Амперометрично определяне на концентрацията на кислорода в течни и газови фази. Приложения в биологията и медицината

АЛЕКСАНДЪР ГИЗБРЕХТ¹, ЖИВКО ДИМИТРОВ¹, ВАЛЕРИ КОЧЕВ²

Статията е посветена на разработването на система за регистрация на парциалното налягане на кислорода в течни и газови среди. Устройството се състои от амперометричен кислороден датчик Кларков тип и електронна схема за захранване и отчитане на данните. Датчикът е изолиран от външната среда с тефлонова мембрана, което е особено важно при изследването на течни фази съдържащи вещества възстановяващи се в близост до стандартния редокс потенциал на кислорода. Като примери са показани някои анализи на съдържанието на кислород в химични и биологични системи, а така също и измервания на дифундиралия през кожата кислород носен от кръвоносната система. В началото на работата е направен обзор на методите за определяне на кислорода и приложенията им за целите на биологичния и медицински мониторинг.

Construction and major principles of operation of a set-up, suitable for oxygen concentration analysis in chemically and biologically relevant samples are presented in the paper. The devise is based on an electrochemical scheme, operating in amperometric mode. The detector part consists of electrochemical cell comprising platinum working electrode and Ag/AgCl as a reference, which combination is the Clark electrode. The cell is isolated from the outer media by a Teflon membrane, thus avoiding interference with substances which are reduced at potentials close to the redox potential of O₂. Some examples of oxygen analysis of chemical and biological samples, as well as transcutaneous measurements of the blood stream saturation are given. A short review of methods for oxygen monitoring in biology and medicine is present at the beginning.

За контакти: Александър Гизбрехт, Институт по Електроника - БАН,София, бул.Цариградско шосе, 72,

тел.: +359887834893, E-mail: aig@abv.bg ;

Валери Кочев, Катедра „Атомна физика“, Физически факултет, Софийски университет „Св. Климент Охридски“, бул.„Джеймс Баучър“ 5, София 1164, тел.: +359 2 8161317, E-mail: kochevs@abv.bg.

1.1. Значимост на проблема за регистрация на кислородното съдържание в различни среди - химичен, биохимичен, екологичен и медицински аспект.

Ролята на кислорода като окислител в живите организми е добре позната. Именно с появата му в земната атмосфера [2] започва развитието на еукариотните организми, което е eдна от най-съществените стъпки в биоеволюцията [3]. Освен чрез директен пренос на електрони, редокс реакциите се извършват също така чрез прехвърляне на водородни атоми (или йони), или в комбинация с кислород [4]. При болшинството аеробни бактерии разграждането на хранителните вещества до крайните продукти CO₂ и H₂O става именно с участието на кислорода. Известно е, че клетките на мозъчната кора, на бъбречната кора и др. се нуждаят от много голямо количество енергия, която се доставя само по пътя на аеробното окисление. Мозъчните клетки употребяват 25% от необходимия за цялото човешко тяло кислород. При покой кислородна консумация от 1 л/мин задоволява нуждите на човешкия организм, а при физическо натоварване нараства 15-20 пъти.

В биологията количеството на разтворен кислород е един от най-важните показатели за живите организми, обитаващи водната среда [5]. Изменението на кислородната концентрация може да доведе до изменение в прилежащите биоценози и локалната екосистема, следователно контролът за съдържанието на кислород е необходим както в природните нетретирани води, така и в подлежащи на пречистване води замърсени от антропогенна дейност. Разтворимостта на кислорода в повечето течности, включително и във водата, се описва приблизително по законите за разтваряне на идеалните газове и при налягания близки до атмосферното тя е малка (от порядъка на 10 mg/dm³) и намалява с повишаване на температурата [6]. Повишаване нивото на концентрация на разтворени вещества и органични вещества намалява разтворимостта на кислорода. Както недостигът, така и излишъкът на разтворен кислород са рискови фактори за водните организми. Поради това по количеството му може да се съди за качеството на водите .

Кислородът е най-разпространения окислител в химията на горивните процеси [7]. Ето защо, определянето на неговото съдържание в различни горивни смеси е много важно както от химична, така и от екологична гледна точка. Целта е поддържане на оптимално съотношение между елементите на горивната смес. По тази причина в редица приложения е задължително, а в други препоръчително да се извършва непрекъснат контрол на кислородната концентрация в зоната на горене.

От медицинска гледна точка мониторинг на кислородното съдържание е от изключителна важност при провеждането на операции, изследването на оросяването на периферните тъкани, отглеждането в кувьози на недоносени новородени с цел предотвратяването на тежки поражения върху мозъка при понижено кислородно съдържание (хипоксия), а при предозирането с кислород (хипероксия) върху зрителния апарат и белите дробове. Именно необходимостта от мониторинг при недоносени новородени е била първоначално главната причина за разработването на кислородни сензори, които с помощта на катетър се въвеждат в пъпната артерия. Естествено, и трансфузионното измерване и въвеждането на сензори в кръвоносните съдове създават опасността за наранявания и инфекции. Ето защо от десетилетия се търсят алтернативни методи за неинвазивно изследване на кислородното съдържание.

1.2.Физични и химични методи за измерване на кислородната концентрация.

Понастоящем са известни много методи за определяне състава на течности и газове и в частност за измерване на кислородната концентрация [8-9]. Според начина на анализ методите може да се разделят на няколко групи: физични, химични, електрохимични. Тази класификация е доста условна, тъй като повечето от методите се преплитат помежду си.
Химични методи:

В аналитичната химия са известни различни косвени начини за намиране на активността на кислорода с помощта на редокс реакции в които той участва заедно с други окислители.

От сензорите изградени върху изцяло физически принципи, като най-прецизни се считат изотопните и масспектрометрични методи за изследването наличието на кислород. Но те изискват сложна и скъпа апаратура както и по-дълго време за анализ.

Електрохимичното определяне на кислорода предлага редица преимущества пред другите методи. Като най-съществени от тях се явяват по-малката инертност, даваща възможност за наблюдение на бързо протичащи процеси, опростената и надеждна измерителна схема, висока селективност и отстраняване въздействието на други реагенти с използването на селективни полимерни мембрани.

Тъй като статията е посветена на разработването на система за регистрация именно на основата на електрохимичните датчици, в следващата глава ще бъдат разгледани по-подробно няколко метода от аналитичната електрохимия за определяне на кислородната концентрация [10-12].
2. Методи на аналитичната електрохимия за определяне на концентрацията на кислород
Електрохимичните датчици за кислород се разделят на полярографски и галванични. Главното предимство на полярографските датчици е малкия размер на работния електрод. Като недостатъци могат да се посочат: необходимост от честа смяна на електролита в процеса на експлоатация, необходимост от точно поддържане на напрежението. Галваничните датчици за кислород притежават висока селективност и не се нуждаят от външен източник на захранване. Изходният сигнал на датчиците от този тип е право пропорционален на парциалното налягане на кислорода, поради което за обработката му не са необходими сложни електрически преобразуватели. В най-простия случай за да се измери кислородната концентрация може да се включи микроамперметър. Малките им размери, независимостта на изходния сигнал от положението им в пространството заедно с тяхната енергийна независимост ги прави незаменими в портативните газоанализатори.
2.1.Полярография с живачен капещ електрод.

Полярографският метод за изследване състава на разтворите се основава на анализа на волтамперните характеристики на окислително-възстановителните (редокс) реакции протичащи върху работния електрод. Той е предложен от Я.Хейровски [13]. За разлика от другите аналитични методи, при полярографията приложеният потенциал определя вида на протичащите реакции, а големината на тока ги характеризира количествено. Това дава възможност за едновременен контрол и измерване. Хейровски изучава електрохимичното поведение на повърхността на живачен (Hg) капещ електрод (Dropping Mercury Electrode, DME) в зависимост от приложения потенциал и химичните процеси в разтвора.

Класическата двуелектродна полярографска клетка е съставена от работен (индикаторен) електрод (в случая DME) и сравнителен електрод, спрямо който се отчитат потенциалите. При ниски съпротивления на електролита той служи и за отвеждане на слабите токове течащи през клетката. Освен стандартния водороден електрод (NHE или SHE) и каломеловия (SCE), в зависимост от условията на експеримента, за сравнителни електроди се използват и други комбинации от метали и техните соли (напр. Ag/AgCl). Обикновено е прието с термина полярография да се означават именно волтамперометрични изследвания с помощта на DME.

Живачният капещ електрод притежава характерни особености, които му отреждат важна роля между останалите електрохимични инструменти и обуславят широкото му използване в съвременните изследвания. По важните от тях са: 1) гладка повърхност на течно-течната граница Hg/електролит, задаваща добри гранични условия; 2) непрекъснатото обновяване на повърхността през няколко секунди, минимизиращо проблемите със „замърсяването” (напр. отлагането на редуцирани метални йони) на електродната повърхност; 3) високата стойност на свръхпотенциала за водород, създаваща условия за добра поляризация, т.е. DME може да се използва в по-широк обхват от +0,2 V до -2,6 V (докато Pt се използва от +0.9V до -0.8V). Токът преминаващ през клетката се измерва от галванометър, а напрежението подавано на клетката се регулира посредством делителя на напрежение. Протичането на електричен ток, както е известно, се дължи на придвижването на заряди в съответните фази. За електролитите например, той се обуславя от преместването на йоните, а за металите - от движението на електроните. При електрохимичната клетка необходимо условие за протичане на ток във веригата ще бъде наличието на хетерогенен пренос на заряд през граничната повърхност електрод/електролит. Този процес се осъществява в приелектродния слой, където високите стойности на електричното поле (породено от зададено външно напрежение) създават условия за активация на електронните обвивки на намиращите се там йони или неутрални частици. В резултат на това, върху повърхността на електрода (в зависимост от неговия потенциал), се извършват окислителни или възстановителни реакции, съпроводени от хетерогенен електронен пренос. Колкото по-голям е броят на активираните частици, толкова по-висока ще бъде скоростта на електрохимичната реакция, респективно стойността на ток във веригата. Тази пропорционалност между скоростта на реакцията и тока се дава от уравнението на Фарадей:

където N- броя на молoвете, i –токът, n – броят електрони за 1 mol, F=96484,55 C/mol- константа на Фарадей.

Възстановяването на кислорода върху работния електрод (WE) е изобщо сложен процес който протича през няколко стадия. Полярограмата има вида показан на Фиг.1. Тя се състои от две вълни, първата от които съответства на двуелектронния процес:

O₂ + 2e^- + 2H₂O H₂O₂ + 2HO ^-

а втората (при потенциали по-отрицателни от -0,8V) отразява дву-електронната редукция на водородния пероксид:

H₂O₂ + 2e^- 2HO^-

На практика обаче, се оказва възможно процесът да бъде описан от едно сумарно уравнение на 4-електронно възстановяване:

O₂ + 4e^- + 2H₂O 4 HO ^-

чиито ток отговаря на сумата от крайните токове на двата стадия.

Фиг.1. Полярограма на кислородна редукция върху DME.

В зависимост от химичната природа на участващите вещества, състава на електролита и материала на електрода, електрохимичната реакция изисква определена енергия на активация. За всяко вещество съществува дадена минимална стойност на потенциала на електрода при, който реакцията започва да тече с измерима скорост. Зависимостта на тока (напр. катодния, т.е. на възстановяване) от потенциала е показана схематично на фиг.2. Тя се нарича полярографска вълна и както се вижда има S-образна форма като в някакъв интервал на потенциала токът се мени от 0 до пределната стойност i_l.

Фиг.2. Волтамограма на кислородна редукция върху въртящ се платинов електрод.

Както и при много други методи, изследването на една електрохимична система обикновено се извършва като се поддържат постоянни определени параметри на системата и се следи нейното поведение при промяната на една контролирана величина. От гледна точка на електричните променливи например, могат да се разглеждат най-общо два типа измервания:

1) потенциометрични, за които i = 0 и потенциалът Е се определя като функция на концентрацията. Поради липсата на фарадееви процеси в този случай потенциалът зависи предимно от термодинамичните свойства на системата;

2) амперометрични, при които се изследва зависимостта на тока от промените в състоянието на клетката при прилагането на някакво въздействие (напр. стъпалообразно изменение на потенциала).

По-широко разпространение са получили такива методи, при които потенциалът на работния електрод следва предварително зададена програма. Той може да се поддържа постоянен или да се мени с времето по определен начин (стъпално, импулсно, осцилиращо, линейно и т.н.), а токът се измерва като функция на времето или потенциала.

2.3.Амперометричен електрод на Кларк.
Може да се каже, че повечето от рутинните електрохимични техники за определяне на кислорода са ориентирани към използването предимно на амперометричен вариант. Регистрацията на кислородната концентрация става посредством измерване на тока през електрохимичната клетка при постоянно подадено напрежение върху WE равно на потенциала на възстановяване на кислорода.

Особено внимание трябва да се обърне на класическия „електрод на Кларк” [14], който революционизира експериментите свързани с кислородното отделяне при фотосинтезата. През 1956 г. Кларк пръв предложил да се куплира газопроницаема мембрана с електрохимичен платинов електрод, чувствителен към кислород, разделени от тънък слой индиферентен електролит (фиг.3). За проникването на кислорода през мембраната и насищането на електролита са необходими от 3 до 15 сек., което обуславя забавянето на измерването.

Фиг.3. Принципна схема на установка за измерване на съдържанието на кислород в течна фаза с електрод на Кларк.

От друга страна, на основата на кларковия амперометричен електрод, П.Жолио (P.Joliot) [15] е разработил електрохимичен метод за регистрация на бързите изменения в кислородното отделяне при фотосинтезата. Характерно за конструкцията на неговата клетка е голямата площ на катода, предизвикваща значителна автоконсумация. При малък обем на разтвора това води до бързо изчерпване на кислорода, поради което системата реагира практически на скоростта на кислородната продукция. Така става възможно да се определи не само стационарното количество кислород, но и това отделено при подаването на кратки възбуждащи светкавици.
2.4.Галваничен кислороден електрод.

Един доста разпространения вариант на кислороден датчик се реализира с помощта на галваничен елемент (англ. galvanic cell). Това е електрохимична система състояща се от метален електрод - катод (най-често от благороден метал) и оловен анод потопени в разтвор на калиева основа. Системата е в състояние да произвежда ток в присъствието на кислород. Големината на тока зависи линейно от концентрацията на кислорода в средата. Нейното широко използване се дължи на преимуществото, че не е необходимо захранване и поддържането й е просто. Концентрацията на кислорода в газовите смеси влияе на срока й за годност, затова времето за употреба понякога се задава в спецификациите с размерност „% часове”. Ако например срока за експлоатация е 200 000 часа, това означава, че в атмосфера на чист кислород датчикът ще работи без проблеми приблизително 3 месеца, а в атмосферен въздух — около 15 месеца. Средната продължителност на живот на елемента в нормални условия е примерно една година, в продължение на която обаче трябва да се провежда редовна калибровка.

В медицината съществува метод изграден на основата на електрохимичните датчици за определяне на артериалната кислородна концентрация. Този метод е известен под названието transcutaneous monitoring (TCM). Методът измерва артериалното pO₂ посредством дифузията на кислород през кожата, явление открито от Герлах [16]. Установено било, че при локално нагряване на кожата, след достигане на равновесие измереното на повърхността, pO₂ съответства на артериалното налягане на кислорода. От своя страна то е пряко свързано с кръвното налягане, т.е. налягането което кръвта упражнява върху стените на кръвоносните съдове.

От уравнението за идеалния газ: p_iV = n_iRT се вижда, че парциалното налягане на газа X_i е пропорционално на моларната му концентрация, т.е:

При налягания близки до атмосферното, уравнението може да се счита в сила и за pO₂ и pCO₂. Методът позволява презкожно да се следи концентрация на газовете в периферните съдове , което за редица заболявания е ценна диагностична информация. Важно условие за адекватното съответствие между артериалното pO₂ и измереното върху повърхността на кожата tcpO₂ е насищането с кръв на съдовете (хиперемия) в областта на датчика. Това става чрез поддържане на постоянна локална вазодилация (съдоразширение). Тя може да бъде причинена както от химични агенти предизвикващи иритация (възбуждане), така и посредством нагряване до 42^о – 43^о С, като втория начин е за предпочитане. Така се постига максимален кръвен ток в този участък от кожата, което води до изравняване на pO₂ в артериалните и венозни окончания на капилярите - артериализация.

Детектиращата част на комбинираните O₂/CO₂ ТСМ прибори за транскожно детектиране на дифундиралите газове (tcpO₂, tcpCO₂) съдържа следните основни възли: 1) твърдотелен газов потенциометричен CO₂ датчик, 2) амперометричен кислороден електрод (кларков тип), състоящ се от платинов катод и сребърен анод покрити с газ-пропусклива мембрана задържаща електролита между тях, 3) полупроводникови елементи за нагряване и отчитане на температурата. Тези елементи са поместени в общо метално тяло, обхванато от метален корпус снабден с маншета за прилепване към кожата (фиг. 4).

Фиг.4. Устройство на измерителна глава за едновременно определяне на pO₂ и pCO₂ на фирмата “Radiometer-Copenhagen”.

Усъвършенстването на твърдотелните микроелектронни технологии, позволиха в един общ чип с миниатюрни размери да бъдат интегрирани различни сензорни елементи като например йон-селективни и pH електроди, датчици за O₂ и CO₂ и т.н. Един от най-известните производители на подобна специализирана апаратура е датската фирма “Radiometer-Copenhagen”Ltd.
Предварителни експериментални резултати

В Институт по електроника на БАН са проведени експериментални измервания на дифузията на кислород през кожата чрез полярографски метод с използване на кислороден монитор ТСМ-2 от фирма “Radiometer-Copenhagen ”, използващ датчик на Кларк с платинов катод и сребърен анод. Мембраната на електрода е в директен контакт с кожата, която се нагрява до температура около 40-43⁰С. Под действие на температурата кислородът в капилярните съдове дифундира в епидермиса, а след това и в електролитната клетка, където и става измерването. Значението на налягането на кислорода в кръвта, измерено презкожно (t_срО₂) съответства на величината на артериалното рО₂. Грешкитe в измерването на величината на t_срО₂ зависят от дебелината на кожата, подкожния кръвоток, физиологичните фактори, влиящи върху доставката на О₂ към повърхността на кожата (намален сърдечен дебит, артериалното налягане, централна вазоконстрикция), физическо и емоционално натоварване. С тази цел за намаляване на грешките в измервания на t_срО₂ датчикът на прибора се разполага на повърхността на кожата в местата с високо капилярно налягане (като например ръцете, дланите).

Първоначално е проведено измерване на началната концентрация на кислорода в кожата, която е била около 20 мм жив.ст., което се явява началната точка, от която започва повишаване на концентрацията на кислорода под топлинно въздействие. Локалната температура в зоната на въздействие се повишава с помощта на нагревател, вграден в датчика. При продължителност на въздействието от 10 мин. е измерена температура 40°С и ръст на локалната концентрация на кислорода в зоната на нагряването 1,8 пъти (измерено е 36 мм жив.ст. ). При температура 43°С ръстът на локалната концентрации на кислорода в зоната е повече от 2 пъти и достига величина 44 мм рт.ст. Ограничението на температурата до 43°С е обусловено от денатурацията в биотъканите.

Така предложения метод за измерване на локалната концентрация на кислорода в кожата на основата на електрохимичните датчици позволява надежното й измерване и ще бъде използван в следващите експериментални изследвания .

ИЗПОЛЗВАНА ЛИТЕРАТУРА

[2] Фотосинтез / Под ред. Говинджи. Москва: Мир, 1987 , 460 с.

[3] Bloch К., Cholesterol,Evolution of structure and function, Benjamin/Cummins, New York, 1985.

[4] Nelson D.and Cox M.M., Lehninger Principles of Biochemistry, 4th ed., W.H.Freeman and Co, New York, 2005.

[5] Lodish H., at al., Molecular Cell Biology,5th ed., W.H.Freeman and Co, New York, 2003.

[6] Mortimer R.G., Physical Chemistry 3rd ed., Elsevier, Academic Press, New York, 2008.

[7] Carey Fr.A., Organic chemistry, 4th ed., McGraw-Hill Comp.Inc., New York, 2000.

[8] Бончев П., Увод в аналитичната химия, София, Наука и изкуство, 1985.

[9] Harvey D., Modern Analytical Chemistry, McGraw-Hill Comp.Inc., New York, 2000.

[10] Bagotsky V.S., Fundamentals of electrochemistry, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, 2006.

[11] Bard A.J.,Faulkner L.R., Electrochemical methods: Fundamentals and applications,

1st ed.,717pp., John Wiley & Sons, New York, 1980.

[12] Edmonds T.E., Chemical sensors, 326pp., Chapman and Hall, New York, 1988.

[13] Heyrovsky J., Chem. Listy, 16, 246, 1922

[14] Clark L.C., Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 2, 41-48, 1956

[15] Joliot, P.. Photochem. rt: Photobiol. 8, 451(1968)

[16] Gerlach V., Arch.Anat.Physiol., 431-479, 1851

Благодарности.

Части от това изследване са финансирани по договор ДНТС-01/0006/2012