтная активность гепарина; взаимодействие с ₂ –гликопротеином плазмы крови, или антитромбином III; влияние образованного комплекса на активность тромбина. Роль взаимодействия гепарина с липопротеинлипазой на капиллярной стенке; роль в поддержании нормального кровотока в сосудах малого диаметра.

Исследования J. Holfreter (1935-1955) и A. Moscona (1952) по диссоциации и агрегации клеток зародышей амфибий и птиц; гипотеза о существовании специфических клеточно- поверхностных молекул адгезии, обуславливающих гомо- и гетеротипическое узнавание клеток и их роль в поддержании целостности клеточных пластов или тканей. Открытие двух типов (классов) молекул адгезии - мембранных рецепторов: (1) рецепторов, обуславливающих связь клетки с экстрацеллюлярным матриксом; (2) рецепторов, отвечающих за гомо- и гетеротипическое узнавание между клетками. Четыре основных семейства молекул адгезии: иммуноглобулиноподобное суперсемейство, семейство кадгеринов, суперсемейство интегринов и семейство селектинов.

Общая структурная организация трансмембранных белков этого суперсемейства. Сходство экстрацеллюлярного домена с С-доменом молекулы иммуноглобулинов. Одно- и двухсубъединичные рецепторы: из двух - субъединиц - семейство рецепторов Т-клеток: CD3, CD4, CD8, MHC класс I, MHC класс II; из одной - субъединицы - семейство N-CAM, семейство ICAM-VCAM.

Суперсемейство кадгеринов – это гомотипические молекулы адгезии, осуществляющие адгезию только в присутствии ионов Ca²⁺ . Два семейства этого суперсемейства: первое – кадгерины, второе – кадгерины десмосом. Семейство кадгеринов включает более 14 близкородственных молекул; наиболее изучены – E-, P-, и N-кадгерин; характеристика каждой из молекул адгезии; особенности экспрессии в пре- и постнатальном онтогенезе млекопитающих и птиц. Эксперименты Edelmann (1987), Jacob (1988), Takeihi (1987), показавшие ведущую роль кадгеринов в морфогенезе эпителиев зародыша человека и млекопитающих. Доменная организация трансмемдранного кадгеринового рецептора. Степень гомологии внеклеточного участка E-, P-, и N-кадгеринов. Димеризация кадгериновых рецепторов. Модель “одежной молнии”, объясняющая структуру межклеточных контактов при участии кадгериновых рецепторов. Полная гомология цитоплазматических участков; ассоциация этих участков с актиновым цитоскелетом через специальную группу белков – катенины. , и катенины; структура, особенности экспрессии; роль каждого из катенинов в образовании ассоциата цитоплазматического участка кадгеринового рецептора с актиновыми филаментами. Влияние эпидермального фактора роста (EGF) на фосфорилированиекатенина через активацию c-src, c-yes; катенин (плакоглобин) – обязательный компонент структурных белков десмосом; взаимодействие плакоглобина с цитокератиновыми филаментами. Современные представления о роли каждого из катенинов в образовании специализированных контактов между эпителиальными клетками: апикального опоясывающего комплекса (zonula adherens и zonula occludens), латеральных контактов и настоящих десмосом (zona macula adherens). Отвечают ли комплексы кадгерин/катенины за развитие полярности эпителиальной клетки? Представление о кадгеринах как о поверхностных рецепторах, вовлеченных в передачу сигнала в клетку. Роль так называемого «X-белка» (предположительно одного из членов семейства АРС-белков) в комплексе кадгерин/катенины – X-белок – актиновые филаменты.

Второе семейство – рецепторы адгезии в десмосомах – десмоглеины и десмоколлины; наличие изоформ у обоих белков; паттерны экспрессии изоформ; взаимодействие десмосомных кадгеринов с катенином (плакоглобином) или десмоплакином. Фенотипические проявления некоторых генетически-наследуемых аутоиммунных заболеваний, связанных с мутациями генов десмоглеинов и нарушением структуры десмосом. Ведущая роль кадгеринов/катенинов в сохранении целостности и поддержании полярности различных типов эпителиев в постнатальном онтогенезе. Кадгерины и рак.

Суперсемейство интегринов

Интегрины – поверхностные гликопротеины клетки, являющиеся рецепторами белков экстрацеллюлярного матрикса, или же выступающие как контррецепторы при взаимодействии с другими клетками. Интегрины - важнейший структурно-регуляторный компонент в инициации сборки фокальных контактов и фокальной адгезии. Роль интегринов в заякоривании клеток на внеклеточном матриксе; их значение для миграции и распластывании клеток на субстрате; роль в передаче информации от матрикса в клетку, влияние на рост, пролиферацию и дифференцировку клетки. Интегрины – непосредственные участники важнейших биологических процессов –иммунных, воспаления и посттравматического восстановления тканей, тромбообразования, поддержания гомеостатического состояния тканей; участие в процессах онкогенеза.

Структура интегринового рецептора; особенности доменной организации - и -субъединиц; особенности экстрацеллюлярного, трансмембранного и цитоплазматического участков рецептора. Нековалентное взаимодействие - и -субъединиц рецептора; положение лиганд-связывающего сайта; роль цистеиновых остатков в -субъединице; остатки тирозина как потенциальные сайты фосфорилирования у некоторых -субъединиц; Ca²⁺- и Mg²⁺-связывающие сайты -субъединиц и роль ионов Ca²⁺ во взаимодействии с лигандом. Разнообразие -субъединиц (16) и -субъединиц (8 и более). 20 и более различных типов интегринов млекопитающих. Деление суперсемейства на семейства -1, -2, -3, -4, -5, -6 и -7 интегринов. Взаимодействие интегринового рецептора через -субъединицу с актиновым цитоскелетом; участие актин-связывающих белков – талина, винкулина и др., а также некоторых тирозинпротеинкиназ во взаимодействии интегриновых рецепторов с цитоскелетом клетки. Роль RGD-последовательности, представленной в важнейших адгезионных белках матрикса – фибронектине, ламинине, коллагенах, витронектине и некоторых других, в распознавании лиганда -субъединицей рецептора. Модель т.наз. «-пропеллера», образуемого лиганд-связывающим участком. Активация интегринового рецептора; роль процессов ди- и олигомеризации рецепторов; конформационные изменения рецептора, вызванные активацией; интегриновый сигнал в клетку; возможные участники начальных этапов передачи сигнала – FAK-киназа, MAP-киназы, c-src-киназа, рр60-киназа, малые ГТФфзы семейства rho. Влияние интегринового сигнала на перестройку актинового цитоскелета кортекса и цитоплазмы и инициацию сборки сайтов адгезии. Аффинность интегриновых рецепторов. Моно- и полиспецифичность интегриновых рецепторов в распознавании и связывании с лигандом или лигандами ЭцМ. Многообразие типов интегриновых рецепторов, представленных на поверхности клетки; ансамбли интегринов как отражение стерени дифференцированности клеток; различия в аффинности связывания; взаимодействие с различными изоформами лигандов; возможная биологическая роль. Интегрины – как контррецепторы (лиганды) молекул адгезии ICAM-VCAM при гетеротипическом взаимодействии клетка-клетка. Регуляция экспрессии интегриновых молекул в пре- и постнатальном онтогенезе. Характеристика семейств 1-, 2-, 3-, 4- интегринов и их роль в биологических процессах.

Суперсемейство селектинов

Семейство высокогликозилированных адгезионных белков клеточной поверхности, впервые идентифицированных на лимфоцитах, эндотелиальных клетках и активированных тромбоцитах: L-селектин (хоминг-рецептор), E-селектин (ELAM), P-селектин (GMP-140, или PADGEM). Структура доменов трех типов селектинов: присутствие на NH₂-конце молекул лектинового домена и следующих за ним различного числа аминокислотных последовательностей, характерных для комплемент-связывающих белов; трансмембранный и цитоплазматический участки; роль каждого из участков в молекуле селектина в осуществлении ее функций. Структура лиганда – сиалил-Lewis^x (CD15S) – общего для всех селектинов; экспрессия этого антигена на гранулоцитах, моноцитах и некоторых миелоидных лейкемических клетках. Селектины-типичные представители молекул адгезии, участвующие в гетеротипическом узнавании между некоторыми типами клеток крови и эндотелием; уникальная роль селектинов в адгезии клеток крови на эндотелий, осуществляемая в потоке крови; вовлеченность Е- и Р-селектинов эндотелия в этапы адгезии лейкоцитов на эндотелий и их проникновение в очаг воспаления; Е-селектины и т. наз.. “rolling” лейкоцитов по поверхности эндотелия; Р-селектины и их роль в более прочном связывании лейкоцитов с эндотелием; роль медиаторов воспаления в усилении экспрессии Р-селектина на эндотелии; активация адгезированного нейтрофила хемотактическими агентами. Усиление экспрессии интегриновых рецепторов 1, 2 и 7 семейств на активированных нейтрофилах и их контррецепторов на эндотелии - ICAM-1, -2, -3, VCAM-1. Механизм миграции нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов в очаг воспаления. Высокая эволюционная специализация селектинов. Примеры других возможных функций селектинов.

Три формы сигнализации с помощью секретирующих молекул: эндокринная, паракринная и синаптическая. Запрограммированность ответа каждой клетки на специфическую комбинацию сигнальных молекул. Селективность ответа клетки на внешние сигналы является продуктом их дифференцировки. Специализированные белки, называемые рецепторы, связывающие определенную внеклеточную сигнальную молекулу, инициируют ответ клетки. Три класса поверхностных рецепторов: рецепторы, образующие ионные каналы, рецепторы, сопряженные с G-белками и каталитические рецепторы. Характеристика механизмов каждого из трех классов этих рецепторов. Важнейшие внутриклеточные посредники или внутриклеточные медиаторы – циклический AMP (cAMP) и Ca²⁺. Действие внутриклеточных посредников на поведение белков-мишеней в клетке. Разнообразие белков-мишеней. Сравнение различных путей генерирования сигналов с образованием вторичных посредников во всех типах животных клеток при взаимодействии их рецепторов с лигандами; лиганды, влияющие на изменение внутриклеточного содержания c-AMP, сопряжение рецепторов с аденилатциклазой через G_s –белок; путь, наиболее распространенный у эукариот, – сопряжение активированного рецептора через инозитолфосфат с высвобождением Ca²⁺ из внутриклеточных хранилищ; роль фосфоинозитидов в передаче сигнала; роль активированного рецептора в активации фосфоинозитид-специфической фосфолипазы С; роль этого фермента в образовании из фосфотидилинозитолбифосфата (PIP₂ ) двух важнейших продуктов – инозитолтрифосфата (InsP₃ или IP₃) и диацилглицерола. Роль InsP₃ в повышении внутриклеточного содержания ионов Ca²⁺; диацилглицерол -активатор протеинкиназы С (С-киназа); зависимость активности С-киназы от Ca²⁺ . Каскад фосфорилирований ряда регуляторных (протеинкиназы) и структурных белков с различными функциями в клетке-мишени. Участие активированной С-киназы в усилении транскрипции определенных генов; предполагаемый механизм участия.

Рецепторы факторов роста относятся к типу каталитических поверхностноклеточных рецепторов. Пять классов каталитических белков-рецепторов; большинство из них относится к классу гликопротеинов с тирозин-специфической протеинкиназной активностью, однократно пронизывающих мембрану. Структура этого типа рецепторов; особенности структурной организации внеклеточного и цитоплазматического (киназного) доменов. Активация этого типа рецепторов – связь димеризации и аутофосфорилирования тирозиновых остатков в цитоплазматическом домене рецептора. Роль лигандов в разнообразии механизмов димеризации рецепторов различных факторов роста. Активированные каталитические рецепторы связываются в различных комбинациях с сигнальными белками в клетках-мишенях, что обеспечивает различия в клеточном ответе на действие одного и того же лиганда. Роль SH2- и SH3-доменов сигнальных цитозольных белков во взаимодействии с киназным доменом рецептора. Структура SH2- и SH3-доменов. Разнообразие типов сигнальных белков. Короткий путь передачи сигнала при взаимодействии лиганда с рецептором приводит к активации протеинкиназы С. Примеры того, как активация в клетке-мишени сигнальных белков - фосфолипазы С и протеинкиназы А в сопряжении с протеинкиназой С приводит к быстрому и мощному ответу клетки на действие сигнальной молекулы.

Роль факторов роста в регуляции клеточного цикла; участие факторов роста компетенции и прогрессии в выходе клетки из состояния покоя и переходу к фазе G1 клеточного цикла; роль факторов роста в поддержинии фазы G1.

Фактор роста тромбоцитов (ТФР, или PDGF)

Тромбоциты и клетки мезенхимного происхождения – место синтеза, накопления и секреции PDGF. Особенности первичной структуры мономеров цепей PDGF. Три изоформы PDGF человека и млекопитающих - AA, BB, AB. Локализация генов А и В цепей в хромосомах человека, особенности экспрессии этих генов. Протоонкоген c-sis и онкоген v-sis кодируют В-цепь; особенности их экспрессии в нормальных и раковых клетках. Клетки соединительной ткани и крови, способные к синтезу и секреции PDGF, создают условия его локального накопления в тканях и плазме крови. Рецептор PDGF относится к суперсемейству иммуноглобулиноподобных рецепторов факторов роста. Структура рецептора PDGF; особенности организации внеклеточного домена, цитоплазматического тирозинпротеинкиназного домена.  и  типы рецепторов PDGF; степень их гомологии и особенности структуры; особенностив связывании PDGF-АА и PDGF-ВВ; лигандная специфичность - и -типов рецепторов. Особенности экспрессии - и -типов рецепторов PDGF нормальными и раковыми клетками. Димеризация рецепторов PDGF, их активация. Активация сигнальных белков – PI₃-киназы; белка, активирующего ГТФ-азу, и фосфолипазы С-, содержащих SH2- и SH3-домены. Активация протеинкиназы С с последующей активацией ядерного фактора каппа В (NF-kB), активация гена IFN/ при участии NF-kB, аутокринная регуляция поддержания клеткой дифференцированного состояния IFN/.

Примеры механизмов действия PDGF как типичного фактора компетенции, способного удерживать клетки в дифференцированном состоянии. Приобретение клетками компетентности к воздействию факторов прогрессии (т.е. переходу из G0- в G1-фазу клеточного цикла) зависит от концентрации PDGF и продолжительности его действия. Примеры, когда PDGF выступает как митоген клеток мезенхимного происхождения в условиях хронического воспаления, посттравматической регенерации соединительной ткани. PDGF и модификация внеклеточного матрикса. PDGF как стимулятор хемотактической активности клеток. Влияние PDGF на поведение гладкомышечных клеток в нормальной и атеросклеротически измененной сосудистой стенке. Роль PDGF в эмбриональном развитии. PDGF и трансформация клеток. Современная модель ауто- и паракринного влияния PDGF на пролиферативное поведение клетки.

Семейство эпидермального фактора роста (ЭФР, или EGF)

Представители семейства: EGF, трансформирующий фактор роста альфа (TGF-) и некоторые джругие.

EGF – типичный представитель этого семейства. Работы S. Cohen (1960-1975гг.) по выделению и изучению биологического действия EGF. Структура нативной формы EGF. Структура внутриклеточного предшественника EGF. Структура гена EGF и особенности его тканевой экспроссии.

Трансформирующий фактор роста альфа - TGF- – эмбриональная форма EGF (G. Todaro ,1978). Секреция TGF- карциномными и эмбриональными клетками. Рецептор EGF – трансмембранный гликопротеид; особенности организации внеклеточного домена; цитоплазматический домен – типичная тирозинпротеинкиназа.

Протоонкоген c-erbB кодирует рецептор EGF, а онкобелок v-erbB – это «усеченный» вариант рецептора EGF. Особенности экспрессии генов c-erbB и v-erbB. Лигандная специфичность рецепторов EGF. Особенности димеризации рецептора EGF.

EGF – яркий представитель факторов прогрессии. Представление о механизмах внутриклеточной передачи сигнала после взаимодействия EGF с рецептором. Примеры митогенного влияния EGF на различные типы клеток; EGF стимулирует переход клеток из фазы G1 в фазу S клеточного цикла. Роль EGF в ингибировании синтеза коллагена I в костной ткани. Влияние EGF на экспрессию ядерных протоонкогенов c-fos и c-myc; значение для процессов дифференцировки. Раковые клетки не синтезируют EGF, но экспрессируют либо нормальный, либо “усеченный” рецепторы EGF; TGF- является их лигандом.

Секреция проEGF эндокринными железами желудочно-кишечного тракта. Гомеостатическая роль EGF в поддержании целостности эпителиальной выстилки желудочно-кишечного тракта. Механизм действия EGF в поддержании целостности кишечного эпителия и поддержании полярности и целостности эпителия дистальных отделов почечных канальцев.

Семейство фибробластного фактора роста (ФФР, или FGF)

Девять представителей семейства FGF. Исследования D. Gospodarowicz по выделению и изучению структуры кислого и основного FGF. Современая номенклатура представителей семейства FGF. Структура FGF-1 (aFGF) и FGF-2 (bFGF); отсутствие сигнальных последовательностей у FGF-1, -2 и –9, в отличие от FGF-3 – FGF-8. Проблемы понимания механизма секреции FGF-1 и FGF-2. FGF-1 и FGF-2 секретируют эмбриональные и взрослые клетки; FGF-3-8 – эмбриональные, трансформированные и раковые клетки. Локализация генов FGF1-9 в геноме человека; особенности их экспрессии. Множественность изоформ представителей семейства FGF; разнообразие способов возникновения изоформ. Интернализация экзогенного FGF-1 и FGF-2 клеткой. Обнаружение стабильных фрагментов FGF-1 и –2 в ядре; возможная их роль в ядре.

Особенности связывания FGF с рецепторами. «Высокоаффинные» сигнальные рецепторы с тирозинпротеинкиназной активностью и «низкоаффинные» рецепторы – различные по структуре трансмембранные гепарансульфатпротеогликаны. Структура четырех типов «высокоаффинных» рецепторов, наличие изоформ у каждого из типов; значение каждой из иммуноглобулиноподобных петель экстрацеллюлярного домена и межпетлевых участков в «высокоаффинном»связывании лиганда с рецептором; роль степени гликозилирования для функциональной активности связывания рецептора с лигандом. Структура цитоплазматического тирозинпротеинкиназного домена.

Лигандная специфичность сигнальных рецепторов FGF-1-4; представленность определенных сочетаний типов рецепторов на различных типах клеток; современные представления и гипотезы, объясняющие биологическую роль столь большого разнообразия изоформ лигандов и рецепторов.

Структура «низкоаффинного» рецептора FGF, относящегося к семейству синдеканов - трансмембранных гепарансульфатпротеогликанов (ГсПГ); роль корового белка в секреции и закреплении этого типа рецептора в плазматической мембране. Шесть сайтов связывания с гепарансульфатными цепями; роль связывания цитоплазматического домена с кортикальным актином. Роль ГсПГ-рецептора в депонировании FGF, защите от протеолитической деградации; участие ГсПг-рецептора в индукции ди- и олигодимеризации «высокоаффинных» рецепторов. Модель, предложенная Schlessinger, (1996) для объяснения функций «низкоаффинного» рецептора, как презентирующего лиганд «высокоаффинному» рецептору. Активация сигнального рецептора. Важнейшая активируемая сигнальная молекула в клетке – PLC-; ее активация обуславливает множество функции FGFs – в эмбриональной индукции, дифференцировке, хемотаксисе, но не в индукции пролиферации. В стимуляции пролиферации (под действием FGF-2) главным участником является активированная протеинкиназа С. Ее участие в активации генов быстрого, или первичного, ответа (переход из G0 в G1 фазу). Экспрессия второй группы - генов медленного ответа, непосредственно связанная с работой первой группы, приходится на середину – конец G1 фазы и обеспечивает переход к S –фазе – это гены определенных типов циклинов, негистоновых хромосомных белков, синдекана и некоторых других. Особенности влияния FGF на культивируемые клетки. Роль FGF-1 и-2 в ангиогенезе опухолей (J.Folkmann). Роль FGF-2 в миграции и пролиферации эндотелия и гладкомышечных клеток при нарушении целостности сосудистой стенки. Значение FGF-2 в развитии рестенозов сосудистых трансплантатов и протезов; возможные методы и подходы для борьбы с рестенозами. FGF-1 и –2 – как обязательные участники острых и хронических воспалений и посттравмвтического восстановления тканей.

Суперсемейство трансформирующего фактора роста бета

(ТФРбета, или TGF_s)

Девятнадцать представителей суперсемейства TGF_ включает четыре близких семейства: TGF_, V_g/DPP/BMP (вегетализирующий фактор роста, определяющий дорзовентральную ось/фактор морфогенеза кости), Inhibin/Activin (ингибин/активин – факторы контроля дифференцировки и индукции мезодермы), MIS (фактор регрессии мюллерова протока). Эволюционная консервативность представителей суперсемейства TGF_s. Краткая характеристика биологического действия представителей каждого семейства, многообразие изоформ. TGF_ - характерный представитель суперсемейства. Структура молекулы TGF_, особенности синтеза и секреции. Латентный предшественник TGF_. Образование гомо- и гетеродимеров. Особенности депонирования предшественника в экстроцеллюлярном матриксе, поступление и транспорт в плазме крови; молкулы, участвующие в его депонировании и транспорте. Представления об ограниченном протеолизе предшественника. Шесть типов рецепторов TGF_. Ser/Thr-протеинкиназа – сигнальный тип рецептора TGF_, представленность на различных типах клеток у млекопитающих. Краткая характеристика молекулярной организации основных четырех типов сигнальных рецепторов: Daf-1, TGF_-II-R, Act-IIB-R, Act-II-R; структура и гомология киназных доменов; изоформы этого типа рецепторов; спорные вопросы о роли различных участков экстрацеллюлярного домена. Лиганд-препрезентирующий тип рецепторов - бетагликан III типа, а также эндоглин. Структура презентирующих рецепторов, их молекулярное разнообразие. Образование рецепторных комплексов между двумя типами рецепторов, необходимое для связывания лиганда с сигнальным рецептором. Современные представления о механизмах презентации лиганда и связывания с сигнальным рецептором. Экспериментальные данные о механизмах передачи сигнала сигнальным рецептором; возможные кандидаты в субстратные белки, их многообразие; роль эффекторных цитоплазматических молекул - SMAD в передаче информации в ядро; структура SMAD, их разнообразие; трудности интерпретации результатов.

TGF_s – как типичные факторы компетенции; сочетание пара- и аутокринных путей регуляции, современные представления. Бифункциональность биологического действия TGF_ - с одной стороны, временные ингибиторы пролиферации эпителиальных клеток и клеток мезодермального и мезенхимного происхождения, выступающие как мощные факторы дифференцировки и индукторы синтеза компонентов внеклеточного матрикса, а с другой – в сочетании с работой других факторов – как активатора пролиферации, что обеспечивает выход клеток из состояния покоя и переходу в активный клеточный цикл. Различие биологического действия TGF_ in vitro и in vivo. Современные представления о молекулярных механизмах действия TGF_ как ингибитора пролиферации. Роль TGF_ в ингибировании роста и пролиферации раковых клеток эпителиального происхождения, представление о механизме такого ингибирующего действия. Роль представителей семейства TGF_ в хемотаксисе, в перестройке костной ткани. Роль TGF_s в дифференцировке IL-2-зависимых Т-лимфоцитов, влияние на поведение макрофагов – роль TGF_s в реализации воспалительных реакций.

Представители суперсемейства TGF_ - важнейшие регуляторы индукции мезодермы; регуляторы дифференцировки. Роль в определении паттерна симметрии зародышей позвоночных и морфогенеза зародышевых тканей. Возможные последствия нарушения таких механизмом и развитие позвоночных животных.

Биологические эффекты TNF_: TNF_ как аутокринный фактор дифференцировки макрофагов и гранулоцитов и активации макрофагов в усилении продукции иммунорегуляторов и медиаторов воспаления. Роль TNF_ в активации гранулоцитов при остром воспалении; ее молекулярный механизм. Роль TNF_ в кахексии, анорексии и ожирении. Использование TNF_ для клинических целей – современное состояние вопроса.

Определение терминов “протоонкоген” и “онкоген”. Основные процессы в жизни клетки куда вовлечены продукты протоонкогенов –регуляция контроля нормального роста и пролиферации, течения клеточного цикла, а также дифференцировки. Мутации и другие нарушения в структуре или работе протоонкогенов – главные причины появления признаков онкотрансформации клетки. Экспериментальные данные, позволяющие разделить онкогены на несколько групп: иммортализующие клетку, снижающие потребность клетки к экзогенным факторам роста; изменяющие характер взаимодействия клетки с субстратом, влияющие прямо или опосредованно на контроль пролиферации. Трансгенные мыши – прекрасная модель для изучения роли онкогенов в онкогенезе. Модели, используемые в экспериментах in vitro для идентификации новых онкогенов.

Открытие онкогенов; вирусные онкогены. Структура генома ретровирусов; особенности интеграции вирусного генома в геном клетки-хозяина. Деление ретровирусов на два класса. Современные представления об активации онкогенов через ретровирусную трансдукцию; активация онкогенов путем инсерции вируса. Выявление онкогенов в раковых клетках человека. Хромосомные транслокации (характерные примеры) и места выявления онкогенов в раковых клетках; использование различных технологий по трансфекции ДНК, выделенных из трансформированных или раковых клеток в слаботрансформированные клетки линии NIH 3T3; химический канцерогенез и выявление онкогенов. Примеры химерных генов, механизмы их возникновения. Амплификация протоонкогенов и онкогенез; их выявление и прогностическое значение при диагностике и лечении некоторых типов рака человека.

Эволюционная консервативность протоонкогенов и их продуктов у эукариот. Группы вирусных онкогенов и их продуктов гомологичные таковым протоонкогенам: факторов роста; рецепторов, лишенных протеинкиназной активности; тирозинпротеинкиназ, интегрированных в плазматическую мембрану, т.е. рецепторов факторов роста; цитоплазматических и подмембранных тирозинпротеинкиназ; семейство мембранносвязанных G-белков; семейство белков GFF (guanine nucleotide exchange proteins); цитоплазматических Ser/Thr-протеинкиназ; семейство ядерных белков.

Краткая характеристика молекулярных и фенотипических изменений в клетке, происходящих вследствие гиперактивации или гиперпродукции продуктов тех онкогенов, которые гомологичны основным группам протоонкогенов: факторам роста, на примере v-sis; рецеторам факторов роста с тирозинпротеинкиназным (ТПК) доменом на примерах v-erbB, v-fms, met, trk, ras, v-kit, bck; рецепторам факторов роста без ТПК домена, на примере mas нерецепторных ТПК – на примере v-scr, v-fes, v-fos, v-yes и lck; белков с активностью ГТФаз –ras-онкогенов;нарушение основных молекулярных механизмов, наблюдаемых при передаче сигнала в клетке с участием ras p21; ядерных онкобелков, участвующих в контроле экспрессии важнейших групп генов регулирующих клеточный цикл, пролиферацию, дифференцировку и адгезию. Структура протоонкогенов и протоонкобелков fos, jun, myc; гомо- и гетеродимерные белки; «лейциновые застежки» и “basic domain’ы”, их роль во взаимодействии протоонкобелков с соответствующими участками геномной ДНК. Особенности изменений структуры онкогенов v-fos, v-jun и других и влияние таких мутаций на их экспрессию и поведение у онкотрансформированных клеток in vitro и in vivo.

Онкогены и онкобелки – как диагностические и прогностические маркеры различных типов рака у человека; их значение для ранней дианостики рака и химиотерапии.

Определение “клеточный цикл”, “митотический (пролиферативный) цикл”. Создание метода авторадиографии, разделение интерфазы на G1-, S- и G2-периоды. М-период. Параметры клеточного цикла - по модели цикла, разработанной Pardee A. и соавт. (1975, 1978). Относительная стабильность и варьирование продолжительности периодов (фаз) клеточного цикла клеток млекопитающих. Примеры, когда не выявляются G1, G2+G2, S+G1+G2. Эксперименты, показывающие, что самостоятельность механизма контроля определенной фазы цикла относительна и является составной частью общего механизма контроля цикла, жестко контролирующего нормальную последовательность прохождения фаз клеточного цикла. Регуляция интенсивности клеточной пролиферации зависит от G1- и G2-фазы. Рост и дифференцировка клеток связаны с изменением интенсивности их пролиферации. Разделение тканей млекопитающих на три группы (по Leblond C.P., 1964,1982) в зависимости от темпа их пролиферации: неразмножающиеся (static) популяции; популяции с очень низким темпом пролиферации (expanding); обновляющиеся (renewing) популяции. Общая характеристика обновляющихся тканей, определение понятий «стволовые клетки» (stem cells), “коммитированные клетки”, “клетки-предшественники”, “зрелые клетки” – сходства и различия. Понятия “пролиферативный пул”, “пролиферативный потенциал”, “лаг-период клеточного цикла”, “ пролиферативный период”. Наблюдения и эксперименты, свидетельствующие о периоде покоя (G0, или R) в клеточных системах многоклеточных. Выход клеток в покой по завершении М-фазы, либо - S-фазы; сходство и различия клеток вышедших в покой и составляющих т.наз. R1- и R2- популяции; примерв таких популяций. Понятие «углубление в покой»; эксперименты, показывающие, что клетки по разному углублены в покой. Выход клеток из состояния покоя; экспериментальные модели in vitro и in vivo; современные представления о механизмах выхода клеток из покоя; роль факторов роста. Разнообразие механизмов умножения генома в митотическом цикле, примеры таких клеточных популяций у человека и млекопитающих. Современная модель клеточного цикла эукариот; понятие “точек перехода” (рестрикции, R) в G1- и G2-фазе; теоретические предпосылки и экспериментальные модели поиска молекул-регуляторов, координирующих вступление и прохождение каждой из фаз клеточного цикла; общие теоретические представления о механизме контроля клеточного цикла эукариот.

Ингибиторы циклин-зависимых киназ; семейство INK4 белков и семейство CIP/KIP белков; их структура, особенности экспрессии в ходе клеточного цикла. Субстраты-мишени для активированных cdk – т.наз. «М-киназы» (MPF): H1-гистон, MAP-киназы, MAP-белки, белки ядерной ламины; особенности структуры этих белков и их фосфорилирования для осуществления перехода из G2- в M-фазу. Субстраты-мишени “Start kinase” (определенные комплексы циклин-cdk) необходимые для перехода из G1- в S-фазу: Rb-белок, s6 и некоторые факторы, участвующие в репликации ДНК.Особенности этапов фосфорилирования Rb-белка; высвобождение фактора транскрипции E2F; его роль в усилении транскрипции генов необходимых для осуществления S-фазы, а также экспрессии гена циклина Е, последующего образования активного комплекса циклин Е-cdk2, необходимого для преодоления точки перехода (R1) из G1- в S-фазу; роль комплекса циклин А-cdk2 в инактивации фактора E2F.

Протеолиз и регуляция клеточного цикла. Деградация циклина В обеспечивает необратимый переход от метафазы к анафазе. Структура протеосом (26S комплексы); убиквитин, его структура, селективно-сигнальная роль убиквитина при его связывании с белком, впоследствии подвергающемся деградации в протеосоме. Убиквитин-активирующие ферменты. “Destruction box” – особый мотив в молекуле циклина В, распознаваемый убиквитином. АРС-комплексы, их структура и состав, роль АРС-комплексов в убиквитинилировании циклинов В в мета- анафазе и циклинов в G1-фазе.

Общая схема молекулярных механизмов, участвующих в регуляции клеточного цикла млекопитающих.

Основные понятия генной инженерии: клонирование, трансформация, вектор. Основные свойства векторов, используемых в генной инженерии. Векторы замещения. Инсерционные векторы.

Векторы на основе плазмид. Участок ori, селективные маркеры, полилинкер. Система селекции с использованием альфа цепи бетта-галактозидазы. Компетентные клетки. Сравнительная характеристика различных штаммов. Бактериофаг М13. Эффективность трансформации, ее зависимость от длины плазмиды. Векторы на основе фага лямбда. Векторы ВАС, РАС, YAC. Области применения рассматриваемых векторов.

Система модификации-рестрикции бактерий. Рестриктазы второго типа. Изошизомеры. Другие ферменты, используемые в генной инженерии: ДНК-лигазы, ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназа фага Т4, фосфатазы. Способы встраивания чужеродной ДНК в вектор. Геномные клонотеки. Представительность клонотеки, минимальное число анализируемых клонов.

Анализ нуклеиновых кислот с помощью электрофореза. Разрешающая способность геля. Агарозные и акриламидные гели. Методы визуализации нуклеиновых кислот в геле. Конформация молекул нуклеиновой кислоты при электрофорезе. Денатурирующий электрофорез. Капиллярный электрофорез. Импульс-электрофорез.

Плавление ДНК. Температура плавления, интервал плавления. Гибридизация. Примеры «+» и «-»-гибридизации. Мембраны для иммобилизации нуклеиновых кислот. Получение ДНК- и РНК- зондов для гибридизации, Саузерн- и Нозерн-гибридизация. Использование изотопов и флюоресцентных красителей. Создание геномных клонотек, покрывающих геном. Скрининг геномных клонотек.

Картирование. Физические карты, генетические карты. Масштаб физической и генетической карты. Рекомбинационные единицы. Клонотеки, представляющие отдельные хромосомы. "Шаги" и "прыжки" по хромосоме. Энциклопедии генов.

Определение последовательности нуклеотидов. Метод полимеразной достройки ДНК с использованием модифицированных нуклеотидов-терминаторов (метод Сэнгера), метод специфической химической модификации оснований с последующим расщеплением ДНК (метод Максама-Гильберта). Автоматическое секвенирование. Определение последовательностей нуклеотидов длинных фрагментов ДНК.

Полимеразная цепная реакция. Области применения. Основные параметры реакции. Термостабильные ДНК-полимеразы.

Подходы к картированию геномов высших эукариот. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP), ДНК-маркирующие сайты (STS). Различные нуклеотидные повторы и их использование для картирования. Микросателлитные маркеры. Геномная дактилоскопия. Определение полной последовательности нуклеотидов организмов. Программа «Геном человека».

Создание клонотек кДНК. Методы скрининга клонотек кДНК: гибридизация нуклеиновых кислот, иммунологическая детекция специфических антигенов, гомологичная рекомбинация, отбор по продуцированию биологически активных молекул. Определение точки начала транскрипции. Метод «футпринтинга».

Основы биоинформатики: сравнение последовательностей нуклеотидов, сравнение последовательностей аминокислотных остатков. Гомология. Идентификация функциональных областей генома на основе нуклеотидного состава. Базы данных. Знание полной последовательности нуклеотидов генома: что это дает?

Клонирование новых генов. Открытые рамки считывания. Переход к последовательности аминокислотных остатков. Анализ экзон - интронной структуры. Определение хромосомной локализации. Поиск регуляторных элементов. Предсказание функции клонированного гена по первичной структуре.

Позиционное клонирование. Ген-кандидат. Анализ сцепления. Генетические маркеры. Прямая и непрямая генная диагностика.

Генная инженерия высших эукариот. Модельные организмы. Генная терапия: задачи, подходы, векторные системы. Дополнительная и заместительная генная терапия. Гомологичная рекомбинация. Регуляция экспрессии внесенных генов. Морально-этические проблемы генной терапии. Оценка и возможное уменьшение биологического риска, связанного с созданием и распространением рекомбинантной ДНК.

Получение продуцентов интересующих белков. Векторные системы. Способы оптимизации продуцентов. Выделение и очистка слитных белков. Получение белков в активной форме. Посттрансляционная модификация.

Взаимосвязь генов в клетке. Генные сети. Методы изучения экспрессии генов. Подходы к изучению экспресси генов на уровне целой клетки. Array, EST. Проблемы интерпретации полученных результатов.

Протеом.