Теоретическое обоснование и практическое использование ДНК генотипирования в селекции свиней 06. 02. 07 разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

На правах рукописи

06.02.07 – разведение, селекция и генетика

сельскохозяйственных животных
Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

г. Ставрополь – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Донской государственный аграрный университет»
Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Максимов Геннадий Васильевич
Официальные оппоненты:

Ковалюк Наталья Викторовна – доктор биологических наук, ГНУ Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии, заведующая лабораторией биотехнологии
Семенов Владимир Владимирович – доктор сельскохозяйственных наук, профессор, ГНУ Ставропольский научно-исследовательский институт животноводства и кормопроизводства Россельхозакадемии, заведующий лабораторией свиноводства
Скворцова Людмила Николаевна – доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»,

профессор кафедры физиологии и кормления сельскохозяйственных животных

тел/факс (8652) 71-70-33

E-mail: dissovetsniizhk@yandex.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского научно-исследовательского института животноводства и кормопроизводства

Автореферат разослан « » января 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Кононова Лидия Валентиновна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.Актуальность исследований. Эффективность селекционно-племенной работы в животноводстве во многом зависит от точности оценки племенной ценности животных. Интеграция молекулярной генетики в прикладную науку, начиная с 80-х годов ХХ века, сделала возможным оценку генетического потенциала животных не только на основании фенотипа, но и на уровне ДНК (Л.Н. Эрнст, Н.А. Зиновьева, 2008).

В настоящее время в селекции свиней широко используют ДНК-маркеры их продуктивности. В отличие от методов традиционной селекции использование ДНК – маркеров позволяет проводить оценку животных непосредственно на уровне генотипа, и не требует сложных математических методов оценки генетического потенциала, направленных на вычленение из проявления признака его генетической составляющей. Использование отбора по генетическим маркерам выводит селекцию на качественно новый уровень, позволяя непосредственно оценивать генотипы животных (E. W. Brascamp, J. A. Arendonk, 1993; Н.В. Ковалюк, 2002; Е. Черекаева, С. Грикшас, 2003; В. Семенов, И. Рачков, 2007; Г.В.Максимов с соавт., 2010; Н.А. Зиновьева с соавт., 2011).

При использовании ДНК- маркеров селекционные решения в работе с животными могут приниматься в раннем возрасте, что сокращает затраты на проведение оценки последних.

В то же время, на фоне использования ДНК - генотипирования и традиционных методов селекции, не потеряло своей актуальности и межпородное скрещивание, как метод повышения продуктивности свиней. Современная технология производства продуктов свиноводства на промышленной основе требует разработки многих вопросов, связанных не только с кормлением и содержанием животных в новых условиях, но и с разведением (В.Д.Кабанов, 2006; И.М. Дунин, В.В. Гарай, 2009; В.И. Водянников с соавт., 2012).

Многочисленные примеры показывают, что необходимым условием получения высокопродуктивных помесей является не только наличие гетерозиготности и сверхдоминирования, но и, в первую очередь, качество генотипов сочетающихся родительских форм. Гетерозис, как правило, увеличивается при скрещивании генетически отдаленных пород и зависит от того, насколько родительские породы отселекционированы по важнейшим хозяйственным и биологическим признакам (В. Семенов, О. Плужникова, 2009, Г.В. Максимов с соавт., 2010).

Гетерозис в животноводстве по своей биологической природе – явление сложное и до настоящего времени ряд научно-теоретических и практических вопросов его проявления до конца не решен. Не случайно, что последние 50 лет изучению промышленного скрещивания в свиноводстве придается очень большое значение. Опубликовано довольно много работ, в какой-то мере раскрывающих зоотехническую сущность гетерозиса и позволяющих эффективно использовать его свиноводстве (Ю.И. Шмаков с соавт., 2009; А.А. Фридчер с соавт., 2010; А.А. Фридчер, 2010; В.В. Шкаленко, 2011; А.А. Заболотная с соавт. 2012).

Помимо этого большое значение приобретают вопросы оценки состояния естественной резистентности свиней и путей ее повышения, в том числе, с помощью неспецифических стимулирующих препаратов.

Для целенаправленной мобилизации внутренних резервов организма и повышения продуктивности, необходимо изучить эффективность и направленность действия различных биостимуляторов на свиней различных генотипов и половозрастных групп. В связи с этим весьма актуальной является оценка их влияния на состояние неспецифической резистентности, воспроизводительную функцию маток, интенсивность роста и сохранность молодняка, откормочные и мясные качества и разработка на этой основе интенсивных приёмов ведения свиноводства.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГБОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет» (№ гос. регистрации 01.960.009170; 0120.0604291) по межведомственной программе фундаментальных и приоритетных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ на 2006 – 2010 и 2011-2015 гг.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью работы явилось изучение влияния генов RYR-1, ESR, Н-FABР, промышленного скрещивания и иммуномодуляторов на продуктивность, интерьер, естественную резистентность и стрессоустойчивость свиней.

Для реализации намеченной цели решались следующие задачи:

- проведение анализа банка ДНК чистопородных и помесных свиней, разводимых в Ростовской области и Краснодарском крае, с анализом генотипов по генам RYR-1, ESR;

- оценка развития и воспроизводительных качеств хряков – производителей, и свиноматок различных генотипов по генам RYR-1, ESR и Н-FABР;

- сравнительная характеристика интерьера и естественной резистентности холостых, супоросных, подсосных свиноматок и поросят разных генотипов по гену RYR-1 и ESR;

- определение откормочных, мясных качеств, интерьерных особенностей и стрессустойчивости свиней разных генотипов по генам RYR-1, ESR и Н-FABР;

- изучение гистологических особенностей мышечной ткани подсвинков разных генотипов по гену RYR-1;

- влияние полиморфизма гена Н- FABР на рост и развитие хряков породы ландрас и воспроизводительные качества свиноматок КБ×Л;

- оценка откормочных и мясных качеств молодняка при двух- и трех породном промышленном скрещивании;

- определение действия иммуностимуляторов на рост и развитие молодняка;

- расчет экономической эффективности использования результатов исследования.

1.3.Научная новизна исследований. Разработана научная концепция использования ДНК- генотипирования по генам RYR-1, ESR и H-FABР в селекции свиней на повышение откормочных, мясных качеств, естественной резистентности и стрессустойчивости.

Впервые оценены рост, развитие, воспроизводительные, откормочные, мясные качества, естественная резистентность и стрессустойчивость хряков – производителей пород ландрас, крупной белой и маток КБ×Л; (КБ×Л) ×Д; СМ-1×Л; (СМ-1×Л) ×Д разных генотипов по генам RYR-1, ESR и H-FABР. Выявлены частоты указанных мутантных аллелей и взаимосвязь интерьерных тестов с продуктивностью свиноматок.

RYR-1. Определена частота встречаемости трех типов полиморфизма гена рецептора эстрогена у свиноматок (СТ СМ-1×Л) × Д и СТ СМ-1×Л, КБ и КБ×Л. Для свиноматок (СТ СМ-1×Л) × Д и СТ СМ-1×Л более предпочтительным оказался генотип - АВ, а для КБ и КБ×Л -ВВ. Изучено комплексное влияние генетических маркеров на воспроизводительные качества маток. У СТ СМ-1×Л лучшими были матки NNАА- и NNАВ- генотипов; у СМ-1, NNАВ -генотипа; а у СТ СМ-1×Л×Д NNАА- генотипа. Проведены гистологические исследования длиннейшей мышцы спины свиней Л, СТ СМ-1×ДМ-1, СТ СМ-1, КБ разных генотипов по гену RYR-1.

Применение иммуностимуляторов витстим и гамавит (безопасных для здоровья человека и животных), повысило резистентность и продуктивность молодняка при выращивании и откорме.

Результаты работы внедрены в ЗАО «Батайское» Азовского района Ростовской области, ООО «Полесье» Тихорецкого района, ООО «АПЗ» «Индустриальный» Тимашевского района Краснодарского края и учебном процессе Дон ГАУ на факультетах технологии с.-х. производства и ветеринарной медицины (специальности: 110401 – зоотехния, 110305 – «ТППСХП», 160001 – диагностика болезней и терапия животных, 160004 – ветеринарная фармакология и токсикология и 030004 - биохимия) Дон ГАУ.

- на заседаниях кафедр разведения, селекции и генетики с.- х. животных; внутренних незаразных болезней, патофизиологии, клинической диагностики и фармакологии Донского ГАУ (2000 - 2012);

- на международных научно – практических (производственных) конференциях Кубанского, Волгоградского, Саратовского, Донского государственных аграрных университетов, Белгородской государственной сельскохозяйственной академии (2006-2012);

- на ежегодных научно-практических конференциях Донского ГАУ (2000 -2012);

- на международных и республиканских научно – производственных конференциях межвузовского координационного совета «Свинина» (2004- 2012).

1.6. Основные положения, выносимые на защиту:

- влияние разных генотипов по генам RYR-1, ESR и Н-FABР на воспроизводительные качества хряков – производителей, свиноматок и жизнеспособность молодняка;

- совместное использование генетических маркеров стрессустойчивости и многоплодия для достижения более высоких воспроизводительных качеств животных;

- сравнительная характеристика интерьерных показателей и естественной резистентности холостых, супоросных, подсосных свиноматок и поросят разных генотипов по генам RYR-1, ESR и Н-FABР;

- гистологические особенности строения мышечной ткани подсвинков разных генотипов по гену RYR-1;

- влияние полиморфизма гена Н- FABР на рост, развитие, воспроизводительные качества хряков – производителей породы ландрас и свиноматок КБ×Л;

- влияние двух - и трехпородного промышленного скрещивания на откормочные и мясные качества подсвинков;

- использование иммуностимуляторов гамавита и витстима молодняку для повышения естественной резистентности и откормочных качеств молодняка;

- экономическая эффективность, полученная в результате исследований.

1.7. Публикация результатов исследования. По результатам исследований опубликовано 42 печатных работ.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 333 страницах компьютерного текста, содержит 73 таблиц и 13 рисунков, включает в себя общую характеристику работы, обзор литературы, материал, методику и результаты исследований, выводы и предложения производству, список использованной литературы (насчитывающий 493 источников, в т. ч 115 зарубежных).
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы и методы исследования

Исследования выполнены (рис.1) на свиньях пород СТ СМ -1, КБ, Л, Д, ДМ-1, и помесях КБ×Л, (КБ×Л)×Д, КЧ×Д, КБ × ДМ-1, (КБ× Й) × Pic – 337, [(КБ× Й) ×Л] × Pic – 337, [(КБ×Й) ×Л] × Д, СТ СМ-1× Л, (СТ СМ-1× Л) × Д, Й× Pic – 337, (Й× Л) × Pic – 337, (Й× Л) ×Д в период с 2000 по 2012 годы на свинофермах ООО «Полесье» Тихорецкого района, АПЗ «Индустриальный» Тимашёвского района, ОАО «Медведовский мясокомбинат» Краснодарского края, ЗАО «Батайское» Азовского района, племенной станции Тацинского района, СПК «Рассвет» Тарасовского района, учхоза «Донское» Октябрьского (с) района Ростовской области.

В начале исследований по ген-молекулярным тестам провели анализ банка (генотипов) свиной ДНК чистопородных и помесных свиней, разводимых в Ростовской области и Краснодарском крае.

В 2008 - 2012 гг. провели исследования по ДНК- генотипированию и определению влияния гена RYR-1:

- на воспроизводительные качества свиноматок первого и второго опоросов СТ СМ-1 ( n = 23 и 18) , СТ СМ-1×Л (n = 25 и 19), (СТ СМ-1×Л) ×Д (n = 20 и 18);

-на воспроизводительную способность хряков-производителей СТ СМ-1 генотипов NN и Nn; КБ – NN, Д - NN – генотипа;

- спермопродукцию хряков СТ СМ-1 (n=8), ДМ-1 (n=6), КБ (n=12), Д (n=4) генотипа NN и у СТ СМ-1 (n=2) Nn- генотипа;

- на гистостроение мышечной ткани длиннейшей мышцы спины свиней КБ, СТ СМ-1, СМ-1×ДМ-1, Л разных генотипов по гену RYR-1;

- на биохимические показатели крови хряков породы ландрас (n=20), супоросных и подсосных свиноматок СТ СМ-1×Л (n=20) и подсвинков ½ СМ-1 + ½ Л в 4-х (n=42) и 6- мес. (n=39);

- на естественную резистентность хряков КБ (n=20), дюрок (n=15), ландрас (n=18), подсосных свиноматок КБ (n=15), КБ×Л (n=18).

Оценивали влияние генотипа по гену RYR-1 на воспроизводительные качества маток по общепринятым методам, на откормочные и мясные качества подсвинков, физико-химические свойства и химический состав мяса. Качество спермопродукции оценивали согласно действующей инструк­ции по искусственному осеменению свиней (МСХ СССР, 1978); а воспроизводительную способность по многоплодию покрытых маток, массе 1поросенка в 2-х мес. возрасте. При определении откормочных и мясных качеств подсвинков руководствовались методическими рекомендациями Дон ГАУ (В.И. Степанов с соавт., 1992).

Для итоговой оценки продуктивности ­маток - рассчитывали комплексный показатель воспроизводительных качеств свиноматок (КПВК) по В.А. Коваленко, И.Н. Журавлеву (1981) по формуле: КПВК = l,lX₁ + 0,ЗХ₂ + 3,ЗХ₃ + 0,35X₄.

Влияние ESR на воспроизводительные качества свиней изучили соответственно на 32, 24 и 43 подсосных свиноматках (СТ СМ-1×Л) × Д и СТ СМ-1×Л, КБ и 10 хряках КБ. Определили естественную резистентность холостых, супоросных и подсосных свиноматок (на 4-й день после опороса) КБ (n=30) и 1/2КБ+1/2Л (n = 40).

Определили влияние полиморфизма гена Н- FABР на рост и развитие хряков породы ландрас (43гол) и воспроизводительные качества помесных свиноматок КБ×Л.

Провели исследования по изучению влияния двух- и трех- породного промышленного скрещивания на воспроизводительные качества свиноматок КБ×Л, (КБ×Л)×Д, КЧ × Д; КБ × ДМ-1; КБ × Д; (КБ×Й) × Pic 337; [(КБ×Й) × Л] × Pic337; [(КБ×Й) × Л] × Д.

Изучили откормочные и мясные качества свиней мясных типов при их откорме до разных весовых кондиций (100, 120кг), физико-химические свойства и химический состав мяса.

В условиях ОАО «Медведовский мясокомбинат» провели убой свиней - Й × Pic 337; (Й×Л) × Pic 337; (Й × Л) × Д (по 10гол. в каждой группе), определяли физико-химические свойства мяса, выход сырья для колбасного производства и получения деликатесной продукции при разделке туш.

У подопытных свиней для выявления основных пороков (РSE - DFD -) у свиней определено качество мяса у подсвинков КБ (n=38), СТ СМ-1 (n=32), ДМ -1 (n=28), 1/2СТ СМ-1+1/2Л (n=40), 1/2КБ + 1/2Л (n=44).

Проведен сравнительный анализ естественной резистентности хряков производителей КБ (n=17) , Л (n=18), Д (n=15); свиноматок КБ при сочетании с хряками КБ, Л, Д и их потомства (по 4 подсвинка с гнезда).

Определили влияние иммуностимуляторов гамавита и витстима на рост, развитие и естественную резистентность поросят. Для этого по принципу аналогов было сформировано три группы животных: две опытных и контрольная - по 20 голов в каждой. Подопытных животных кормили по нормам ВИЖ, в соответствии с рационом принятым в хозяйстве.

Препараты гамавит вводили 1опытной группе у основания ушной раковины в 7-дн. возрасте, три инъекции через три дня по 0,5мл на голову, а витстим 2 опытной группе - по 2,5мл на голову трехкратно с интервалом три дня начиная с 7-дн. возраста. Поросятам контрольной группы вводили физиологический раствор в эти сроки по 1,0мл.

Взвешивание подопытных поросят проводили при рождении и на 21, 60, 120, 150, 180 сутки жизни.

ДНК- генотипирование свиней проводили с помощью полимеразной цепной реакции по методике К. Мюллиса (1985), усовершенствованной R. Boom et al. (1990) и модифицированной Н.В. Ковалюк (2002).

Для оценки мясных качеств подсвинков проводили контрольный убой 10 животных каждой группы по достижению ими живой массы 100, 120кг.

Убой животных проводили по общепринятым методикам в убойных цехах хозяйств и ОАО «Медведовский мясокомбинат». После 24-часового остывания в холодильной камере при температуре +2…+4⁰С учитывали убойную массу, толщину шпика, массу задней трети полутуши, площадь «мышечного глазка». Для изучения физико-химических свойств, химического состава мяса и гистологического исследования брали образцы длиннейшей мышцы спины (400 г) на участке между 9-12 грудными позвонками. Изучали содержание мышечной и жировой ткани в длиннейшей мышце спины свиней разных генотипов, соотношение между межпучковым и внутрипучковым жиром, диаметр и соотношение (%) мелких, средних и крупных мышечных волокон в мышечном пучке по Г.А. Меркулову (1969).

Химический анализ мышечной и жировой ткани проводили по обще­принятой методике (В.А. Коваленко, З.Д. Гильман, А.С. Орлова и др., 1987) зооанализа.

В опыте по оценке качества свинины анализы по определению в мышечной ткани влаги, жира и белка проводили в соответствии с ГОСТ 9793-74 «Продукты мясные. Методы определения влаги», ГОСТ 15042-86 «Мясо и мясные продукты. Методы определения жира» и ГОСТ 25011-81 «Мясо и мясные продукты. Методы определения белка»; аминного азота - методом формольного титрования, молочной кислоты - методом Э. Фридемана (А.И. Белозерский, Н.И. Проскуряков, 1951).

Содержание оксипролина в мясе определяли по методу Неймана - Логана в модификации Вербицкого и Детерейджа (1953), содержание триптофана - методом, предложенным С. Е. Gyrehem, E.P.Smith, S.W. Hier, D.L.Klein (1947) с применением методики щелочного гидролиза по E.Werbicki, F.E. Deatherage(1954).

Микрометрические исследования гистосрезов выполняли по методике, разработанной в Донском СХИ (1967).

Кровь для исследований брали утром, в одно и то же время, до кормления. У поросят до 4- мес. возраста кровь брали из хвостовой вены, с 4- мес. возраста - из ушной вены

Гематологические исследования: количество эритроцитов и гемоглобина определяли на фотоэлектрокалориметре, подсчет лейкоцитов в камере Горяева, лейкограмму выводили по П.З. Клечикову (1967); А.А. Кудрявцеву с соавт. (1969).

Биохимические исследования: активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови определяли Клини Тест-ЩФ АМП 120 по В.В. Меньшикову (1999); содержание глюкозы орто – толуидиновм методом (кат.№ В-11061) Клини Тест – ГОТ; содержание креатинина по реакции Яффе с депротеинизацией по С.Г. Марданлы и Р.С. Тишениной (2007); уровень мочевины –био-тестом по C.L Crocкer (1967), P. Breinek, J. Bouda (1970); содержания общего белка и белковых фракций, активность аланин – аминотрансферазы (АлАТ) и аспартат – аминотрансферазы (АсАТ) в сыворотке крови проводилось с использованием стандартных методик (Ф. З. Андросов, И. Я. Беляев, Р. Т. Клочко, 1981; И. П. Кондрахин и др., 1985).

Уровень кортизола определяли по инструкции по применению набора реагентов для иммуноферментного определения кортизола в сыворотке крови человека (стероидИФА – кортизол – 01 ( протокол №8 от 18 сентября 2000г); содержание АКТГ – методом твердофазного хемилюминесцентного иммуно – анализа на микрочастицах полного автомата Architet : 2000; количество адреналина в плазме – методом высокоэффективной жидкофазной хроматографии.

Исследование показателей естественной резистентности свиней проводили в лаборатории по изучению биологических проблем животноводства (в Дон ГАУ).

Мясная продуктивность

Качество мяса

Гистостроение мышечной ткани