ЗАНЯТИЕ 4. Люминесцентная микроскопия. Метод флуорохромирования

ЗАНЯТИЕ 4. Люминесцентная микроскопия. Метод флуорохромирования

Люминесценция (флуоресценция) — это свечение веществ под воздействием различных видов энергии, возникающее в ре­зультате преобразования энергии, поглощенной данным вещест­вом. Молекулы, поглощающие кванты внешней энергии, прихо­дят в возбужденное состояние, вследствие чего их электроны переходят на орбиты более высоких энергетических уровней. При возвращении на прежние орбиты они отдают избыток энергии в виде квантов света — фотонов. Непрерывный поток фотонов, из­лучаемых возбужденным веществом, и есть люминесценция. Лю­минесцентное свечение подчиняется правилу Стокса, согласно ко­торому свет флуоресценции имеет большую длину волны, чем свет возбуждения, примерно на 50...120 нм. Это позволяет отфильтро­вывать сравнительно слабую флуоресценцию от более ярких воз­буждающих лучей. В современных люминесцентных микроскопах используют чаще всего сине-фиолетовые лучи, получаемые с помощью специальных фильтров. После возбуждения люминесцен­ции они поглощаются желтым светофильтром, который укрепля­ется на окуляре. В результате создается темный фон в поле зрения микроскопа.

В настоящее время в лабораториях используют люминес­центные микроскопы МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3, МЛ-4, микроскопы серии "Люмам", импортные приборы. В любом из них можно выделить три основные части: собственно микроскоп, осветительное устройство и источ­ник света. Осветительное устройство состоит из кварцево­го коллектора, полевой и апертурной диафрагм, регулирующих поток света и камеры со светофильтрами, последние применят для выделения из светового потока сине-фиолетовых лучей. Виру­сологические препараты изучают в падающих сине-фиолетовых лучах. Они проходят через окуляр и падают на препарат. Для их выделения используют следующие светофильтры: БС-8 (бесцвет­ное стекло, задерживающее ультрафиолетовые лучи), СЗС-7 или СЗС-14 (сине-зеленое стекло, пропускающее синие лучи), ФС-1 (фиолетовое стекло, пропускающее фиолетовые лучи) и ЖС-18 (запирающий светофильтр, отсекающий лучи возбуждения и про­пускающий лучи, исходящие из препарата).

Источником света в люминесцентных микроскопах служат ртутно-кварцевые лампы, обладающие большой поверхностной яркостью.

На пути светового потока помещают кювету с дистил­лированной водой для защиты препарата от тепловых (инфра­красных) лучей. Но в некоторых случаях применяют и проходя­щее через зеркало микроскопа освещение объектов. Кроме того, предусмотрена возможность темнопольного освещения объекта и фотографирования.

Микроскоп устанавливают в затемненной части комнаты на прочном столе. Следует исключить вибрацию, которая создает помехи при микрофотографировании. В помещении должна быть хорошая вентиляция, устраняющая вредные газы от источника света.

Подготовка микроскопа к работе сводится к следующему. При закрытой шторке кварцевого коллектора и положении рыча­га пульта управления острием к точке (красной или черной) на­жатием кнопки пускового дросселя зажигают лампу. Лампа дос­тигает полной силы света через 5...10 мин после включения при силе тока 4...5 А. Повторное включение лампы возможно только после ее охлаждения. Чтобы привести микроскоп в рабочее со­стояние, рукой выдвигают до отказа правую рукоятку светоделительного зеркала и переключатель светоделительной пластинки с кольцевым зеркалом. Револьверный диск со светофильтрами ус­танавливают в положении 1 или 2. На столике микроскопа уста­навливают препарат, закрепляя его зажимами препаратоводителя. На препарат наносят каплю нефлуоресцирующего иммерсионцого масла или его заменителей (диметилфталат и др.). Под контролем глаза макровинтом осторожно опускают тубус до соприкосновения объектива с иммерсионным маслом. При этом препарат вспыхива­ет сине-фиолетовым цветом. Затем отыскивают изображение, ус­танавливая резкость микровинтом.

После окончания работы, поднимают тубус, салфеткой вы­тирают масло с объектива, револьвер переводят на малое увеличе­ние, отключают лампу, накрывают микроскоп чехлом.

По мере износа ртутно-кварцевой лампы или при необходи­мости лучшего свечения препаратов следует употреблять менее плотные фильтры названных спецификаций, имеющиеся в набо­ре. Фильтры должны быть чистые, хорошо протертые. Дистилли­рованную воду в кювете надо менять два раза в месяц. При каж­дой смене воды кювету следует промыть. Стекла кюветы должны быть прозрачными, помутневшие заменяют.

В вирусологической практике люминесцентную микроско­пию используют в двух основных методах: флуорохромировании и методе флуоресцирующих антител.

Предложено большое количество соединений для флуоро­хромирования биологических объектов. Наиболее широко приме­няется акридиновая группа (акридин оранжевый, акридин жел­тый) и тиазоловая (примулин) группа. Флуорохромы чаще всего применяют в водных растворах (дистиллированная вода, физиоло­гический раствор) в очень слабых концентрациях, от 1:100 до 1:1 млн. Можно прибавлять к растворам до 3% фенола. Опти­мальную концентрацию флуорохрома подбирают индивидуально.

Промышленность в настоящее время выпускает специаль­ные наборы флуорохромов. Они сохраняются в течение многих месяцев без изменения при хранении их в темных флаконах и прохладном месте.

Наибольший интерес представляет акридин оранжевый, ко­торый вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеино­вых кислот. При этом ДНК ярко флуоресцирует желто-зеленым цветом, а РНК — рубиново-красным.

Для его приготовления в смеси физиологического раствора и фосфатного буфера (рН 7,2...7,4) в соотношении 7:3 делают слабый раствор флуоро­хрома (1:10000-1:20000). Фосфатный буфер состоит из двух рас­творов:

1) 1/15 М раствор двузамещеннного фосфата натрия Nа₂НР0₄ • 2Н₂О (1,187 г на 100 мл дистиллированной воды) или 1/15 М раствор Nа₂НР0₄ (0,947 г на 100 мл дистиллированной воды); 2) 1/15 М раствор однозамещенного фосфата калия КН₂Р0₄ (0,908 г на 100 мл дистиллированной воды). Для получе­ния рН 7,2 растворы 1 и 2 смешивают в соотношении 7,2:2,8. За­тем готовят маточный раствор акридина оранжевого 1:1000 (0,01 г его растворяют в 10 мл смеси, состоящей из 7 мл физраствора и 3 мл фосфатного буфера с рН 7,2). На холоде этот раствор может храниться в пределах трех месяцев. Чтобы из маточного раствора приготовить рабочий — 1:10000, к 1 мл его добавляют 9 мл растворителя (физраствор на фосфатном буфере).

Препараты для метода флуорохромирования готовят двумя способами: 1) на свежий препарат-отпечаток из органов, соскобов со слизистых оболочек или суспензии инфицированных клеток наносят 1-2 капли рабочего раствора акридина оранжевого 1:10000, накрывают покровным стеклом. Приготовленный таким образом свежий (в течение 10...20 мин после приготовления) пре­парат рассматривают в люминесцентном микроскопе; 2) препара­ты-отпечатки, полученные из патологического материала или ин­фицированные культуры клеток на покровных стеклах фиксируют 96° этиловым спиртом в течение 15...30 мин, промы­вают раствором Хенкса, наносят на препарат 1-2 капли раствора акридина оранжевого (1:10000), через 5...10 мин раствор флуоро­хрома сливают, препарат промывают и исследуют под микроско­пом.

В результате окрашивания ДНК, содержащаяся в ядрах клеток, дает изумрудно-зеленое свечение, а РНК, находящаяся в цитоплазме, светится красным или оранжевым цветем. В препара­тах ДНК-содержащихся вирусов, например, аденовируса, вирусный материал в ядре клеток в виде гранул различной величины светит­ся зеленым цветом. При наличии в препарате РНК-содержащего вируса, например, вируса гриппа, вирусный материал обнаружива­ется в виде ярко-красных гранул в цитоплазме клеток.

Чтобы различить происхождение ДНК или РНК (клеточная или вирусная) применяют обработку препаратов 0,5%-ным рас­твором ДНК-азы или РНК-азы в течение 5.-.10 мин или облучение ультрафиолетовыми лучами. При этом свечение клеточных РНК или ДНК сразу исчезает, а вирусные нуклеиновые кислоты про­должают светиться еще 20.-30 мин. Это служит доказательством специфичности вирусных нуклеиновых кислот.

Метод флуорохромирования не сложен, но он не дает возможности идентифицировать возбудителей заболеваний.