Анализ молекулярных аспектов функционирования миозина II в мышечном сокращении и клеточной подвижности с помощью белка krp 03. 00. 04 Биохимия

жүктеу/скачать 301.64 Kb.

Дата	17.06.2016
өлшемі	301.64 Kb.
	#141645
түрі	Автореферат

На правах рукописи

Серебряная Дарья Владимировна

АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНЫХ АСПЕКТОВ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МИОЗИНА II В МЫШЕЧНОМ СОКРАЩЕНИИ И КЛЕТОЧНОЙ ПОДВИЖНОСТИ

С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА KRP

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2006

Работа выполнена в лаборатории клеточной подвижности Института экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский Кардиологический научно-производственный комплекс» Росдрава РФ

Научный руководитель: кандидат биологических наук

А.В. Воротников

Научный консультант: доктор биологических наук,

профессор

В. П. Ширинский

Официальные оппоненты доктор биологических наук

О.С. Тарасова

кандидат биологических наук

А.Ю. Александрова

Ведущая организация: Институт биологии развития РАН

имени Н.К. Кольцова

Защита состоится 26 октября в 11 часов на заседании Диссертационного совета К.208.073.02 в РКНПК Росздрава по адресу Москва, 121552, 3я Черепковская ул., д 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ.
Автореферат разослан 25 сентября 2006 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Т.И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Двигательная активность является фундаментальным свойством всех клеток животных. В специализированных мышечных клетках она проявляется в виде их сократительной активности, а в немышечных клетках – в их пространственном перемещении, или миграции. Эти процессы играют ключевую роль в репарации тканей, ремоделировании, ангиогенезе, иммунном ответе и патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Поэтому исследование механизмов регуляции двигательной активности клеток необходимо и актуально как с фундаментальной, так и с прикладной биомедицинской точки зрения.

Одним из базовых принципов клеточной подвижности является функционирование миозина II как внутриклеточного молекулярного мотора. Активность «несаркомерных» миозинов немышечных клеток и гладких мышц контролируется фосфорилированием остатка Ser-19 регуляторных легких цепей (РЛЦ). Это фосфорилирование выполняет одновременно две функции: с одной стороны, активируя АТФ-азную (моторную) активность миозина, а с другой - приводя к полимеризации его молекул в филаменты. Обе функции необходимы для образования функционального актомиозина и развития сокращения. В клетках обнаружены несколько киназ РЛЦ миозина, основными из которых являются Ca²⁺-зависимая киназа легких цепей миозина (КЛЦМ) и ряд Ca²⁺-независимых протеинкиназ, к которым относятся Rho-зависимая киназа (Rho-киназа), интегрин-ассоциированная протеинкиназа (ILK) и Zip-киназа. Дефосфорилирование миозина осуществляется под действием фосфатазы РЛЦ миозина (ФЛЦМ). Баланс активностей киназ и ФЛЦМ определяет внутриклеточный уровень фосфорилирования РЛЦ и двигательную активность гладких мышц и немышечных клеток.

В гладких мышцах миозин II в основном находится в филаментарном состоянии. В связи с этим, фосфорилирование Ser-19 РЛЦ реализует в гладкой мускулатуре, главным образом, функцию активации миозинового мотора и сокращения. Напротив, в немышечных клетках, где значительная доля миозина II представлена мономерами, фосфорилирование РЛЦ необходимо не только для активации АТФазной активности миозина, но и для образования его филаментарных структур. Известно, что моторная функция миозина II играет ведущую роль в движении клеток, в то время как значение структурной организации и динамики филаментов немышечного миозина в этом процессе остается неясным.

Трудность определения вклада структурной организации миозина II в клеточную подвижность связана с невозможностью разобщения эффектов фосфорилирования РЛЦ на полимеризацию миозина II и активацию его моторной функции. В настоящей работе мы применили два подхода с использованием свойств белка KRP (Kinase Related Protein, телокин), который представляет собой независимо экспрессирующийся только в гладких мышцах С-концевой домен КЛЦМ. Этот белок взаимодействует с гладкомышечным и немышечным миозинами in vitro и подавляет фосфорилирование Ser¹⁹ РЛЦ, но вызывает полимеризацию миозина в филаменты (Shirinsky et al., 1993). Используя препараты гладких мышцах мы, во-первых, установили эффект KRP только на моторную функцию миозина. Во-вторых, в системе немышечных клеток мы использовали способность KRP разобщать эффекты фосфорилирования РЛЦ на полимеризацию и моторную активность миозина. Учитывая, что общие принципы сократимости актомиозина одинаковы в гладких мышцах и немышечных клетках, сравнительный анализ двигательных реакций актомиозина в этих двух системах позволил нам вычленить значимость структурной динамики миозина II в клеточной подвижности.

Целью нашего исследования было выяснение механизма функционирования миозина II с использованием двух экспериментальных систем и белка KRP в качестве инструмента для разобщения структурной и моторной составляющих активности миозина. В модели трансгенных фибробластов мы исследовали действие KRP на актомиозин-зависимую клеточную подвижность, а в модели скинированных гладких мышц – избирательное действие KRP на сократительные свойства актомиозина. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

Исследовать влияние KRP на сократимость скинированных гладкомышечных волокон.
Получить линии трансгенных фибробластов, экспрессирующих белок KRP и измерить уровень фосфорилирования и содержание полимерного миозина II в этих клетках.
Исследовать двигательный фенотип трансгенных фибробластов.
Исследовать влияние селективных ингибиторов протеинкиназ на хемотаксис и уровень фосфорилирования миозина II в трансгенных клетках.
Установить вклад С-концевой миозин-связывающей последовательности KRP в регуляцию состояния миозина II и миграцию трансгенных клеток, а также сократимость скинированных волокон.

Научная новизна работы. В ходе данной работы впервые обнаружено, что белок KRP ингибирует сокращение гладкой мускулатуры и фосфорилирование РЛЦ миозина, осуществляемое Ca²⁺-независимыми протеинкиназами, за счет связывания с миозином. Установлено, что в трансгенных фибробластах белок KRP является регулятором активности миозина II и активирует двигательную активность фибробластов. Определено, что мишенью KRP в клетке является миозин, регулируемый КЛЦМ и, возможно, Zip-киназой. С помощью сравнительного анализа эффектов KRP на сократимость гладких мышц и двигательные реакции фибробластов мы установили, что структурная составляющая активности миозина II играет критическую роль в реализации клеточной подвижности.

Практическая значимость работы. Результаты настоящей работы вносят значительный вклад в понимание механизмов функционирования миозина II и объясняют некоторые феномены клеточной подвижности. Получена новая информация о механизмах клеточной подвижности в целом, которая может служить основой для разработки новых подходов для коррекции как сократительных, так и двигательных реакций клеток.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Biological motility» (Пущино, Россия, 2004), «Biological motility: basic research and practice» (Пущино, Россия, 2006), XII конференции «Ломоносов-2005» (Москва, Россия, 2005), а также на 34-ой и 35-ой Европейских мышечных конференциях (Дебрецен, Венгрия, 2005; Гейдельберг, Германия, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 31 рисунком. Диссертация изложена на 130 страницах. Список литературы включает 208 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение концентрации белков. Концентрацию KRP человека определяли спектрофотометрически, принимая коэффициент экстинкции (E_{280 нм}^{1 мг/мл}) равным 0.77 (Shirinsky et al, 1993). Концентрацию других белков определяли по методу Bradford (1976).

Разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Очищенные белки, клеточные лизаты и экстракты тканей подвергали электрофорезу в пластинах 7.5-15% ПААГ по методу Laemmli (1970). Клетки выращивали до 80-90% от конфлюэнтного монослоя, промывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) и лизировали на льду трехкратным буфером для нанесения образцов. Замороженные препараты интактных гладких мышц, или фиксированные в 95% ацетоне скинированные волокна экстрагировали трехкратным буфером для нанесения образцов. Все пробы центрифугировали (20 мин, 15000 g) и кипятили 3 минуты. Для окраски гелей Кумасси нагрузка дорожек составляла 0.5 - 3 мкг для очищенных белков и 20-30 мкг общего белка для лизатов клеток и тканевых экстрактов. В случае последующего иммуноблоттинга наносили 3 - 200 нг очищенного белка, а количество клеточных и тканевых образцов подбирали экспериментально.

Мочевинно-глицерольный электрофорез. Для оценки степени фосфорилирования миозина образцы гладкомышечных волокон и фибробластов анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии 6 М мочевины и 15% глицерола согласно Lubomirov et al (2006). Гладкомышечные волокна (200 мкм/5 мм) фиксировали на льду 10 минут в 15% ТХУ, содержащей 2% пирофосфат, после чего промывали 3-4 раза 95 % ацетоном. Затем ткань гомогенизировали в буфере для нанесения образцов, инкубировали 1 час при комнатной температуре, снова гомогенизировали и центрифугировали (2 мин, 15000 g). Пробы повторно инкубировали 1 час при комнатной температуре и использовали для электрофореза. Фибробласты культивировали до 80-90% от конфлюэнтного монослоя, промывали ФСБ, и фиксировали 3 минуты в 15% ТХУ на льду. Осадок клеток собирали, центрифугировали (3 мин, 10000 g) и растворяли в буфере для нанесения.

Иммуноблоттинг. Иммуноблоттинг проводили по методу (Towbin et al, 1979) с модификациями. Электроперенос (80 V/350 мА) после ДСН-электрофореза проводили на мембраны PVDF: KRP - в течение 1 часа в 10 мМ CAPS, pH 11.0, 10% этанол, другие белки – в течение 1 – 4 часов в 25 мМ трис, 180 мМ глицин, pH 8.3, 20% этанол, 0.1% ДСН. Электроперенос после мочевинно-глицерольного электрофореза осуществляли на нитроцеллюлозную мембрану в 25 мМ трис, 192 мМ глицин pH 8.6 и 20% метанол в течение ночи при 50 мА. Мембраны блокировали 1 час при комнатной температуре (или в течение ночи при +4ºС) в 5% растворе обезжиренного молока в буфере ТСБ-Т (20 мМ трис- HCl, pH 7.6, 165 мМ NaCl, 0.05% Твин-20). Инкубацию как с первичными, так и с вторичными антителами (коньюгаты антител с пероксидазой хрена) проводили 1 час при комнатной температуре в растворе 1% обезжиренного молока в ТСБ-Т. Препараты первичных и вторичных антител использовали в разведениях, рекомендованных производителем. В работе были использованы антитела к КЛЦМ (клон К36), глицеральдегидфосфатдегидрогеназе (ГАФД) и РЛЦ (все - Sigma, США), к немышечному миозину II B (Covance, США), Rho-киназе (Bethyl, США), Zip-киназе (eBioscience, США), ILK (Stressgen, Канада), myc-эпитопу (Invitrogen, США), MYPT (Abcam, Великобритания), KRP (Хапчаев, 2004) и фосфорилированным по остатку Ser¹⁹ РЛЦ (Goncharova et al, 2002), а также наборы вторичных антител, коньюгированных с пероксидазой хрена (Amersham, Великобритания и Pierce,США). Белковые полосы выявляли с помощью хеминилюминесцентной реакции (Amersham, Великобритания) или 3,3-диаминобензидина (ДАБ).

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков. Бактериальную экспрессию белков проводили в клетках E.coli штамм BL21(DE3). Экспрессию индуцировали изопропил--D-тиогалактопиранозидом (3 мМ) при достижении плотности культуры A₆₀₀=0.3-0.4. Через 3 часа клетки осаждали центрифугированием (5000g, 20 минут), ресуспендировали в 20 мл буфера (25% сахароза, 0.2 M KCl, 30 мМ трис-HCl, pН 8.0, 0.2 мМ ингибитор трипсина TPCK, 0.5 мМ смеси ингибиторов протеаз AEBSF, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА). Клетки разрушали с помощью обработки ультразвуком (Branson SONIFIER 450, Branson Ultrasonics Corp., США). Полученный лизат центрифугировали (9000 g, 20 мин) и из надосадочной жидкости выделяли рекомбинантные KRP и его мутантные формы по методу Ito et al (1989) с модификациями. Белки высаливали в диапазоне 40-60% насыщения (NH₄)₂SO₄. Осадок диализовали против 30 мМ KCl, 30 мМ трис-HCl, pH 7.5, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 0.1 мМ AEBSF, наносили на колонку DEAE-Sepharose (Pharmacia, США) и элюировали линейным градиентом 0 – 0.6 М градиентом NaCl. Фракции, содержащие KRP или его мутантные формы, объединяли, диализовали против 2 М (NH₄)₂SO₄, 1 мМ CaCl₂, 30 мМ трис-SO₄, pH 7.5, 20 мМ β-меркаптоэтанол и проводили хроматографию на Phenyl-Sepharose (Pharmacia, США), элюируя ниспадающим 2.0 – 0.0 М градиентом (NH₄)₂SO₄. Затем фракции, содержащие KRP или его мутантные формы, диализовали против MPB (10 мМ MOPS, pH 7.0, 1мМ MgCl₂, 0.1 мМ EGTA, 20 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ)) и концентрировали на концентраторах фирмы Pierce (США). Очищенные белки хранили в аликвотах при -20˚С. Фильтрат, полученный при концентрировании белка, использовали как контрольный буфер для измерения сократительной активности гладкомышечных волокон (см. ниже).

Получение KRP и СKRP, меченых 5’-TMRIA. Растворы KRP или СKRP (KRP с делецией С-концевого миозин-связывающего домена) инкубировали в концентрации 1 мг/мл с 20 мМ ДТТ в течение 20 минут при комнатной температуре, после чего диализовали в течение ночи против 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола (pH 6.5), 1 мМ MgCl₂, 1 мМ EGTA, 0.1 мМ ДТТ. Затем раствор инкубировали с 10-кратным избытком 5’-TMRIA (тетраметилродамин-5-йодацетамид-дигидроиодидом) 4 часа в темноте при перемешивании при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 2 мМ ДТТ. После этого раствор белка диализовали против MPB, концентрировали и хранили при -20С.

Создание молекулярно-генетических конструкций. Для постоянной экспрессии KRP в клетках, последовательности кДНК KRP и СKRP были амплифицированы методом ПЦР с использованием 5’-праймера 5’tatagatctccatggcaatgatctcagggc3’ и 3’–праймеров 5’gctagttattgctcagcggtggc3’ и 5’aaactcgagctaaagctctgctgtgcaggtg3,’ для KRP и CKRP, соответственно, и переклонированы в вектор pCMV/c-myc/cyto. Клонирование проводили по рестриктным сайтам Nco I и Xho I таким образом, чтобы myc-эпитоп (QQKLISQEDL) оказался на C-конце KRP и CKRP. Для переклонирования СKRP в вектор pET28a+ его последовательность была амплифицирована методом ПЦР с использованием 5’-праймера 5’tatagatctccatggcaatgatctcagggc3’ и 3’-праймера 5'aaactcgagctaaagctctgctgtgcaggtg3’. Клонирование проводили по рестриктным сайтам Nco I и Xho I. Правильность полученных конструктов была подтверждена секвенированием.

Культивирование 3T3 фибробластов. Фибробласты мыши линии NIH3T3 (CRL-1658, ATCC) культивировали в среде роста DMEM с 2 мМ L-глутамином, 100 ед/мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином и 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) при 37˚С и 5% СО₂ соответствии со стандартным протоколом ATCC (http://www.atcc.org).

Транзиторная трансфекция. 3T3 фибробласты трансфицировали плазмидами pCMV/KRP/c-myc/cyto и pCMV/ΔСKRP/c-myc/cyto, используя набор реагентов Unifectin-21 (Пеплайн, Россия). Для определения количества трансфицированных клеток параллельно проводили трансфекцию плазмидой pCMV/GFP/c-myc/cyto. Эффективность трансфекции оценивали по флуоресценции GFP-позитивных клеток.

Постоянная трансфекция. Для получения трансгенных 3T3 фибробластов, стабильно экспрессирующих KRP и ΔСKRP, клетки трансфицировали плазмидами pCMV/KRP/c-myc/cyto и pCMV/СKRP/c-myc/cyto (см.выше). Для получения контрольных «mock»-клонов, устойчивых к G418, но не экспрессирующих исследуемого белка, фибробласты трансфицировали плазмидой pCMV/c-myc/cyto. Через 36 часов клетки трипсинизировали и делали серийные разведения клеточной суспензии (от 10% до 0,01%) в DMEM с G418 (600 мкг/мл). Затем клетки высаживали на 96-луночные планшеты и выращивали на DMEM с 10% ЭТС, содержащей антибиотик G418 (600 мкг/мл). После гибели нетрансфицированных клеток отмечали лунки, в которых образовалась только одна клеточная колония. Далее колонии культивировали до 80-90% от конфлюэнтного монослоя и затем последовательно высаживали на 24-х-луночный планшет, 6-луночный планшет, 35 мм чашку, 60 мм чашку и, наконец, на 100 мм чашку. Отобранные клоны анализировали на содержание KRP и СKRP методом иммуноблоттинга. Клетки клонов, экспрессирующие KRP и СKRP, замораживали и хранили в жидком азоте.

Определение внутриклеточной концентрации KRP, CKRP и миозина II в трансгенных 3T3 фибробластах. Лизаты клонов фибробластов, содержащих KRP и CKRP c известной концентрацией клеток, анализировали методом количественного иммуноблоттинга с помощью поликлональных антител KRP, используя рекомбинантный KRP человека в качестве стандарта, и определяли количество KRP в одиночной клетке. Внутриклеточную концентрацию KRP рассчитывали, измеряя средний объем 3T3 фибробласта под микроскопом. Внутриклеточную концентрацию миозина определяли по аналогичной схеме, используя в качестве стандарта гладкомышечный миозин курицы.

Миграция в камере Бойдена. Миграцию клонов 3T3 фибробластов, экспрессирующих KRP, проводили в камере Бойдена 3 часа при 37 С. Мембрану для миграции предварительно дегазировали и покрывали коллагеном I типа. В качестве контроля использовали исходные 3Т3 фибробласты и «mock»-клоны. В качестве хемоаттрактанта использовали DMEM с 10% ЭТС. Для проведения эксперимента клетки выращивали до 60 – 80 % от конфлюэнтного монослоя и выдерживали сутки в DMEM с 0.5% ЭТС. Затем фибробласты трипсинизировали и проводили подсчет клеток. В каждую лунку вносили 110⁵ клеток, суспендированных в бессывороточной среде. Через 3 часа мембрану фиксировали 96% этанолом в течение 5 минут, удаляли непромигрировавшие клетки и окрашивали с использованием красителя Diff Quick 5 минут.

Адгезия. Адгезию клонов 3T3 фибробластов, постоянно экспрессирующих KRP, измеряли по методу (Arefieva et al, 2001). В качестве контроля использовали исходные 3Т3 фибробласты и «mock»-клоны. Клетки выращивали до 80-90% конфлюэнтного монослоя, после чего выдерживали сутки в ДМЕМ с 0.5% ЭТС. 96-луночные планшеты предварительно покрывали раствором коллагена I типа. В каждую ячейку вносили ДМЕМ с 10% ЭТС (200 мкл), и затем по 50000 клеток. Адгезию клеток проводили 40 минут при 37˚С. Неприкрепившиеся клетки смывали ФСБ, а клетки, оставшиеся на планшете, фиксировали 96% этанолом 5 минут и окрашивали 20 минут красителем Гематоксилин-Эозин.

Миграция клеток в «рану». Фибробласты выращивали до 95% конфлюэнтного монослоя и повреждали поверхность клеточного слоя скребком толщиной 0.5 мм. Клетки оставляли в инкубаторе при 37˚С и 5% СО₂. За миграцией клеток в «царапину» следили, фотографируя изображения царапины через 24-часовые интервалы после повреждения клеточного слоя, используя микроскоп Zeiss Axiovert 200M (Оберховен, Германия), оснащенный AxioCam CCD камерой и программным обеспечением Axiovision v. 3.1. В качестве контроля сравнения использовали свежую «царапину».

Экстракция растворимого миозина из клеток Тритоном Х-100. Фибробласты выращивали до монослоя, промывали ФСБ и экстрагировали растворимый миозин 10 минут при +4º С в растворе ФСБ, с добавлением 0.2% Тритона X-100, 1 mM ванадата натрия и 0.02% смеси ингибиторов протеаз (Roche, США). В экстракты добавляли двукратный буфер для образцов по Лэммли. Нерастворимые цитоскелетные фракции фибробластов, содержащие филаментный миозин, промывали ФСБ и растворяли в двукратном буфере для образцов по Лэммли. Затем препараты кипятили в течение 5 минут и хранили при -70º С.

Пермеабилизация гладких мышц taenia caeci под действием Тритона Х-100. Волокна taenia caeci вырезали из гладкомышечного слоя ободочного кишечника морской свинки, препарировали и монтировали в изометрическом режиме в растворе, содержащем 118 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1.2 мМ Na₂HPO₄, 1.2 мМ MgCl₂, 1.6 мМ CaCl₂, 24 мМ Hepes pH 7.4, 10 мМ глюкозы. Затем волокна инкубировали 30 минут в растворе 1 (20 мМ имидазол pH 7.4, 5 мМ EGTA, 50 мМ KCl, 150 мМ сахароза, 2 мМ ДТТ) при +4˚С при перемешивании. Далее их переводили в раствор 2 для пермеабилизации (скинирования), приготовленный на растворе 1 с добавлением 1% Тритона Х-100, и выдерживали 4 часа при +4˚С при перемешивании. Затем волокна промывали раствором 1 и переводили в раствор 3 для хранения (10 мМ имидазол pH 6.7, 3.75 мМ Na₂ATP, 5 мМ MgCl₂, 2 мМ EGTA, 0.5 мМ NaN₃, 50% глицерол, 2 мМ ДТТ) и инкубировали в течение 15 минут при тех же условиях. Волокна хранили в растворе 3 две-три недели при -20˚ С.

Измерение сократительной активности taenia caeci. Пермеабилизованные Тритоном Х-100 волокна (200 мкм/5 мм) закрепляли в изометрическом датчике, помещали в камеры объемом 200-1000 мкл с релаксирующим раствором (20 мМ имидазол pH 6.7, 7.5 мМ Na₂ATP, 10 мМ MgCl₂, 4 мМ EGTA, 1 мМ NaN₃, креатинкиназу 140 ед/мл, 10 мМ креатинфосфат, 1 мкМ лейпептин, 2 мМ ДТТ, 0.5 мкМ кальмодуллин), растягивали до развития необходимого потенциала и уравновешивали 15-20 минут. Силу сокращения двух препаратов регистрировали одновременно в двух камерах с помощью изометрических тензодатчиков, оснащенных трансдьюсерами KG7 (Scientific Instruments, Германия) при комнатной температуре. Регистрацию и анализ данных проводили с помощью программного обеспечения Real View v 7.0. Контрольный сократительный ответ вызывали добавлением Ca²⁺-содержащего раствора (pCa 4.54), после чего отмывали волокна релаксирующим раствором до базального уровня. Затем волокна инкубировали с 0.32 мг/мл KRP (30 мкМ) или с его фильтратом (см. выше) в течение 3 часов и стимулировали сокращение гладкомышечных волокон добавлением 10 мкМ микроцистина.

Приготовление препаратов волокон для конфокальной микроскопии. Скинированные волокна taenia caeci фиксировали изометрически и инкубировали с 30 мкМ меченым 5’ – TMRIA KRP (см. выше) в течение 1.5 часов в темноте при комнатной температуре. После этого волокна фиксировали в 4% параформальдегиде, отмывали несколько раз ФСБ и закрепляли на предметных стеклах. Иммунофлуоресцентный сигнал визуализировали при длине волны =560 нм с помощью конфокального микроскопа Zeiss (Германия).

Количественная обработка изображений и статистический анализ. Гели, окрашенные Кумасси R-250, иммуноблоты и мембраны после миграции фибробластов сканировали с помощью сканера Hewlett-Packard HP-IIcx. 96-луночные планшеты после адгезии фотографировали при помощи трансиллюминатора Т 2201 (Sigma, США), оснащенного камерой Kodak и обрабатывали изображение с использованием программы Kodak Digital Science. Для денситометрического и статистического анализов использовали программное обеспечение NIH Image и Microsoft Excel v 5.0 / GraphPad Prism v. 4.0, соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние KRP на сократимость скинированных гладких мышц.

Сократительный аппарат гладких мышц имеет упорядоченное строение, поскольку основной его задачей является обеспечение сокращения. В этой системе миозин II постоянно находится в филаментарном (полимерном) состоянии. Поэтому в гладких мышцах действие KRP на миозин II связано, в основном, с регуляцией его моторной и сократительной активности. Применение модели скинированных гладких мышц, в которой возможна замена эндогенного KRP на экзогенный белок, позволяет селективно исследовать именно этот аспект внутриклеточного действия KRP.

KRP подавляет Ca²⁺-независимое сокращение и фосфорилирование РЛЦ миозина за счет связывания с миозином. KRP рассматривают как негативный регулятор сокращения гладких мышц и фосфорилирования РЛЦ миозина (Silver et al, 1997, Wu et al, 1998, Walker et al, 2001, Choudhury et al, 2004, Sobiezhek et al, 2004). Однако механизм действия этого белка в гладкой мускулатуре до конца не определен. Известно, что в условиях in vitro KRP связывается своей С-концевой областью с миозином и препятствует фосфорилированию остатка Ser¹⁹ РЛЦ миозина (Silver et al, 1997, Щербакова, 2006). Для того, чтобы проверить реализуется ли этот механизм в гладкой мускулатуре, мы исследовали влияние KRP и его делеционного мутанта, лишенного С-концевого фрагмента (СKRP), на Ca²⁺-независимое сокращение гладких мышц при полном ингибировании ФЛЦМ под действием микроцистина. В таких условиях сократительный ответ мыщцы и стационарный уровень фосфорилирования РЛЦ обеспечиваются исключительно за счет фосфорилирования миозина под действием РЛЦ-киназ, отличных от КЛЦМ (см. ниже, рис. 2).

Гладкомышечные волокна taenia caeci были предварительно пермеабилизованы Тритоном Х-100, в результате чего эндогенный KRP полностью диффундировал из ткани. Прединкубация таких волокон с экзогенным KRP приводила к появлению выраженной лаг-фазы в ходе развития Ca²⁺-независимого сокращения, вызванного добавлением микроцистина (см. рис.1А, зеленая кривая) по сравнению с контрольным сокращением (розовая кривая). В отличие от полноразмерного белка, СKRP не оказывал ингибирующего действия на Ca²⁺-независимое сокращение (голубая кривая) в присутствии микроцистина.

Рис.1. KRP ингибирует Ca²⁺-независимое сокращение гладких мышц и фосфорилирование РЛЦ миозина, вызванные добавлением микроцистина. А, - скинированные волокна прединкубировали с 30 мкМ KRP, СKRP или фильтратом в релаксирующем растворе 3 часа, затем инициировали сокращение добавлением 10 мкМ микроцистина. Субмаксимальное сокращение определяли добавлением раствора с pCa 4.54. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, n=7, Б, - скинированные волокна прединкубировали с 30 мкМ KRP, СKRP или фильтратом в релаксирующем растворе 3 часа, инициировали сокращение добавлением 10 мкМ микроцистина и фиксировали на 25 минуте сокращения, как описано в «Материалах и методах исследования». Затем экстракты волокон подвергали мочевинно-глицерольному электрофорезу. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, n=8, *p<0.05.
Внедрение KRP в пермеабилизованные волокна вызывало достоверное снижение уровня фосфорилирования РЛЦ миозина на ранних этапах развития сокращения, в то время как СKRP не изменял уровня фосфорилирования РЛЦ по сравнению с контролем (см. рис. 1Б). Следует отметить, что и KRP, и СKRP обнаруживались в экстрактах taenia caeci после прединкубации с этими белками с помощью специфических антител к KRP, а конфокальная микроскопия препаратов волокон, прединкубированных с KRP и СKRP, мечеными 5-TMRIA выявила равномерное распределение этих белков в ткани (данные не представлены).

Таким образом, в этой системе KRP связывается с миозином за счет С-концевой последовательности, ингибирует Ca²⁺-независимое фосфорилирование РЛЦ миозина и развитие сокращения гладких мышц.

ZIP-киназа и ILK могут фосфорилировать РЛЦ миозина в присутствии микроцистина. Для того чтобы выяснить, какие протеинкиназы опосредуют Ca²⁺-независимое сокращение и фосфорилирование РЛЦ миозина в присутствии микроцистина, мы использовали специфические ингибиторы КЛЦМ и Rho-киназы вортманнин и Y-27632, соответственно, а также неспецифический ингибитор всех протеинкиназ стауроспорин. В этих экспериментах только стауроспорин достоверно блокировал развитие Ca²⁺-независимого сокращения в присутствии микроцистина (см.рис 2А).
Рис.2. Zip-киназа и ILK, вероятно, опосредуют Ca²⁺-независимое сокращение и фосфорилирование РЛЦ, вызванное добавлением микроцистина. A, - Волокна подвергали контрольному сокращению как описано в «Материалах и методах исследования», прединкубировали с 10 мкМ вортманином (зеленая кривая), или 10 мкм Y-27632 (красная кривая), или 2 мкМ стауроспорином (синяя кривая), или ДМСО (черная кривая) в течение 15 минут и стимулировали сокращение добавлением 10 мкМ микроцистина. Б, - Содержание Zip-киназы и ILK в taenia caeci до (1) и после (2) пермеабилизации Тритоном Х-100.
Поскольку КЛЦМ и Rho-киназа выходят из волокон при скинировании (данные иммуноблоттинга не представлены), то полученные данные свидетельствуют о том, что сокращение, вызванное добавлением микроцистина, опосредуется Ca²⁺-независимыми протеинкиназами, отличными от КЛЦМ. Мы предположили, что эти ферменты могут быть представлены Zip-киназой и интегрин-ассоциированной киназой (ILK). Действительно, Zip-киназа и ILK детектировались в taenia caeci до и после пермеабилизации ткани с помощью специфических антител к этим белкам (см. рис. 2Б).

Таким образом, можно заключить, что в полном сократительном аппарате клетки KRP связывается с миозином и ингибирует фосфорилирование РЛЦ миозина, под действием разных протеинкиназ, что хорошо согласуется с результатами модельных исследований in vitro, согласно которым KRP затрудняет фосфорилирование РЛЦ миозина под действием КЛЦМ (Silver et al, 1997), а также DAP-киназы (Щербакова, 2006).

Изучение молекулярного механизма действия KRP на модели трансгенных фибробластов.

Цитоскелет немышечных клеток имеет более динамичное строение, чем сократительный аппарат гладких мышц. Большая часть миозина II немышечных клеток находится в растворимой форме. Поэтому в данной системе эффекты KRP могут быть связаны как с моторной активностью миозина II, так и с его структурной организацией. В связи с этим, мы изучили, как принудительная экспрессия KRP в системе немышечных клеток, в норме не экспрессирующих этот белок, повлияет на структуру и уровень фосфорилирования миозина II, а также как это отразится на функционировании двигательного аппарата клеток.

Характеристика трансгенных 3T3 фибробластов, стабильно экспрессирующих KRP. 3T3 фибробласты являются удобной моделью для исследования свойств KRP, поскольку обладают хорошо развитым цитоскелетом, яркой способностью к двигательным реакциям и в норме не экспрессируют этот белок. Мы создали трансгенные линии 3T3 фибробластов, стабильно экспрессирующие KRP и его делеционный мутант, лишенный С-концевого миозин-связывающего домена (СKRP), имеющие в своем составе myc-эпитоп. Нами было отобрано по три клона,

Рис.3. Содержание KRP(А) и СKRP(Б) в трансгенных клонах 3T3 фибробластов. Лизаты обозначенных на рисунке клонов 3T3 фибробластов анализировали специфическими антителами к ГАФД, KRP и myc-эпитопу.

экспрессирующих KRP (клоны К2, К3, К4) и СKRP (клоны С5, С6, C7), а также ложнотрансфицированный mock клон M1. Как показано на рис. 3, ни в исходных фибробластах, ни в контрольных mock клетках KRP не детектировался, тогда как остальные трансфектанты содержали различные, но сопоставимые количества KRP и СKRP. KRP и CKRP в этих клонах также детектировались антителами к myc-эпитопу, что свидетельствует о целостности белковых продуктов.

Наиболее вероятно, что немышечный миозин II является прямой мишенью KRP в клетке. Константа диссоциации KRP и миозина II in vitro составляет около 5-10 мкМ, тогда как для СKRP это значение существенно выше (45,5 мкМ) (Silver et al., 1997). Для эффективного взаимодействия этих белков в клетке необходимо, чтобы их концентрации находились по крайней мере в диапазоне константы диссоцииации их комплексов. Кроме того, во избежание артефактов, связанных со сверхэкспрессией белка, внутриклеточные концентрации KRP и СKRP должны быть сопоставимы с концентрацией миозина II, так как это наблюдается в клетках организма (Хапчаев и др., 2004). Поэтому мы определили внутриклеточные концентрации миозина II, KRP и СKRP во всех полученных линиях клеток. Как видно из результатов (см. табл.1), в полученных нами трансгенных фибробластах не происходит сверхэкспрессии KRP и СKRP, а их содержание (за исключением клона С6) соизмеримо с концентрацией миозина II.
Таблица 1. Цитоплазматические концентрации KRP и миозина и ожидаемое количество комплекса миозин-KRP в 3T3 фибробластах.

Клон	M1	K2	K3	K4	C5	C7	С6
KRP, мкМ	0	2,4 ± 0,3	2,1 ± 0,2	3,6 ± 0,4	2,1 ± 0,2	2,5 ± 0,2	0,60.3
Миозин II, мкМ	4,9 ± 1,5
Ожидаемый % миозина в комлексе с KRP *	0	15	10	21	3	4	0

Данные представлены как среднее значение (n=3)стандартное отклонение.

*). Теоретически рассчитанная доля внутриклеточного миозина (в %), образующего комплекс с KRP в клетках, принимая константы связывания KRP с миозином – 9.5 мкМ, СKRP с миозином – 45.5 мкМ (Silver et al., 1997), а также определенные экспериментально внутриклеточные концентрации этих белков.
Теоретический расчет показывает, что в разных клонах 10-20% внутриклеточного миозина II может формировать комплекс с KRP (табл.1). При этом теоретическое количество комплекса СKRP-миозин в трансгенных фибробластах крайне мало. Таким образом, полученные результаты позволяют предпожить, что в созданной нами трансгенной системе KRP, в отличие от СKRP, может взаимодействовать с миозином II и влиять на его функциональное состояние.

Рис.4. KRP ингибирует фосфорилирование РЛЦ миозина в трансгенных 3T3 фибробластах. А, - иммуноблот лизатов 3T3-mock (M1) и 3T3-KRP (K4) фибробластов после мочевинно-глицерольного электрофореза. Для определения положения фосфорилированных РЛЦ миозина в геле использовали лизат фибробластов, стимулированных 30% ЭТС (маркер). Б, - лизаты клеток обозначенных на рисунке клонов фибробластов анализировали антителами к фосфорилированному Ser-19 РЛЦ и суммарным РЛЦ.

Данные представлены как среднее  стандартное отклонение (n=15), *p<0.05.

KRP ингибирует фосфорилирование РЛЦ миозина в трансгенных фибробластах. Мы измерили степень фосфорилирования РЛЦ миозина в исходных фибробластах, 3T3-mock и 3T3-KRP фибробластах методом мочевинно-глицерольного электрофореза, позволяющим разделить нефосфорилированные формы РЛЦ от моно- и дифосфорилированных. Оказалось, что доля фосфорилированного миозина в фибробластах невелика и представлена только монофосфорилированной формой. В контрольных клетках доля этой формы составила 20.8%, тогда как в фибробластах, экспрессирующих KRP, она была значительно снижена (см. рис.4А, 2, 3). В связи с тем, что низкая чувствительность этого метода не позволила нам установить эту величину, для ее определения мы использовали более точный в количественном отношении метод, - иммунодетекцию с использованием фосфоспецифических антител против Ser-19 (рис.4Б). Было обнаружено, что уровень фосфорилирования Ser-19 РЛЦ во всех клонах фибробластов, экспрессирующих KRP, был приблизительно на 60% ниже, чем в контрольных клетках и достоверно от них отличался. Таким образом, экспрессия KRP в 3T3 фибробластах приводит к уменьшению степени фосфорилирования РЛЦ с 20.8% до 9% от общего пула миозина II. Следует отметить, что принудительная экспрессия KRP в 3T3 фибробластах не изменяла содержания основных белков-регуляторов фосфорилирования миозина II, таких как КЛЦМ, Rho-киназа и ФЛЦМ (данные не представлены). Это позволяет считать, что влияние KRP на фосфорилирование РЛЦ связано только с экспрессией этого белка. В фибробластах, экспрессирующих СKRP, уровень фосфорилирования РЛЦ миозина был близок к таковому у контрольных клеток (см. рис. 4Б). Это означает, что С-концевая последовательность KRP вносит существенный вклад в ингибирующий эффект KRP на фосфорилирование РЛЦ миозина в фибробластах. Тем не менее, величина ингибирующего эффекта KRP на фосфорилирование РЛЦ миозина более чем в 2 раза превышает теоретическое значение комплекса миозин-KRP (см. табл.1). Это может указывать на реализацию дополнительных механизмов действия KRP в контексте живой клетки, функционирующих независимо от его С-концевой последовательности. Мы предполагаем, что один из таких механизмов связан с фосфорилированием N-концевой области KRP (Щербакова, 2006).

Таким образом, можно сказать, что в трансгенных фибробластах KRP подавляет фосфорилирование РЛЦ миозина так же как и в других модельных системах (условия in vitro, скинированные гладкие мышцы) и его С-концевая миозин-связывающая последовательность играет в этом процессе значительную роль.

KRP увеличивает содержание полимерного миозина в трансгенных фибробластах. Из данных in vitro известно, что взаимодействие KRP и миозина II приводит не только к подавлению фосфорилирования РЛЦ миозина, но и к усилению его полимеризации в филаменты (Shirinsky et al, 1993). Для определения доли внутриклеточного миозина, находящегося в филаментах, мы использовали свойство мономерного, но не полимерного миозина растворяться под действием Тритона Х-100.

Рис.5. KRP увеличивает долю филаментного миозина в 3T3 фибробластах. 3Т3-mock (M1) и 3T3-KRP (K4) фибробласты фракционировали Тритоном Х-100 как описано в «Материалах и методах». Раство-римые (р) и нерастворимые (н\р) фракции анализи-ровали антителами к немышечному миозину IIВ.
В серии экспериментов мы показали, что содержание филаментарного миозина IIB, который в основном представляет миозин II в 3T3 фибробластах (Meshel et al, 2005), в нерастворимой Тритоном Х-100 субклеточной фракции клонов K2 и К4 было на 15-20% выше по сравнению с таковым в 3Т3 фибробластах и контрольных mock клетках. Вместе с тем, в фибробластах, экспрессирующих СKRP, мы не обнаружили увеличения доли филаментного миозина (см. рис.5 и табл.2).

Важно заметить, что определенный экспериментально прирост доли филаментарного миозина в клетках, экспрессирующих KRP, соответствует ожидаемому содержанию комплекса миозин-KRP (см. табл 1, 2). Это означает, что эффект KRP на полимеризацию миозина в трансгенных фибробластах зависит от концентрации комплекса миозин-KRP, что подтверждает функциональность взаимодействия этих белков в этой системе. Отсутствие соответствующего эффекта в случае 3T3-СKRP фибробластов согласуется с теоретически рассчитанным крайне низким количеством комплекса миозин-СKRP. Следовательно, можно заключить, что, как и в условиях in vitro, в трансгенных клетках KRP увеличивает количество филаментного миозина благодаря связыванию с миозином своей С-концевой последовательности.

Таким образом, в созданной нами системе трансгенных клеток KRP взаимодействует с миозином II и регулирует его структурно-функциональное состояние. С одной стороны, он увеличивает долю филаментного миозина, а с другой стороны снижает фосфорилирование РЛЦ миозина и его моторную активность. Чтобы выявить какой из этих компонентов играет более значимую роль для двигательной активности клеток, мы сравнили контрольные и KRP содержащие клетки в двух основных двигательных тестах –их миграции и адгезии.
Таблица 2 Доля полимерного миозина в трансгенных фибробластах.

название клона	растворимая фракция (мономерный миозин)	нерастворимая фракция (филаментарный миозин)	прирост доли миозина IIB в филаментах
M1	57 ± 6.3 %	43 ± 3.5%	0
K2	42 ± 3.8%	58 ± 4.2%	15
K4	36 ± 4.1%	64 ± 3.7%	21
C7	58 ±4.5%	42 ± 3.5%	0

Данные представлены как среднеестандартное отклонение, n=3.

KRP активирует двигательную активность 3T3 фибробластов. Мы протестировали исходные фибробласты, 3Т3-mock и 3T3-KRP на скорость адгезии (рис. 6А), хемотаксиса в камере Бойдена (рис. 6Б), а также миграции клеток в «рану» (рис. 6В). Было обнаружено, что фибробласты, экспрессирующие KRP, адгезировали на 20-40%, а мигрировали в камере Бойдена на 40-60% быстрее в зависимости от клона по сравнению с контрольными и mock-клетками, которые проявляли одинаковую активность, что говорит об отсутствии клоногенных эффектов. 3T3-KRP фибробласты были более активны и при миграции в «рану» (рис. 6В). В отдельной серии экспериментов мы определили скорость миграции фибробластов, содержащих CKRP, в камере Бойдена. Оказалось, что эти клетки мигрируют только на 10% быстрее, чем контрольные фибробласты, и на 40% медленнее, чем клетки, содержащие полноразмерный белок (данные не представлены). С одной стороны, это свидетельствует о том, что С-концевая последовательность KRP играет ключевую роль в активации движения клетки. С другой стороны, наличие слабого, но достоверного стимулирующего эффекта CKRP на миграцию клеток может указывать на существование дополнительного механизма действия KRP, связанного с фосфорилированием N-концевой области KRP. Очевидно, что для его изучения необходимо проведение дополнительных исследований.

Рис.6. KRP стимулирует двигательную активность трансгенных 3T3 фибробластов. А, - влияние KRP на адгезию, n=15, *p<0.01 по сравнению с 3T3 и М1, Б,- влияние KRP на хемотаксис в камере Бойдена, n=17,* p<0.01 по сравнению с 3T3 и M1, В, - миграция 3T3-mock (M1) и 3T3-KRP (K4) в «рану».
Таким образом, фибробласты, обладающие пониженным уровнем фосфорилирования, но увеличенным количеством филаментного миозина, более активны в различных двигательных реакциях. Эти данные указывают на важность структурной составляющей активности миозина в двигательной активности клеток. Далее мы попытались локализовать эффект KRP в клетке, базируясь на данных о пространственной регуляции миозина КЛЦМ, Zip-киназой и Rho-киназой.

Эффекты KRP в клетке связаны с миозином, регулируемым КЛЦМ / Zip-киназой. Недавно было показано, что КЛЦМ фосфорилирует миозин II в переферической, а Rho-киназа – в центральной зоне клетки (Totsukawa et al, 2000, 2004, Katoh et al, 1997), тогда как Zip-киназа фосфорилирует миозин независимо от его локализации в клетке (Komatsu and Ikebe, 2004). Мы сравнили эффекты селективных ингибиторов Rho-киназы Y-27632, а также КЛЦМ и Zip-киназы ML-7 на уровень фосфорилирования Ser¹⁹ РЛЦ миозина в 3T3-mock и 3T3-KRP фибробластах (рис. 7).

Рис.7. Влияние Y-27632 (А) и ML-7 (Б) на уровень фосфорилирования РЛЦ миозина в 3T3-mock (M1) и 3T3-KRP (K4). 3T3-mock и 3T3-KRP фибробласты выдерживали с 10 мкМ Y-27632 или ML-7 в течение 1.5 или 2.5 часов, соответственно. Затем измеряли уровень фосфорилирования РЛЦ миозина с помощью фосфоспецифических антител к Ser-19 и тотальным РЛЦ, n=4.
В клетках mock клона М1, Y-27632 и ML-7 подавляли фосфорилирование РЛЦ на 40% и 60%, соответственно. В 3T3-KRP фибробластах, где фосфорилирование миозина было уже снижено примерно на 50%, только Y-27632 снижал фосфорилирование РЛЦ еще на 20%, в то время как ML-7 не имел достоверного эффекта.

Полученные результаты могут означать, что функциональной мишенью KRP является миозин, регулируемый КЛЦМ и, возможно, Zip-киназой, и который, по данным других авторов, расположен на периферии клетки. При этом KRP не влияет на фосфорилирование миозина, регулируемого Rho-киназой и локализованного в центре клетки. Однако возможна и другая интерпретация этих результатов. По последним данным, КЛЦМ и Zip-киназа являются основными киназами, прямо фосфорилирующими миозин в фибробластах (Totsukawa et al, 2004, Komatsu and Ikebe, 2004), тогда как Rho-киназа влияет на уровень фосфорилирования миозина в этих клетках опосредовано, а именно путем подавления активности ФЛЦМ (Amano et al, 1996). Возможно, что KRP ингибирует только прямое фосфорилирование миозина, но не влияет на процесс его дефосфорилирования. Эти данные согласуются с результатами, полученными нами в модельной системе скинированных гладких мышщ, а также с результатами экспериментов in vitro (Silver et al, 1997, Щербакова, 2006).

Эффект KRP на двигательную активность фибробластов при ингибировании Rho-киназы, КЛЦМ и Zip-киназы. Аналогично, мы проанализировали миграционную активность в камере Бойдена исходных клеток, 3T3-mock и 3Т3-KRP фибробластов в условиях ингибирования этих протеинкиназ (см. рис. 8). Ингибирование КЛЦМ и Zip-киназы под действием ML-7 снижало подвижность контрольных клеток на 50%, но не влияло на скорость миграции 3T3-KRP фибробластов. Напротив, ингибитор Rho-киназы Y-27632 не изменял двигательной активности контрольных клеток, но подавлял скорость миграции 3T3-KRP фибробластов более чем в 2 раза.

Рис.8. Влияние Y-27632 и ML-7 на двигательную активность исходных 3T3, 3T3-mock (M1) и 3T3-KRP фибробластов (K4). Исходные 3T3, 3T3-mock и 3T3-KRP фибробласты, выращивали до 60-80% конфлюэтного монослоя, депривировали сутки в ДМЕМ c 0.5% ЭТС. Затем клетки выдерживали в присутствии 10 мкМ Y-27632 или ML-7 в ДМЕМ с 0.5% ЭТС в течение 1.5 или 2 часов и анализировали миграционную активность в камере Бойдена, как описано в «Материалах и методах исследования», n=4.

Мы предполагаем, что в процессе активного движения клетки основной смысл фосфорилирования миозина КЛЦМ и Zip-киназой на периферии клетки заключается в структуризации миозина в филаменты, но не активации его моторной функции. В условиях ингибирования ответственных за это киназ KRP «замещает» эффект фосфорилирования РЛЦ миозина, связываясь и полимеризуя миозин в филаменты. Это не только способствует сохранению двигательной активности клеток, но и приводит к ее увеличению, так как KRP-экспрессирующие клетки исходно содержат больше полимерного миозина, чем контрольные (см. табл. 2). Эти результаты не только подтверждают данные других авторов о том, что стабилизация олигомерного миозина на переферии клетки крайне важна для реализации ее движения (Verkhovsky et al, 1995, Honer, et al, 1987), но и указывают на нелинейный характер зависимости скорости миграции клетки от моторной (сократительной) активности миозина, которая определяется исключительно уровнем фосфорилирования его РЛЦ (см. также рис. 1). В пользу последнего утверждения ярко свидетельствует тот факт, что в то время как ингибирование Rho-киназы снижает уровень фосфорилирования миозина в клетках (см. рис. 7), скорость их миграции не изменяется (см. рис. 8). В то же время, совершенно очевидно, что некий критический уровень моторной активности миозина необходим для движения клетки, поскольку дальнейшее снижение степени фосфорилирования миозина до 4-5% (при ингибировании Rho-киназы в KRP-содержащих клетках, см. рис. 7) существенно подавляет их двигательную активность (рис. 8).

* * *

В целом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что моторная активность миозина II может не являться определяющим фактором скорости движения клетки. Искусственная структуризация миозина в филаменты за счет введения в клетку KRP показывает, что подвижность увеличивается даже при сниженном уровне фосфорилирования РЛЦ миозина (рис. 9). В то же время, моторная функция миозина и сократительная активность актомиозина прямо

Рис. 9. Ключевая роль структурной динамики миозина II в клеточной подвижности, установленная при сравнительном анализе функциональных эффектов KRP в системах немышечных клеток и гладких мышц (объяснения в тексте).
зависят от уровня фосфорилирования РЛЦ, что отвечает общепринятой концепции и подтверждается экспериментами в структурированной системе гладкомышечных волокон (рис. 9). Это означает, что структурная динамика миозина II в немышечных клетках является необходимым условием их двигательной активности.

ВЫВОДЫ

Получены линии трансгенных фибробластов, экспрессирующих KRP в концентрациях, сравнимых с содержанием миозина II. Уровень фосфорилирования РЛЦ миозина в этих клетках снижен вдвое, но содержание полимерного миозина повышено на 15-20% по сравнению с контрольными клетками.
По сравнению с контрольными, экспрессирующие KRP клетки обладают более высокой активностью в адгезии и миграции в различных тест-системах.
Ингибиторный анализ показывает, что KRP препятствует фосфорилированию РЛЦ миозина II под действием КЛЦМ и, возможно, ZIP-киназы, но не блокирует действия Rho-киназы на фосфорилирование РЛЦ миозина в клетках.
KRP ингибирует фосфорилирование РЛЦ миозина и развитие Са²⁺-независимого сокращения скинированных гладкомышечных волокон.
С-концевая миозин-связывающая последовательность необходима для внутриклеточного действия KRP. Сделан вывод о том, что наблюдаемые эффекты KRP обусловлены его прямым взаимодействием с миозином.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Серебряная Д.В., Щербакова О.В., Дуднакова Т.В., Ширинский В.П. и Воротников А.В. (2006) KRP/ телокин разнонаправленно регулирует филаментообразование и фосфорилирование легких цепей немышечного миозина II в фибробластах, Биофизика, 51, (5), 866-874.
А.В. Воротников, М.А. Крымский, А.Ю. Хапчаев, Д.В. Серебряная (2004) Сигнальные механизмы регуляции сократительной активности гладких мышц, Российский Физиологический Журнал, 90, 705-718.
D.V. Serebryanaya, A.B. Postnikov, S. Hilsdorf, L. Lubomirov, V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov, G.Pfitzer (2006) Kinase Related Protein (telokin) binds to myosin and inhibits phosphorylation of MLC₂₀and Ca²⁺- independent contraction of guinea pig taenia caeci skinned fibers, Abstracts of XXXVth European Muscle Conference, Heidelberg, Germany, J. Muscle Res. Cell Motil., 27 (5-7): 493-494.
D.V. Serebryanaya, A.B. Postnikov, S. Hilsdorf, L. Lubomirov, V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov, G.Pfitzer. (2006) Telokin (KRP) inhibits the phosphorylation of myosin regulatory chain and Ca²⁺-independent contraction of guinea pig taenia caeci skinned fibers., Abstracts of International Simposium “Biological Motility: basic research and practice”, Puschino, Russia, 36.
D.V. Serebryanaya, A.V. Chadin, I.M.Kulikova, O.V. Scherbakova, V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov (2006) Ectopic expression of KRP/telokin accelerates 3T3 fibroblast motility at low levels of myosin II regulatory light chain phosphorylation., Abstracts of International Simposium “Biological Motility: basic research and practice”, Puschino, Russia, 108.
I.M. Kulikova, O.V. Scherbakova, D.V. Serebryanaya, A. Yu. Khapchaev, V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov (2006) Contribution of the N- and C-termini of Kinase Related Protein (KRP) to myosin activation and fibroblast motility., Abstracts of International Simposium “Biological Motility: basic research and practice”, Puschino, Russia, 81.

D.V. Serebryanaya, I.M. Kulikova, V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov (2005) Ectopic expression of KRP/telokin augments 3T3 fibroblast motility at low level of myosin II light chain phosphorylation, Abstracts of XXXIVth European Muscle Conference, Debrecen, Hungary, J. Muscle Res. Cell Motil., 26 (1): 79.

Куликова И.М., Серебряная Д.В., Воротников А.В., (2005) Влияние белка KRP на актомиозин-зависимые двигательные реакции 3T3 фибробластов, Материалы XII конференции “Ломоносов-2005”, Москва, Россия.

D.V. Serebryanaya, VP Shirinsky and AV Vorotnikov (2004) Generation of recombinant adenoviruses to study the physiological function of Kinase Related Protein. Abstracts of the International Simposium “Biological Motility”, Puschino, Russia, 100-101.

жүктеу/скачать 301.64 Kb.

Достарыңызбен бөлісу: