ГЛАВА 6. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ У БЛОХ

Проведено сравнительное изучение C. tesquorum altaicus из Каргинской и Барлыкской природных популяций Тувинского очага по морфологическим особенностям и уровню ФА. При 100 % исходной зараженности дисперсионный анализ выявил различия в частоте формирования конгломератов у имаго Каргинской и Барлыкской популяций (F=9,02, P<0,01). Исследование морфологических особенностей показало, что у самок из Каргы размеры головы больше, чем из Барлыка (t=3,97, P<0,001), у самцов различий не обнаружено. Вооруженность щетинками по всем пяти исследуемым признакам выше как у самок, так и у самцов Каргинской популяции.

Установлено, что средний по четырем признакам хетотаксии уровень ФА у особей Барлыкской популяции в два раза выше, чем Каргинской (рис. 9). При этом в организме блох Барлыкской популяции более интенсивно формировались конгломераты чумного микроба (Базанова и др., 2006).

Рис. 9. Интенсивность агрегирования чумного микроба у C. tesquorum altaicus из двух популяций, различающихся по уровню ФА признаков хетотаксии

Сравнивали уровень ФА у выборок самок и самцов блох Каргинской популяции со сформировавшимся «блоком» преджелудка и при его отсутствии. Результаты показали, что в шести случаях из восьми дисперсия разности больше у «блокированных» имаго (самок), при этом в двух – на достоверном уровне (F=0,867, P<0,05). Среди самцов больший уровень ФА по признаку «число щетинок на наружной поверхности голени» (F=0,800, P<0,05) также зарегистрирован у «блокированных» особей, по остальным четырем признакам статистически значимых различий не выявлено (Базанова и др., 2004).

Предполагается, что эпизоотологическая ситуация на участках очаговости чумы, наряду с комплексом других факторов, связана со структурой популяций переносчиков (Корзун, Никитин, 1997). Так как уровень ФА ниже у блох Каргинской популяции, чем Барлыкской, их разная векторная способность зависит либо от различий в восприимчивости к исследованному варианту микроба, либо от различного уровня ФА.

Рис. 10. Доля «блокированных» блох в популяциях C. tesquorum sungaris, различающихся по относительному количеству асимметричных особей

Таблица 6

Уровень флуктуирующей асимметрии (σ_d²) у блох без «блока» и с «блоком»

в экспериментах с гибридными блохами

Поскольку уровень ФА является информативным показателем, отражающим устойчивость индивидуального развития организмов к неоптимальным условиям внешней среды (Захаров, 1987), его высокие значения могут свидетельствовать об отклонении в развитии, которые обусловливают большую восприимчивость особей к заселению паразитами. Этим можно объяснить высокую частоту блокообразования у гибридов блох и насекомых с неочаговых по чуме территорий (у имаго «Усть-Ордынской» популяции).

Исследовали способность к выживанию при низких температурах у незараженных C. tesquorum altaicus, C. tesquorum sungaris и F. luculenta luculenta лабораторных популяций. Использовано по 200 имаго каждого подвида, с которыми поставлено по 2 варианта опыта. Опыт продолжался 30 дней. За этот период температура в толще снега менялась от 0 до -10,5º С.

За весь опыт доля погибших C. tesquorum altaicus составила 19 %, C. tesquorum sungaris – 63 %, F. luculenta luculenta – 39 %. Таким образом, C. tesquorum altaicus лучше переживали низкие температуры, чем C. tesquorum sungaris (t=6,33; P<0,001) и F. luculenta luculenta (t=3,11; P<0,01).

Способность к переживанию неблагоприятных условий изучали у инфицированных чумным микробом C. tesquorum двух подвидов (табл. 7).

Таблица 7

Переживание низкой температуры зараженными чумным микробом блохами

Более длительные сроки выживания установлены для инфицированных имаго C. tesquorum altaicus, зимовавших в искусственных нежилых «гнездах» суслика. До весны и лета следующего года выживало 69,9-87,6 % из зараженных осенью самок и 48,1-60,9 % самцов. Из блох, инфицированных летом, дожили до теплого периода следующего года 29,3 % особей, причем только самки (Базанова, Маевский, 1996). Таким образом, значительно успешнее доживали до нового эпизоотического сезона имаго, инфицированные осенью (по сравнению с летом) предыдущего года (без учета пола t=13,35; P<0,001), причем как самки (t=11,49, P<0,001), так и самцы (t=8,40, P<0,001). Самки C. tesquorum altaicus могут переживать не один, а два зимних периода и сохранять чумной микроб в течение 21-22 месяцев. Укусы таких особей вызывали иммуноаллергическую перестройку в организме сусликов, что выявлялось положительным ППН через 642-646 суток после заражения блох.

Поскольку бактериальный «блок» преджелудка у блох рассматривается как обязательное условие специфического способа передачи чумного микроба от грызуна к грызуну (Бибикова, Классовский, 1974; Hinnebuch et al., 1998), большое значение может иметь продолжительность жизни таких блох. Установлено, что длительность жизни «блокированных» C. tesquorum altaicus при +8º С составляла от двух до 20 суток. Половых различий в частоте гибели насекомых за этот период не выявлено, но большинство самцов погибло на вторые сутки, а самок – на шестые. Высокая продолжительность жизни (до 219 суток) отмечена у «блокированных» C. tesquorum altaicus, содержащихся при более низких температурах (от +6º до -6º С) в условиях искусственного гнезда суслика. Такие блохи могут длительно сохранять чумной микроб, о чем свидетельствуют результаты бактериологического исследования оставшихся в живых к концу апреля самок с сохранившимся «блоком». Но передачи микроба зверькам при подкормке этих блох не произошло, видимо в связи с низкой чувствительностью суслика к возбудителю весной.

Зимующие в состоянии оцепенения N. mana также могут длительно сохранять чумной микроб (348 суток) и передавать его зверькам летом следующего после их заражения года (Базанова, Хабаров, 1993).

Изучена морфологическая изменчивость и способность к агрегированию чумного микроба в организме C. tesquorum altaicus при неблагоприятных условиях существования переносчика (длительное голодание, холодный период года). Установленные факты свидетельствуют, что именно в агрегированном состоянии микроб находится в имаго зимний период. Результаты весеннего (апрель) опыта с «перезимовавшими» блохами, по доле особей с агрегированным микробом при первых подкормках наиболее близки данным, полученным к концу осеннего (сентябрь) эксперимента. Так, осенью за три последние подкормки выявлено 45,8±1,17 % особей с конгломератами микроба, весной за три первых подкормки «перезимовавших» насекомых – 49,1±15,39. Для сравнения отметим, что весной средняя доля «молодых» особей с конгломератами за три первые подкормки составила 0,7 % при их 100 % зараженности. У «молодых» насекомых этот показатель при трех первых подкормках существенно ниже (t=13,02, P<0,001), чем у «перезимовавших».

Доля «перезимовавших» имаго с агрегированным микробом за первые три подкормки была стабильно высокой как весной, так и летом. Весной отмечено 45,9±4,03 % особей с конгломератами, летом – 42,3±2,45 %. Зараженность «перезимовавших» блох составила 64,3 и 50 % соответственно.

Состояние агрегированности чумного микроба усиливается при голодании насекомых. На это указывают данные опыта с двумя группами «молодых» имаго в летний период. Подкормки одной группы начали на третьи сутки после инфицирования, второй – на 16. В первой группе появление особей с агрегатами микроба зарегистрировано на восьмые сутки (3 подкормка) после заражающего кормления имаго. Средняя доля таких блох по трем первым подкормкам составила 1,8 %, что достоверно меньше (t=5,63, P<0,001), чем в летних опытах с «перезимовавшими» имаго (в среднем 44,1±3,24).

Во второй группе после первой подкормки (16 сутки от заражения насекомых), выявлено 23 особи (12,2 %) с конгломератами возбудителя. При этом средняя доля таких имаго составила за три первые подкормки 9,7 %. Различия между группами насекомых, которых начали подкармливать на третьи и 16 сутки после заражения, достоверны (t=5,89, P<0,001). Длительное голодание привело к увеличению числа особей с агрегированным микробом при первом кормлении. В дальнейшем при регулярном кормлении блох межгрупповые различия, выявленные по трем первым подкормкам, нивелировались. По доле особей, с конгломератами микроба, между «молодыми», голодавшими после заражения в течение 16 суток, и «перезимовавшими» имаго, достоверных различий не установлено, что указывает на изменчивость микроба и повышенную агрегацию в любых стрессовых условиях.

К неоптимальным условиям существования чумного микроба в организме блохи относится высокая температура, лежащая вне температурного оптимума для имаго данного вида. В наших экспериментах «молодых» насекомых содержали в опытах весной при 22-27° С, летом – при 8-10° С. В первом случае особи с агрегированным микробом выявлены на третьи сутки после инфицирования насекомых (1 подкормка), во втором – на восьмые (3 подкормка). Очевидно, быстрый переход возбудителя в состояние агрегированности в организме блохи явился ответной реакцией на неоптимальную температуру окружающей среды для C. tesquorum altaicus и самого микроба.

Изучение морфологии чумного микроба у «перезимовавших» C. tesquorum altaicus с «глыбками» показало наличие палочковидных и шаровидных форм в соотношении 2:1. У «молодых» блох преобладали шаровидные формы и редко встречались палочки с невыраженной биполярностью, у «блокированных» («молодых» и «перезимовавших») – только шаровидные очень мелкие (0,2-0,5 мкм), бледно окрашенные формы. На ультратонких срезах желудочно-кишечного тракта «молодых» особей в первые сутки после заражения микроб представлен палочковидными и шаровидными формами, по мере голодания блох в основной массе отмечали округлившиеся бактериальные клетки, иногда увеличенные в размерах. В «перезимовавших» насекомых чумной микроб претерпевает более глубокие изменения, что, особенно, выражено в ультраструктуре самих микроорганизмов, которая включает дополнительные мембранные структуры (Маевский и др., 1994).

Таким образом, к изменению морфологии и агрегированию чумного микроба в блохах приводят особенности физиологического состояния насекомых при их подготовке к зимней диапаузе, длительном голодании и изменении температуры окружающей среды, что обеспечивает его сохранение.

Изучены особенности переживания чумным микробом холодного времени года в самках и самцах C. tesquorum altaicus. Блох инфицировали в сентябре. До зимовки одну группу подкармливали на сусликах периодически (1 вариант), другую содержали на хозяине постоянно (2 вариант). В 1 варианте опыта за последнюю подкормку (4 октября) конгломераты микроба отметили у 67,9 % самок и 48,2 % самцов (t=3,12; P<0,01). Средняя за опыт доля таких имаго (без учета пола) равнялась 18,9 %. В двух группах 2 варианта опыта перед помещением в «гнездо» суслика доля блох с агрегированным микробом составила 2,4 и 4,7 %, среди них преобладали самки. Представляет интерес факт, что во 2 варианте доля имаго с конгломератами была в 10-20 раз ниже, чем в 1, а различия в уровне блокообразования между ними не превышали 2-3 кратных. Вероятно, повышенное агрегирование микроба в организме блохи не обязательно приводит к увеличению уровня блокообразования, во всяком случае, осенью, при подготовке имаго к зимней диапаузе.

Имаго 1 варианта опыта изъяли из «гнезда» в апреле. Выжило 69,4 % самок и 46,9 % самцов. После первой подкормки конгломераты микроба отмечены у 50,0 % самок и 23,7 % самцов, различия достоверны (t=3,5; P<0,001).

Блохи 2 варианта опыта извлечены из «гнезда» в июне. В одной группе выжило 64,9 % самок и 40,0 % самцов, в другой – 52,6 % и 33,3 % соответственно. Выживаемость имаго в 1 и 2 вариантах опыта достоверно не различалась и была значимо выше у самок (t₁=4,2, t₂=4,1; P<0,001 для обеих групп 2 варианта). Летом после первой подкормки в одной группе доля самок с конгломератами микроба составила 42,5, самцов – 26,1 % (t=2,0; P<0,05), в другой – 52,6 и 33,3 % (t=2,5; P<0,05) соответственно.

Результаты проведенного анализа указывают на преобладающее значение самок C. tesquorum altaicus в сохранении чумного микроба и раскрывают механизмы его переживания в организме блох в холодное время года. Микроб в агрегированном состоянии накапливается осенью преимущественно в желудочно-кишечном тракте самок основного переносчика. В период зимовки насекомых продолжается процесс изменения морфологии микроорганизма и агрегирования отдельных клеток в конгломераты, в таком состоянии чумной микроб может сохраняться в организме блох длительное время (Маевский и др., 1994; Базанова и др., 2007).

Как и многие природные процессы, эпизоотический недоступен для прямого наблюдения за его протеканием (Солдаткин, Фенюк, 1968). Нами предпринята попытка изучения в эксперименте отдельных элементов латентной фазы эпизоотического процесса для уточнения механизмов сохранения чумного микроба в зимний период.

Изучена восприимчивость и чувствительность суслика к чумному микробу перед зимней спячкой, а также возможность инфицирования зимующих совместно с хозяином блох. Установлены факты инфицирования сусликов чумой осенью через укусы блох. Весной передачи возбудителя зверькам, вышедшим из спячки, не отмечено (Маевский и др., 1999). Выживаемость эктопаразитов совместно с хозяином в среднем составила 38,5 %. Из 400 интактных блох, помещенных на сусликов осенью, весной собрано 154 живых и 20 мертвых. Чумной микроб от эктопаразитов выделен в одном случае. Результаты опыта указывают на низкую выживаемость C. tesquorum altaicus совместно с хозяином и слабую возможность заражения на суслике зимой.

В серии экспериментов продолжительностью более 600 суток изучена выживаемость зараженных блох, зимующих отдельно от хозяина. Доля выживших C. tesquorum altaicus, инфицированных осенью, составляла в весенне-летний период следующего года 63,5-77,3 %. Чумной микроб отмечен весной у 64,3 %, летом – у 50 % таких насекомых. Отдельные особи (самки) сохраняли микроб 21,5-22 месяца, при этом зарегистрирован факт формирования «блока» на 411 сутки после заражения блох (Базанова, Маевский, 1996).

В рассматриваемых опытах различия в выживаемости имаго, зимующих отдельно или совместно с прокормителем, высоко достоверны (t=5,129, P<0,001). При этом самки во всех опытах пережили зимний период лучше, чем самцы (для первого опыта t=3,421, для второго t=5,370, для третьего t=4,406; для всех опытов P<0,001). Полученные данные свидетельствуют, что C. tesquorum altaicus гораздо лучше переживают зимний период отдельно от хозяина. «Перезимовавшие» насекомые весной слабо осуществляли передачу чумного микроба суслику, но летом этот процесс активизировался.

Рассмотрим, как изменялась доля особей с чумным микробом в агрегированном состоянии осенью у блох выплода текущего года, а затем весной и в начале лета у перезимовавших отдельно от хозяина имаго.

Осенью доля «молодых» особей с конгломератами микроба (до 70 %) возросла к концу эксперимента (3 и 4 октября). По сравнению со средним за осенний опыт показателем (15,8 %) доля блох с агрегированным микробом к началу октября увеличилась более чем в четыре раза. В этот период имаго заканчивают физиологическую перестройку для переживания зимнего периода в состоянии оцепенения, что, видимо, приводит к изменению взаимодействия микроба с организмом переносчика, возрастанию его способности к агрегации и сохранению в таком состоянии в C. tesquorum altaicus зимой.

Весной среди «перезимовавших» насекомых при первых трех подкормках (на 228-233 сутки после заражающего кормления) отмечено 44,3-48,0 % особей с конгломератами микроба. Кроме того, сразу же после первой подкормки выявлено пять блох с «блоками». При дальнейших подкормках доля особей с «глыбками» постепенно уменьшалась. Весной доля блох с конгломератами в среднем составила 31,5 %, что вдвое выше, чем осенью. Необходимо указать, что передача микроба произошла только в одном случае из 12 при кормлении 83 блох без видимого «блока» на 20 сутки от начала подкормок (19 мая), без генерализации инфекционного процесса у суслика. Факт передачи установлен на основании положительных результатов исследования на наличие антител к чумному микробу (РПГА – 1:320 и РНАг – 1:2560).

Летом периодические подкормки «перезимовавших» насекомых проводили с 17 по 27 июня. После первой-третьей подкормок (на 275-280 сутки от инфицирования блох) зарегистрировано от 37,9 до 51,0 % особей с агрегированным микробом. «Блокированные» блохи (4 экз.) отмечены после первой подкормки, что указывает на преимущественное значение «перезимовавших» блох как вектора в июне, по сравнению с имаго выплода текущего года. Средняя доля насекомых с агрегированным микробом составила 23,5 %, несколько снизившись по сравнению с весной. Следует отметить, во-первых, что эффективная передача микроба сусликам в летний период произошла уже при трех первых подкормках «перезимовавших» насекомых. Во-вторых, у всех трех заболевших чумой зверьков отмечено наличие возбудителя в крови, что способствует дальнейшей трансмиссии микроба. В-третьих, летом выше соотношение числа блох с «блоком» к их количеству с конгломератами. Осенью при более высокой, чем летом, доле таких насекомых (до 70 %), увеличения числа особей с «блоком» не наблюдали.

Результаты рассмотренных опытов показывают, что в Тувинском природном очаге основным местом сохранения чумного микроба в холодное время года является организм имаго основного переносчика, которые переживают зимний период в нежилых норах длиннохвостого суслика. Экспериментально установлено, что для осеннего периода в очаге характерно накопление возбудителя в организме блох в агрегированном состоянии, которое проявляется весной в исходно высокой концентрации конгломератов бактерий у перезимовавших имаго. При этом чумной микроб глубоко изменяет свою морфологию и ультраструктуру, а также культуральные свойства.

У блох с агрегированным микробом образование чумного «блока» возможно уже в первые дни питания на сусликах. В летний период возрастает вероятность передачи инфекции грызунам во время первого кровососания на них перезимовавших в состоянии оцепенения эктопаразитов. Перезимовавшие и сохранившие в своем организме вирулентного возбудителя чумы насекомые могут обеспечить начало следующей активной фазы эпизоотического процесса в Тувинском природном очаге, являясь основным фактором, обеспечивающим трансмиссию микроба в мае-июне. В июне-июле инфекциозность укусов «перезимовавших» особей возрастает и не уступает таковой у имаго выплода текущего года (Базанова и др., 2004). Чумной микроб, сохранившись в конгломератах в зимовавших в состоянии оцепенения блохах, под влиянием внешних условий (в том числе повышения температуры воздуха) вновь восстанавливает способность к трансмиссии. Появившиеся летом суслики нового поколения активно посещают старые норы, входят в контакт с пережившими зиму имаго (чаще самками), способными к эффективному заражению животных возбудителем чумы. Вследствие этого возобновляется циркуляция чумного микроба в Тувинском природном очаге.