Проекты партнерских фундаментальных исследований СО РАН на 2012-2014 годы

№ гос. регистрации 01201373873

В озёрах различных климатических зон исследовано биохимическое качество основных кормовых объектов молоди рыб - двух групп планктонных ракообразных, Cladocera и Copepoda. Установлено, что различия в содержании докозагексаеновой кислоты (ДГК, 22:6n-3), имеющей ключевое значение для формирования нервной системы рыб, в кладоцерах и копеподах обусловлены в первую очередь их филогенетическими особенностями, а не температурными различиями местообитаний. Впервые доказано, что, вопреки существующим представлениям, и в холодных, и в тёплых озёрах копеподы содержат существенно больше ДГК, чем кладоцеры, и, следовательно, имеют более высокую биохимическую ценность как кормовые объекты для молоди рыб.


Результаты многомерного дискриминантного анализа жирнокислотного состава Cladocera и Copepoda тёплых озёр (ТО) и холодных озёр (ХО). Кружки закрашенные – Cladocera ТО, кружки пустые – Cladocera ХО, треугольники закрашенные – Copepoda ТО, треугольники пустые – Copepoda ХО.
Приоритетное направление VI.43. Экология организмов и сообществ.

Партнерский проект № 4, выполняемый совместно с организациями Тайваня. Структура и функции микробных сообществ в стратифицированных озерах Хакасии в настоящем и прошлом: наблюдения и биофизические модели

Координатор проекта ак. А.Г. Дегерменджи

№ гос. регистрации 131017150309

На основе анализа натурных данных за период наблюдений с 2002 по 2013 гг. выявлено, что межгодовые вариации глубины перемешивания водной толщи озера Шира существенно определялись изменением подледного объема воды, который, в свою очередь определялся разностью между уровнем поверхности озера и толщиной льда. Показано, что в периоды роста уровня воды глубокие перемешивания миксолимниона менее вероятны, а при снижении уровня воды – более вероятны. Полученная информация будет использована при модернизации математической прогнозной модели и полезна при палеолимнологических реконструкциях.



Высота поверхности над уровнем моря и характеристики стратификации озера Шира в подледные периоды: высота поверхности над уровнем моря ( ); потенциальная энергия стратификации (стабильность по Шмидту) ( ); вариации уровня нижней кромки льда (ΔH_L) ( ).
3.3. Результаты работы молодых ученых, получивших финансирование по научным темам, утвержденным постановлением Президиума СО РАН от 13.01.2011 № 11 «О выделении дополнительных ставок научным организациям СО РАН для зачисления в штат молодых ученых
н.с. ИБФ СО РАН к.б.н. В.В. Красицкая

Тема: «Получение и изучение новых биолюминесцентных репортерных белков и разработка мультипараметрического молекулярного микроанализа на их основе»

Основные результаты исследований:

1. Разработан способ определения однонуклеотидного полиморфизма (SNP) на основе реакции удлинения праймера (PEXT) с последующим биолюминесцентным твердофазным микроанализом продуктов. В качестве репортеров используются светоизлучающие белки - обелины, обладающие разными характеристиками биолюминесцентных реакций.

Показана перспективность способа на примере генотипирования полиморфизмов генов, контролирующих свертывание крови и приводящих к тромбоэмболическим заболеваниям: гена проакцелерина - пятого коагуляционного фактора (F5) по сайту 1691 G→A (R506Q), гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) по сайту 677 С→Т (А223V), гена протромбина - коагуляционного фактора II (F2) по сайту 20210 G→A и гена коагуляционного фактора VII (F7) по сайту 10976 G→A (R353Q).

Проведена оценка аналитических характеристик предложенного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма, а также показателей его затратности в сравнении с коммерческим тестом НПО «Литех», основанным на технологии ПЦР в реальном времени. Показано, что способ является высокочувствительным (для анализа достаточно 10 фмоль ДНК матрицы), и в отличие от теста «Литех» не зависит от метода и источника выделения геномной ДНК. Высокая воспроизводимость свидетельствует о надежности метода. По трудозатратам метод не отличается от ПЦР в реальном времени. Полученные результаты показывают пригодность метода для использования в практике клинических лабораторий.

2. В рамках интеграционного проекта СО РАН №139:

• 
  Проведены исследования по получению слитых белков миниантитело- репортерный белок обелин как потенциальных высокочувствительных меток для использования в биолюминесцентном иммуноанализе. В качестве антитела использовали миниантитела 93ms4 и 4MA2 к фактору некроза опухоли альфа (αФНО), представляющие собой вариабельный домен легкой и тяжёлой цепи моноклонального антитела, соответственно. ДНК фрагменты, кодирующие миниантитела были получены методом фагового дисплея в ИХБФМ СО РАН. В ходе работы сконструированы плазмидные вектора pET22-93ms4-Obe и pET22-4MA2-Obe, содержащие в одной рамке считывания: ген миниантитела 93ms4 или 4MA2 и ген фотопротеина обелина. Правильность конструкций подтверждена секвенированием. Полученный вектор обеспечивает под контролем промотора лактозного оперона в клетках Е.coli (штамм BL21 CodonPlus (DE3)-RIPL) высокий уровень синтеза гибридных белков 93ms4-Obe (MW = 35.7 кДа) и 4МА2-Оbe (MW = 37.2 кДа), в виде телец включения. Оба белка обладают биолюминесцентной активностью фотопротеинового домена. Проведен поиск условий очистки и рефолдинга полученных гибридов для обеспечения аффинности домена миниантитела к αФНО человека. Показано, что химерный белок 93ms4-Obe обладает большей аффинностью к αФНО (Кафф = (5 ± 0,5) × 10^-6 М^-1), чем 4MA2-Obe и может быть использован в качестве метки для разработки «open-sаndwich» анализа ФНОα человека.
  
• 
  Был разработан биолюминесцентный анализ для детекции антител к основному белку миелина (ОБМ) в биологических образцах. Показано, что появление протеолитических анти-ОБМ аутоантител, является характерной чертой развития рассеянного склероза. Для выявления этих аутоантител были получены коньюгаты 2'-F-Py РНК аптамера, обладающего высокой аффинностью к анти-ОБМ аутоантителам, (лаборатория химии РНК ИХБФМ СО РАН) и фотопротеина обелина. Показано в модельных экспериментах, что коньюгат может быть использован как метка в твердофазном микроанализе патологических аутоантител. Чувствительность анализа составляет 1,56 нМ анти-ОБМ аутоантител. Полученные коньюгаты не теряют активности при замораживании и при хранении при 8 °С в течение 3-х недель. Разработанный метод анализа анти-ОБМ аутоантител является высокочувствительным, быстрым и простым в исполнении. (Статья отправлена в печать).
  

В результате работы было сконструировано два плазмидных вектора (pET19-OLY-(GGS)₃-Streptag и pET19-OLY-SA-Streptag), которые экспрессировали в клетках Е.coli (штамм BL21 CodonPlus (DE3)-RIPL). Клетки синтезировали гибридный белок, состоящий из фотопротеина обелина с С-конца у которого находится тирозин, линкер ((GGS)₃ или SA) и полипептид, афинный к стрептавидину (StreptagII). Белки были получены в чистом виде и изучены их свойства. Гибриды стабильны (I_{Ca free} /I_Ca=4,5x10^-6 для OLY-(GGS)₃-Streptag и 7,5x10^-6 для OLY-SA-Streptag), обладают биолюминесцентной активностью (38,14% от обелина дикого типа для OLY-(GGS)₃-Streptag и 14,56% для OLY-SA-Streptag) (Статья отправлена в печать).

1. 
   Krasitskaya V.V., Burakova L.P., Frank L.A. Simultaneous determination of SNP genotypes by photoprotein obelin and R. muelleri luciferase // abstract of the 17th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence // Luminescence - 2012. V 27; N 2; p.129-130.
   
2. 
   Krasitskaya V.V., Korneeva S.I., Kudryavtsev A.N., Markova S.V., Stepanyuk G.A., Frank L.A. Ca²⁺-triggered coelenterazine-binding protein from Renilla as an enzyme-dependent label for binding assay // Anal Bioanal Chem, 2011, V.401, P. 2573-2579
   
3. 
   Krasitskaya V.V., Kudryavtsev A.N., Shimomura O., Frank L.A. Obelin mutants as reporters in bioluminescent dual-analyte binding assay // Anal. Methods. 2013, V.5, P. 636-640.
   
4. 
   Kudryavtsev A.N., Krasitskaya V.V., Petunin A.I., Burakov A.Y., Frank L.A. Simultaneous Bioluminescent Immunoassay of Serum Total and IgG-Bound Prolactins // Anal Chem. 2012, V 84(7), P. 3119-3124.
   
5. 
   Красицкая В.В., Буракова Л.П., Пышная И.А., Франк Л.А. Выявление аллельных вариантов гена с помощью биолюминесцентных репортеров // Биоорган. химия, 2012. Т. 38, № 3, с. 342-350.
   
6. 
   Красицкая В.В., Буракова Л.П., Франк Л.А., И.А. Ольховский, Субботина Т.Н. Использование биолюминесцентных репортеров при определении аллельных вариантов полиморфизма фактора V Лейден. Клиническая лабораторная диагностика – 2012. № 9; с. 64-65.
   

Eremeeva E.V., Burakova L.P., Krasitskaya V.V., Kudryavtsev A.N., Shimomura O., Frank L.A. Hydrogen-bond network between C-terminus and Arg from the first α–helix stabilizes a photoprotein molecule // Photochem. Photobiol. Sci.

M.A. Vorobjeva, V.V. Krasitskaya, V.V. Timoshenko, A.A. Fokina, G.A. Nevinsky, A.G. Venyaminova, L.A. Frank. RNA aptamer against autoantibodies associated with multiple sclerosis and bioluminescent detection probe on its basis// Anal. Chem.

м.н.с. ИБФ СО РАН, к.б.н. М.Ю. Медведева

Тема: «Изучение механизмов накопления техногенных радионуклидов и тяжелых металлов погруженными макрофитами реки Енисей»

В 2010-2012 гг. – в период после остановки ядерного реактора на ГХК (апрель 2010 г.) была измерена активность γ-излучающих радионуклидов в биомассе погруженных макрофитов р.Енисей (F.antipyretica, P. lucens, B. kauffmanii, E. сanadensis). Пробы растений отбирались на участке реки от ГХК (с.Атаманово, 5 км от ГХК) до устья р.Ангара (с.Стрелка, 250 км от ГХК). Исследования показали, что вблизи ГХК удельные активности долгоживущих радионуклидов ⁶⁰Сo и ¹³⁷Cs в течение трех лет после остановки реактора оставались на одном уровне, удельные активности ⁶⁵Zn, ⁵⁴Mn, ⁵⁸Co – уменьшились и в 2012 г. стали ниже пределов обнаружения. Удельные активности короткоживущих радионуклидов ²⁴Na, ⁵¹Cr и ²³⁹Np в биомассе макрофитов не регистрировалась уже через 4 месяца после остановки реактора. В биомассе макрофитов, обитающих на значительном удалении от ГХК (с.Стрелка, 250 км от ГХК) удельная активность ⁶⁰Сo, ¹³⁷Cs и ¹⁵²Eu была в 2-4 раза ниже, чем вблизи ГХК. Таким образом, долгоживущие техногенные радионуклиды продолжают регистрироваться в биомассе макрофитов в течение трех лет после остановки ядерного реактора на ГХК как вблизи комбината, так и на значительном расстоянии от него по течению р.Енисей. В пробах макрофитов, собранных выше по течению от ГХК (г.Красноярск и п.Есаулово), из техногенных радионуклидов регистрировался только ¹³⁷Cs с удельной активностью на уровне глобальных выпадений (до 2 Бк/кг).

Оценка миграционной способности радионуклидов в биомассе макрофитов р.Енисей с использованием метода химического фракционирования выявила высокую подвижность ⁴⁰K и ⁵⁴Mn, по сравнению с ¹³⁷Cs, ¹⁵²Eu и ²⁴¹Am. Последние были прочно связаны с биомассой макрофитов и находились, преимущественно, в составе минеральной фракции. Радионуклиды ⁶⁵Zn и ⁶⁰Co по миграционной способности занимали промежуточное положение.

2) Содержание стабильных элементов в макрофитах р.Енисей

В 2010 – 2012 гг. исследовалось содержание стабильных элементов в биомассе макрофитов (F.antipyretica, P. lucens, B. kauffmanii, E. сanadensis) на участке р.Енисей от г.Красноярска (п.Удачный) до ближней зоны влияния ГХК (р-он с.Атаманово и с.Б.Балчуг – 88 и 98 км от ГХК, соответственно). Зарегистрировано повышенное содержание большинства металлов (кроме Zn) в биомассе макрофитов из ближней зоны ГХК, по сравнению с районами выше по течению реки от ГХК. Снижение содержания некоторых тяжелых металлов (Co, Fe, Mn) в биомассе макрофитов из этого района после остановки реактора свидетельствует о том, что тяжелые металлы поступают в реку Енисей не только с промышленно-бытовыми сбросами г.Красноярска, но и с радиоактивными сбросами ГХК.

С помощью метода химического фракционирования было показано, что распределение стабильных элементов (Zn, Co, Sc, Sb, Eu, Cs, Fe) по фракциям биомассы F.antipyretica и P.lucens было аналогично распределению их радиоактивных изотопов. Предположено, что накопление радионуклидов макрофитами происходит по изотопному механизму.

В результате ранжирования стабильных элементов по прочности их связывания с биомассой макрофитов, были получены следующие ряды (в порядке убывания): Fe>Cs>Eu>Sc>Sb>Co>Ca>Sr>Zn – для F.antipyretica; Cs >Fe >Eu >Sc >Sb >Co > Sr=Ca >Zn – для P.lucens.

В исследуемый период после остановки реакторного производства на ГХК, два вида погруженных макрофитов р.Енисей - F.antipyretica и E. сanadensis – характеризовались высоким накоплением как техногенных радионуклидов (⁶⁰Сo, ¹³⁷Cs и ¹⁵²Eu), так и большинства исследуемых тяжелых металлов. Поскольку элодея канадская (E. сanadensis) относится к числу массовых видов, вегетирующих на р.Енисей и также является удобным объектом для цитогенетических исследований, мы рекомендуем этот вид в качестве вида-биоиндикатора техногенного загрязнения р.Енисей.

Для оценки степени негативного воздействия на биоту в исследуемых районах реки Енисей, была определена частота выхода цитогенетических нарушений в апикальной корневой меристеме элодеи из 10 районов (от г.Красноярска до 330 км вниз по течению р.Енисей). Отмечено возрастание частоты и спектра хромосомных аберраций в меристеме элодеи, начиная от района вблизи сбросов ГХК и до 250 км от ГХК вниз по течению реки. Обнаружена положительная корреляция между частотой встречаемости аберрантных ана-телофаз в меристеме элодеи и суммой техногенных радионуклидов в донных отложениях исследуемого района (r²=0.92, p˂0.05), а также с содержанием в них ¹³⁷Cs (r²=0.96, p˂0.05).

1. 
   Болсуновский А.Я., Медведева М.Ю., Александрова Ю.В. Интенсивность накопления радионуклидов в биомассе водных растений реки Енисей //Известия Самарского научного центра РАН. Т.13. №1 (4). 2011. Самара. С.776-779.
   
2. 
   Зотина Т.А., Трофимова Е.А., Медведева М.Ю., Болсуновский А.Я. Биотестирование донных отложений р. Енисей с использованием водного растения Elodea сanadensis// Известия Самарского научного центра РАН. 2013. Т.15. №3 (1). с.554 - 559.
   
3. 
   Медведева М.Ю., Болсуновский А.Я., Зотина Т.А. Цитогенетические нарушения у водного растения Elodea canadensis в зоне техногенного загрязнения р.Енисей // Сибирский экологический журнал, 2013 – отправлено в печать.
   
4. 
   Zotina T., Trofimova E., Medvedeva M., Bolsunovsky A. Use of submersed macrophytes as indicators of radioactive pollution of the Yenisei River: biomonitoring and toxicity tests. 20th International Conference on Environmental Indicators (ICEI 2013). 16-19 Sept 2013, Trier, Germany. P.29.
   
5. 
   Bolsunovsky A., Medvedeva M. Comparative evaluation of the bioavailability of uranium and artificial radionuclides in the ecosystem of the Yenisei River basin: The First Russian-Nordic Symposium on Radiochemistry (RNSR-2013). 21-24 October 2013, Moskow, Russia. P.114.
   
6. 
   Bolsunovsky A., Medvedeva M. Aquatic plants as bioindicators of radioactive contamination of the Yenisei River: The Second International Conference on Environmental Pollution, Restoration and Management, 4-8 March 2013, Hanoi, Vietnam. P.93-94.
   

Определены оптимальные условия роста светящихся грибов N. nambi и выявлены стимуляторы и ингибиторы свечения; получен и изучен биотинилированный in vivo Са²⁺-регулируемый фотопротеин обелин; разработан многокомпонентный реагент «Энзимолюм», основанный на совместно иммобилизованных в крахмальный гель биферментной системе светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и ее субстратах (миристиновый альдегид и НАДН). Разработаны способы увеличения чувствительности реагента к действию токсических веществ, подобраны условия проведения анализа, позволяющие определять содержание токсических веществ с максимальной эффективностью, соответствующей или ниже их уровня ПДК; установлены химические структуры двух аналогов люциферина светящихся червей F. heliota и брутто формула люциферина.

Проект ориентирован на получение новых фундаментальных знаний, необходимых для конструирования тканеинженерных систем на основе разрушаемых биополимеров и несущих клетки, необходимых для оптимизации условий для восстановления повреждений кожных покровов. По результатам предыдущего этапа для конструирования тканеинженерных систем использован метод электростатического формования растворов разрушаемых сополимеров, образованных мономерами бета- и гамма гидрокиспроизводными масляной кислоты (П(3ГБ/4ГБ). Для повышения адгезионнных свойств на поверхность матриксов были нанесены белковые покрытия (фибрин и коллаген 1 типа), далее матриксы были засеяны предкультивированными аллогенными фибробластами и кератиноцитами. Полученные гибридные тканеинженрные системы использованы для закрытия модельных дефектов кожных покровов у экспериментальных животных. Планиметрические и гистологические исследования показали эффективность применения разработанных тканеинженерных систем для восстановления раневых дефектов.