"Устройство и принцип работы масс-спектрометра"
жүктеу/скачать 63.14 Kb.
|
1 2
реф нано- Бұл бет үшін навигация:
- Библиографический список
| Детекторы. Самым распространенным детектором является электронный умножитель, который передает кинетическую энергию падающих ионов на поверхность, где она, в свою очередь, генерирует вторичные электроны.
Кроме того, существуют фарадеевские детекторы, представляющие собой высокоомные сопротивления. Поток ионов, попадая на такой детектор, создает разность потенциалов, величина которой пропорциональна силе ионного тока. Решающее значение для выбора оптимального масс-спектрометрического метода анализа конкретного объекта имеет метод ионизации. В зависимости от источника ионизацииразличают газофазные, десорбционные и электроспрейные методы ионизации. В газофазных методах проба предварительно испаряется, что позволяет изучать термостабильные низкомолекулярные соединения, которые переходят в газообразное стостояние при температуре не выше 500 С. К газофазным относятся ионизация электронным ударом (EI) и химическая ионизация (CI). Электронная ионизация (EI) – «жесткий» способ ионизации, поэтому дает большое число фрагментарных ионов. Образец для EI должен поступать в газообразной форме, что осуществляется его нагреванием посредством термической десорбции. Необходимая термическая десорбция образца для осуществления ионизации электронным ударом может привести к его температурному разложению до того, как произойдет испарение. Обычно данный вариант ионизации используется в сочетании с газовой хроматографией и служит для анализа сложных смесей, в основном легколетучих, термостабильных, низкомолекулярных (до 1000 Da), липофильных компонентов, в первую очередь эфирных масел лекарственных растений, а также некоторых лекарственных препаратов терпеноидной структуры. Химическая ионизация (CI) – более «мягкий» способ ионизации, дает меньшую фрагментацию по сравнению с EI и используется для увеличения доли молекулярного иона. Однако, аналогично EI, образцы должны быть термически стабильными, так как испарение в CI-устройстве осуществляется при помощи нагревания. Процесс химической ионизации инициируется газом-реагентом, таким как метан, изобутан или аммиак, который ионизируется электронным ударом. Вплоть до 1980-х годов масс-спектрометрия нечасто попадала в поле зрения химиков-органиков, поскольку электронная ионизация (EI) оставалась единственным способом для анализа масс, и ограничивалась определением малых, термостабильных, легколетучих молекул. Высокомолекулярные органические соединения, биоорганические объекты, термолабильные органические и металлоорганические вещества вследствие ограниченной летучести или полного ее отсутствия данным методом не определялись, поскольку их невозможно было перевести в газовую фазу в неповрежденном состоянии. Радикальные изменения в масс-спектрометрии произошли в конце 1970-х годов, в связи с открытием мягких десорбционных методов. Десорбционные методы ионизации в масс-спектрометрии — группа методов, для которых процессы десорбции твердого анализируемого вещества и его ионизация практически неотделимы во времени. Принцип десорбции сводится к тому, что при мгновенном нагревании образца до высоких температур константа скорости его испарения будет превышать константу скорости разложения, что приводит к испарению вещества с любым молекулярным весом и химической структурой без его разложения. Десорбционные методы можно разделить на две группы: десорбция, индуцированная бомбардировкой высокоэнергетическими частицами, или воздействием лазерным излучением. Первоначально R. D. Macfarlane с сотрудниками был разработан метод плазменной десорбции (plasma desorption – PD/MS). Было обнаружено, что при радиоактивном распаде нуклида калифорния Cf 252 выделяется энергия, которая переходит в кинетическую энергию осколочных частиц. Пучок частиц распада проходит через тонкую металлическую фольгу, на поверхности которой расположен анализируемый образец, вызывая быстрый нагрев и десорбцию образца. Еще один появившийся метод – десорбционная химическая ионизация (DCI/MS) – обеспечивал быстрый нагрев аналита, преодолевая проблемы термического разложения, присущие обычной химической ионизации. Позднее A. Benninghoven с сотрудниками использовали для ионизации бомбардировку ионами серебра (Ar+), что послужило началом развития метода ионизации вторичными ионами (Secondary Ion – SI). В начале 1980-х годов в работах M. Barber с сотрудниками был представлен метод бомбардировки быстрыми атомами инертного газа (Fast Atom Bombardment – FAB). В методе FAB пучок быстрых высокоэнергетичных нейтральных атомов (например, Ar) формируется за счет предварительно образованных в газоразрядном устройстве ионов (Ar+). При этом вся кинетическая энергия определяется ускоряющим напряжением, прикладываемым к промежуточным образованным ионам. В это же время D. J. Surman и J. C. Vickerman выдвинули идею использования жидкой матрицы для поглощения большей части кинетической энергии ионизирую- щих частиц [10]. Ионы анализируемого вещества генерируются из капли состоящего из растворителя (матрица) и растворенного в ней исследуемого вещества. [11]. В качестве матрицы в методах FAB и SI были использованы глицерин, тиоглицерин и м-нитробензиловый спирт. Создание методов PD, FAB и SI означало принципиальный прорыв в технике ионизации термически нестойких соединений без их деструкции. Дальнейшее развитие представлений о способах ионизации привело к вытеснению этих методов технически более удобным, основанным на ионизации вещества импульсным лазерным излучением, получившим название лазерно-десорбционной ионизации (Laser Desorption Ionization – LDI/MS). Изначально метод LDI имел ограничения, поскольку лазер вызывал термическое разложение анализируемых веществ. Для подавления процесса термического разложения в 1985 году K. Tanaka была предложена методика использования мелкодисперсного порошка кобальта поглощающего излучение лазера в глицериновом растворе. M. Karas и F. Hillenkamp предложили в качестве матрицы органические вещества, способные интенсивно поглощать ультрафиолетовое излучение, поэтому они понижают деструктивные свойства лазерного излучения и облегчают ионизацию анализируемого вещества. Таким образом, был создан метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (Matrix-assisted laser desorption/ionization – MALDI/MS) — метод ионизации, обусловленнный воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом. Источником ионизации служат различные типы импульсных лазеров (газовые, твердотельные, лазеры на красителях). Большинство масс-спектрометров MALDI/MS снабжено азотным лазером с длиной волны излучения 337 нм (3,68 эВ) и длительностью импульса10–9 с. Этот мягкий метод ионизации в основном сочетается с времяпролетным анализатором масс (TOF/MS). Согласно современным представлениям о механизме ионизации в MALDI при облучении лазером из образца, представляющего собой твердую смесь анализируемого вещества и матрицы, происходит выброс материала в виде микрочастиц. Переданной энергии, как правило, бывает достаточно для возникновения локального нагрева, выделяется значительная энергия, которая переходит в энергию электронного и колебательного возбуждения, а также кинетическую энергию молекул. Над поверхностью образца возникает область высокого локального давления — факел, который преимущественно состоит из нейтральных частиц. Вместе с тем, в нем присутствуют и заряженные частицы, доля которых составляет 10−5 - 10−3 от полного числа всех частиц. На начальном этапе образования факела его плотность близка к плотности вещества в конденсированном состоянии. C расширением факела происходит распад конгломератов вплоть до образования отдельных молекул или их фрагментов, а также заряженных (преимущественно матричных) частиц. Ионизацию молекул, происходящую непосредственно при выбросе материала из конденсированного состояния, принято рассматривать как первичную. В расширяющемся факеле происходят непрерывные соударения между частицами, в том числе ион-молекулярные реакции между матричными заряженными частицами и молекулами анализируемого вещества, которые приводят к ионизации последнего. Такого рода ионизацию относят к вторичной. Пробу для проведения анализа методом MALDI готовят путем смешения исследуемого вещества (аналита) с матрицей. Вещество, используемое в качестве матрицы, должно обладать высоким коэффициентом экстинкции при длине волны лазерного излучения, быть химически инертным по отношению к анализируемому веществу, иметь низкую летучесть и термическую устойчивость. Данным требованиям отвечают производные оксикоричных (α-цианокоричная, феруловая, синаповая), некоторых ароматических кислот (2,5-дигидроксибензойная), а также ароматических карбонилов (2,6-дигидроксиацетофенон), которые в настоящее время широко используются в качестве матриц. Метод MALDI/TOF/MS был создан с целью анализа высокомолекулярных биологических молекул (пептиды и протеины). Поэтому он в первую очередь нашел применение в протеомном анализе. Предметом изучения протеомики являются синтез, модификация, декомпозиция и замена белков исследуемого объекта. Методы протеомного анализа позволяют проанализировать до 10 000 индивидуальных белков в одном образце и зафиксировать изменения их концентраций, что используется в диагностике и мониторинге течения заболеваний. Решающим фактором, который влияет на качество MALDI/TOF/MS масс- спектров, является кристаллизация аналита во время подготовки образца и поведение матрицы при облучении лазером. Самым простым вариантом является нанесение капли растворѐнного образца на мишень с помощью дозатора или микрошприца. После испарения растворителя сверху помещается капля матрицы. Возможен об- ратный вариант: на мишень наносится гомогенная «пленка» матрицы, к которой добавляется образец, который абсорбируется ею. Другой способ заключается в том, что насыщенный раствор матрицы смешивается с раствором аналита так, чтобы соотношение матрицы к аналиту было около 5000:1. Аликвота такой смеси затем помещается на мишень, где высушивается. Для проведения анализа можно использовать режимы образования положи- тельных ионов (образуются катионы [M+1]+) или отрицательных ионов (образуются анионы [M-1]-). Если в образце присутствуют следы солей металлов, то в масс-спектрах положительных ионов появляются ионные аддукты чаще всего натрия [М+23]+ и калия [М+39]+, реже аддукты с водой [M+18+1]+. Поскольку с помощью MALDI/MS осуществляется мягкая ионизация, то в спектрах фрагментации не наблюдается или она мало выражена, поэтому масс-спектры крайне просты и в предельном случае состоят только из специфического пика молекулярного иона. Данный метод сразу приобрел популярность благодаря сверхвысокой чувствительности порядка нескольких фемтомоль (10-15 моля). MALDI/TOF/MS может измерить массу почти любой молекулы. Анализ может быть выполнен в линейном (Linear) или отраженном (рефлектронном) (Reflective) режиме. Анализ является относительно нечувствительным к сопутствующим веществам. Необходимо очень малое количество образца (пикомоли или меньше), от 1 до 2 мл образца раствора. Метод позволяет быстро обрабатывать результаты, часто требуя меньше минуты для фактического анализа после пробоподготовки. Серьезную конкуренцию MALDI/TOF/MS составляют электроспрейные методы ионизации. Наиболее интересны, с точки зрения структурных исследований, ионизация термоспрея (TSP/MS) и ионизация при атмосферном давлении (API/MS), которые включают в себя электроспрейную ионизацию (ESI/MS) и химическую ионизацию при атмосферном давлении (APCI/MS). Принцип ESI/MS заключается в том, что анализируемое вещество поступает в растворе через капилляр с поданным на него напряжением. Электрическое напряжение на игле приводит к большому электрическому градиенту на жидкости, который разделяет заряды на поверхности. Это вынуждает жидкость выпячиваться с иглы в форме конуса Тейлора. Верхушка конуса вытягивается в нить до тех пор, пока не дос- тигнет предела Рэлея, при котором поверхностное натяжение и электростатическое отталкивание сравняются и сильно заряженная капля не оторвется от нити. Капли, которые оторвались от конуса, притягиваются к входу в масс-спектрометр из-за большой разности потенциалов между иглой и входом в масс-анализатор. По мере продвижения капли к анализатору кулоновское отталкивание на поверхности превосходит поверхностное натяжение, и капля «взрывается», высвобождая ионы. ESI/MS чаще всего используется в сочетании с квадрупольным анализатором. Квадрупольный детектор может быть заменен на ионную ловушку Q-IT/MS или времяпролетный детектор TOF/MS. В Q-IT, ионы захватываются в полости, образованной тремя электродами, и выбрасываются через них в зависимости от значения м/z. Это позволяет осуществлять последовательное дробление родительского молекулярного иона, а затем и дочерних ионов. Таким образом, он обеспечивает масс-спектры последовательной фрагментацией выбранных ионов. Анализатор TOF/MS отделяет ионы в силу их разного времени полета на известное расстояние. Преимуществом этого детектора является более высокая чувствительность и точность, чем квадрупольного детектора. Растворителями для электроспрея являются протонные растворители, такие как метанол, метанол – вода (50:50) или ацетонитрил – вода (50:50). Хотя 100% вода и используется в ESI, ее низкое давление пара является лимитирующим фактором чувствительности; лучшая чувствительность получается при добавлении летучего органического растворителя. Ионизация наноэлектроспрея (nanoESI-MS) является вариацией ESI-MS, в ко- торой игла спрея сделана очень маленькой и расположена близко ко входу в масс-анализатор. Конечным результатом является увеличение эффективности, которое включает уменьшение необходимого количества образца. В ионизации электроспрея используется поток воздуха или азота, нагревание, вакуумирование или сольватная оболочка (часто метанольная), чтобы обеспечить десольватацию капель. Выброс ионов происходит через «конус Тейлора» (центральная капля), откуда они затем электростатически направляются в масс-анализатор. Скорости потока для nanoESI-MS обычно составляют от десятков до сотен нанолитров в минуту. Чтобы получить такие малые скорости потока, nanoESI использует источники из вытянутого и, в некоторых случаях, металлизированного стекла или плавленого кварца с малым входным отверстием (~ 5 мкм). Растворенный образец вносится в источник, и к его концу прикладывается давление порядка 2 атм. Вытекание образца с очень малой скоростью позволяет достигать высокой чувствительности. Также источники расположены очень близко к входу в масс-анализатор, поэтому перенос ионов в масс-анализатор намного более эффективен. NanoESI менее чувствительно к солям и другим примесям, т. к. меньшее испарение означает, что примеси не будут концентрироваться так сильно, как при ESI. Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI/MS) генерирует ио- ны непосредственно из раствора и способна к анализу относительно неполярных соединений. Так же, как и в электроспрее, поток жидкости для APCI вытекает непосредственно в устройство ионизации. Однако капли не заряжаются и APCI/MS устройство содержит нагретый испа- ритель, который обеспечивает быстрое разделение/испарение капель. Молекулы образца в паре проходят через зону ионно-молекулярной реакции при атмосферном давлении. В APCI/MS ионизация возникает из-за возбуждения/ионизации растворителя коронным разрядом. Т. к. ионы растворителя существуют при атмосферном давлении, химическая ионизация молекул аналита очень эффективна; при атмосферном давлении молекулы аналита сталкиваются с ионами реагента очень часто. Перенос протона (для реакций протонирования MH+) образует положительные ионы, а перенос электрона или отщепление протона ([M-H]-) дает отрицательные. Сглаживающее влияние сольватных оболочек на ионах реагента и высокое давление газа уменьшают фрагментацию во время ионизации и ведут к образованию практически только нетронутых молекулярных ионов. Многократная зарядка обычно не наблюдается, скорее всего потому, что процесс ионизации более энергичен, чем при ESI. В итоге можно констатировать, что масс-спектрометрия в настоящее время стала одним из ведущих методов химических исследований благодаря своей высокой чувствительности, точности, экспрессности, диапазону определяемых масс. На начальных этапах своего существования масс-спектрометрия имела весьма ограниченное применение, поскольку единственный существовавший метод ионизации электронным ударом, вызывая жесткую ионизацию, позволял определять только малые, гидрофобные, термостабильные, легколетучие молекулы. Термолабильные вещества, будучи энергозависимыми, данным методом не определялись, разрушаясь в процессе перевода их в газообразное состояние. Определение молекулярных масс термолабильных, нелетучих соединений стало возможным благодаря разработке мягких толерантных методов ионизации. За истекший 40-летний период создано большое количество различных вариантов мягких десорбционных методов ионизации. Однако из всего многообразия только два реально обеспечили возможность наиболее эффективного анализа термолабильных органических соединений: образование ионов при распылении раствора анализируемого соединения в электрическом поле (электроспрей) и десорбция ионов из органической матрицы лазерным излучением. Достоинством электроспрейных методов ионизации является их возможность совмещения с хроматографами, поэтому они служат детекторами в методах высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии. Преимуществом метода MALDI/TOF/MS является универсальность, простота выполнения эксперимента, сверхвысокая чувствительность и экспрессность, возможность анализа смеси компонентов. Библиографический список 1. Лебедев, А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии / А.Т. Лебедев. — М. : Бином. Лаборатория знаний, 2003. —494 с. 2. Клюев, Н.А. Современные методы масс-спектрометрического анализа органических соединений / Н.А. Клюев, Е.С. Бродский // Рос. хим. ж-л. —2002. —Т. XLVI, No 4. —C. 57-63. 3. Джонстон, Р. Руководство по масс-спектрометрии для химиков-органиков. — М. : Мир, 1975. —236 с. жүктеу/скачать 63.14 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|
1 2