Қазақстан республикасы білім және ғылым министірлігі

Материалы Второго научного форума молодых ученых

«Биотехнология XXI века» 21-23 апреля 2011 года

АСТАНА 2011
УДК 378

ББК 74.58

Ж 63
Жалпы редакцияны басқарған з.ғ.д., профессор Б.Ж. Әбдрірайым.

Под редакцией д.ю.н., профессора Б.Ж. Әбдрірайым.

Р.I. Берсимбай, Р.Т. Омаров, Н.Л. Шапекова, З.А. Аликулов, Т.Д. Укбаева

«XXI ғасыр Биотехнологиясы» жас ғалымдардың екінші ғылыми форумының материалдар жинағы.
Астана, Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университеті, 2011.
Сборник материалов Второго научного форума молодых ученых

«Биотехнология XXI века».

УДК 616:575

S. Adambekov^1,2, S. Rakhimova¹, R. Omarov², E. Ramankulov¹

The frequency and severity of DMD makes it a primary object for medical and social concern in the developed countries. Organisations such as Muscular Dystrophy Campaign (UK), the Muscular Dystrophy Association (USA) and the Association Française contre les Myopathies are devoted to help such patients and to raise public awareness on DMD.

This report is on particular case of DMD in Kazakhstan. The patient is eighteen years old male. The patient was diagnosed with DMD in 2001. This case is a classical example, disease pathogenesis and progression could be followed through the case.

First symptoms were noticed when the patient was 4 years old. He could not keep up with his peers, could not run as fast, and rapidly became tired. At the age of 6 the patient was frequently accompanied by his mother due to the frequent falls. At the age of 9, the patient could not ascend the stairs, suffered from waddling gait and used his hands to rise from the bed. When the patient was 9, doctors started to suspect Duchenne muscular dystrophy as a diagnosis. At the age of 11 after the heat physiotherapy lost the ability to walk on his own, but has retained the ability to crawl. At the age of 12 the patient has became wheelchair dependant. Up to the present he slowly loses muscle strength and tonus. The diagnosis was confirmed by measuring creatinine kynase levels (5959 U/l) in 2003 and electromyography in 2002, which showed the signs of muscle damage. In 2011 the blood was extracted from the patient and his mother. The DNA extracted from the blood samples was sent to Laboratoire de biochimie et genetique moleculaire, France for genetic analysis to confirm DMD.

Currently, the patient is able to sit, but cannot stand, walk, crawl and turn. Muscle tonus is decreased, hypotrophy of upper limb girdle and lower extremities is observed. Contractures in elbow, knee and ankle joints are present. Active movements in legs are severely compromised. Tendon reflexes are absent. The patient cannot lift his hands into horizontal position. Sprengel’s deformity, lumbar hyperlordosis are present. The patient is wheelchair dependant. Intellect is intact. The patient expresses no current complaints on lung or heart problems.

Despite this being a classic case of DMD the diagnosis was not made until the patient was 9 year old. Due to the late diagnosis, the patient underwent inefficient or even harmful treatments that have worsened the patient’s condition. At the time there was no DMD specific testing available to confirm diagnosis.

Overall, the situation with this particular DMD patient is disturbing. It occurs that the doctors have no sufficient experience to deal with such a patient. Of course, DMD may be a rare disease in Kazakhstan, and the frequency of 1 case of DMD per 3500 males in all the world populations may have no relevance to the situation in Kazakhstan. But due to the high rate of spontaneous mutations in DMD gene, it is hard to believe that there are only a couple of DMD patients in Kazakhstan. The number of undiagnosed patients can be bigger. Estimation based on the statistics taken from other countries can approximate that there can be 2.5 thousand DMD patients in Kazakhstan. Taking this particular patient’s case as an example and taking into account the policy for DMD in the developed countries, we must conclude that the awareness of medical staff and overall population in Kazakhstan is insufficient to estimate the problem rising with muscular dystrophies and DMD in particular. However, the situation is improving. The genetic tests on DMD are already available in medical genetics laboratories in Kazakhstan. Our country is able to support such patients. The only thing left is to raise public and medical awareness on this severe disease. The governmental and social support of DMD patients, combined with the appropriate medical care could ease the sufferings of the people affected by this incurable condition.

Научный руководитель – д.б.н., профессор, Омаров Р.Т.

УДК: 614.2+575.191-616.1-006

Большое количество мутаций генов BRCA1/2 зарегистрировано в международной базе данных (BIC database) и ассоциировано с развитием РМЖ. Спектр мутаций генов BRCA1/2 охарактеризован не полностью, нет «mutational hot spot», мутации распределены по всему гену. Частота и тип мутаций варьируют широко, показывая различное географическое, и этническое распределение. К настоящему времени работ по изучению частоты, распространения таких мутаций среди казахстанской популяции женщин в литературе не встречалось. В Национальной научной лаборатории биотехнологии НЦБ проводится работа по изучению характера, частоты и распределения мутаций генов BRCA1/2 , а также полиморфизмов гена MTHFR у женщин c раком молочной железы и определение генетического риска в зависимости от генотипов данных и других генов во взаимосвязи с другими факторами риска заболевания. В данной работе целью исследования было определить частоту и распространение мутации генов BRCA1 и BRCA2 и полиморфизмов гена MTHFR у женщин с раком молочной железы в Казахстане.

Материлы и методы. В исследование были включены 156 женщин с гистологически верифицированным раком молочной железы, прооперированных в Онкологических Центрах г. Семей и г. Астаны. Контрольную группу составили 112 практически здоровых женщин, не имеющих рак какой-либо локализации, сопоставимых по возрасту. Все участники исследования дали письменное согласие на участие в исследовании и предоставление образцов крови. Геномную ДНК выделяли из цельной крови с помощью Wizard®Genomic DNA Purification kit, (Promega) согласно протоколу изготовителя. Для ПЦР амплификации всех экзонов генов BRCA1/2 , а также полиморфизма гена MTHFR 677C> T (rs1801133) были разработаны праймеры с использованием программы дизайна праймеров Primer3 (v.0.4.0). ПЦР реакция проводилась на «PTC-0240 DNA EngineTetrad2 Cycler» (BioRad, USA). Сиквенирование ДНК проводилось на ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) с использованием для сиквенс реакций BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Для статистического анализа использовали программу SPSS 16.0 (JAPAN).

Результаты. Возраст женщин с РМЖ варьировал от 35 лет до 78 лет, 18 женщин были в возрасте 45 лет и моложе. У 12 женщин был отягощенный семейный анамнез (наличие РМЖ или рака яичников среди родственников). Для первичного анализа мутаций были отобраны экзоны генов BRCA1/2, в которых наиболее часто встречаются мутации. Экзон 11 составляет 60% кодирующей поверхности гена BRCA1. Обнаружено четыре миссенс мутации - c.1067A> G (Q356R), c.2612C> T (P871L), c.3113A> G (E1038G), c.3348A> G (K1183R), два синонимичных полиморфизма - Ser694Ser и Leu771Leu в экзоне 11 гена BRCA1. В гене BRCA2 выявлено восемь миссенс мутаций и девять синонимичных полиморфизма. Не выявлено статистически достоверной разницы по частоте миссенс мутаций c.2612C>T (P871L) и c.3113A>G (E1038G) в группе больных по сравнению с группой контроля – 57.8% и 48.2%, 56.6% и 47.3% соответственно, за исключением c.3348A>G (K1183R), частота которой была значительно выше у женщин с РМЖ (59.0% vs 45.5%, p<0.05). Оба синонимичных полиморфизма Ser694Ser и Leu771Leu обнаружены с одинаковой частотой в группе больных 54.2% и группе контроля 42.8%.

Частота генотипов C677T/MTHFR у больных РМЖ составила 58,7% для СС, 33,3% для СТ, и 8,0% для ТТ , в контрольной группе 46,2% для СС, 47,2% для СТ, и 6,6% для ТТ. Аллель ТТ C677T/MTHFR была связана с повышенным риском рака молочной железы у женщин в постменопаузе (более 55 лет [OR, 1,34; 95% CI, 1.01-1.76]. Выявлено взаимодействие между аллелем Т и возрастом к моменту развития заболевания (р =0,03).

Это исследование показывает, что существует определенная взаимосвязь между возрастом возникновения РМЖ и минорной аллелью MTHFR 677C> T. Результаты нашего недавнего исследования показали, что полиморфизм C677T/MTHFR тесно связан с концентрацией гомоцистеина и низким уровнем фолиевой кислоты в казахской популяции (Akilzhanova и др., Asia Pac J Clin Nutr 2008; 17 (2): 325-9). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что фолиевая кислота участвует в развитии рака молочной железы, но механизмы сложные и окончательно не выяснены. Необходимы дальнейшие исследования для выявления связи между статусом фолиевой кислоты и риском развития РМЖ в зависимости от генотипа MTHFR 677 C> T и 1298A> C.

Таким образом, современные возможности молекулярной генетики и биологии позволяют проводить определение генетического риска развития РМЖ, выявлять критерии выделения групп риска развития заболевания, что в последующем позволит разработать профилактические меры для групп высокого риска.

УДК 575.16
РОЛЬ ГАЛЕКТИНОВ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ МЕЖДУ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТВОЛОВЫМИ И ИММУННЫМИ ЭФФЕКТОРНЫМИ КЛЕТКАМИ

Бекболсынов Д.А.^1,2, Огай В.Б.<sup>2

1</sup>Евразийский национальный университет, Астана, Казахстан

²РГП «Национальный центр биотехнологии» МОН РК, Астана, Казахстан

E.mail: bekbolsynov_da@enu.kz
Одной из основных причин, почему мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют интерес как терапевтические агенты в регенеративной медицине, является их способность неспецифически ингибировать реакции иммунного ответа. Многочисленные эскперименты in vitro и in vivo продемонстрировали значительное снижение скорости пролиферации Т-хелперов, В-клеток, созревания дендритных клеток и цитотоксичных лимфоцитов, а также апрегуляцию Т-reg клеток в присутствии МСК [1-3]. Однако, несмотря на интенсивные исследования, точные механизмы иммуномодуляторного эффекта МСК остаются невыясненными. В данной работе приводится краткий обзор недавних публикаций, которые впервые проливают свет на роль галектинов в МСК-индуцированной иммуносупрессии.

Человеческие МСК конститутивно экспрессируют галектины 1, 3, 8 и 9 [4]. С 2010 года, в литературе начали появляться сообщения о том, что блокирование экспрессии галектинов самым прямым образом сказывается на иммуносупрессорных свойствах МСК. Лепетели и коллеги наблюдали полное прекращение иммуносупрессии после обработки клеточной культуры антителами к галектниу-1 (gal-1) и семафорину 3А [5]. Гиесеке и коллеги получили похожие результаты методом нокдауна gal-1 ретровирусной трансфекцией, получив в результате частичное восстановление пролиферации CD4+ и CD8+ Т-клеток [6]. Сиауд и коллеги показали, что сайленсинг галектинов 1 и 3, являющихся поверхностными маркерами, методом РНК-интерференции сводит иммуносупрессивную способность МСК почти к нулю [7]. На фоне сообщений о том, что такие ранее известные медиаторы иммуносупрессии, как индоламин-2,3-диоксигеназа (ИДО), IL-10, TFG-β или HGF не всегда оказываются эссенциальными для МСК-индуцированной супрессии Т-лимфоцитов [4], можно предположить, что галектины в этом играют если не ключевую, то, по крайней мере, значительную роль.

Вовлеченность галектинов в регуляцию иммунитета известна довольно давно, равно как и широкая распространенность галектинов в других тканях. Однако, до сих пор нет данных специфично о роли галектинов, секретируемых МСК в этих процессах. Гил и соавторы сообщают, что интродукция экзогенного gal-1 в мышиную модель воспаления приводит к снижению миграционной способности и секреции про-инфламаторных цитокинов в лейкоцитах [8]. Если предположить, что экзогенный gal-1 in vivo может поступать из МСК, то это может частично объяснить их иммуномодуляторные свойства, тем более что недавние исследования выявили корреляцию между активацией TLR-2 в ответ на патоген-ассоциированные молекулы и экспрессией gal-3 в мезенхимальных стромальных клетках [9].

Интересно, что экспрессия индоламин-2,3-диоксигеназы, являющейся одним из доказанных медиаторов МСК-индуцированной иммуносупрессии, находится в зависимости от активации TLR, хотя природа этой зависимости остается туманной. В частности, Опитз и коллеги методом обратнотранскриптазной ПЦР в реальном времени установили наличие не менее 6 видов TLR на поверхности МСК, и показали, что прайминг TLR3 и TLR4 соответствующими лигандами приводит к значительному повышению их иммуносупрессивного потенциала, как минимум частично благодаря усиленной экспрессии ИДО [10]. Похожие результаты еще раньше были опубликованы также Певзнер-Фишером и коллегами [11]. Однако, более поздние исследования Уотерман и коллег указывают на то, что к усилению иммуносупрессии через активацию ИДО приводит только прайминг TLR3, в то время как активация TLR4, наоборот, приводит к формированию про-воспалительного фенотипа [12]. Такие неоднозначные результаты для исследований МСК не редкость. Проблема связи между разными видами TLR, присутствующими на поверхности МСК, и экспрессией ими галектинов еще ждет своего исследователя. Вероятно, экспрессия галектинов в МСК и воспалительный ответ на инфекционные агенты взаимно регулируются по принципу обратной связи.

Тем не менее, имеющиеся на данный момент данные о влиянии галектинов на эффекторные Т-клетки недостаточно для глубокого понимания механизмов МСК-индуцированной иммуносупрессии. Пока не известно, каков вклад в это gal-1 и, возможно, gal-3, секретируемых в межклеточную среду, и остальных галектинов, экспрессируемых внутриклеточно и, возможно, также влияющих на метаболизм ИДО, простагландина Е2, оксида азота, IL-10 и других эффекторных молекул, которые тоже оказывают ингибирующий эффект на созревание и пролиферацию Т- и В-клеток, дендритных клеток и натуральных киллеров. В настоящее время еще не было никаких исследований, направленных на выявление взаимосвязи между иммунными клетками и галектинами в МСК.
Литература

[1] C. Herrero and J.A. Pérez-Simón. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells. Braz J Med Biol Res, 43(5):425-430.

[2] Tyndall, A. et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells: a review based on an interdisciplinary meeting held at the Kennedy Institute of Rheumatology Division, London, UK, 31 October 2005. Arthritis Research & Therapy 2007, 9:301.

[3] Tatara, R. et al. Mesenchymal stromal cells inhibit Th17 but not regulatory T-cell differentiation. Cytotherapy. [Epub ahead of print].

[4] Sioud, M. New insights into mesenchymal stromal cell-mediated T-cell suppression through galectins. Scandinavian J Immunol. 73, 79-84.

[5] Lepelletier, Y., Lecourt, S., Renand, A., Arnulf, B. et al. Galectin-1 and semaphoring-3A are two soluble factors conferring T-cell immunosuppression to bone marrow mesenchymal stem cell. Stem Cells Dev. 2010 Jul;19(7):1075-9.

[6] Gieseke, F., Böhringer, R., Bussolari, R., Dominici, M., Handgretinger, R., Müller, I. Human multipotent mesenchymal stromal cells use galectin-1 to inhibit immune effector cells. Blood. 2010 Nov 11:116(19):3770-9.

[7] Sioud, M., Mobergslien, A., Boudabous, A. and Floisand, Y. Mesenchymal stem cell-mediated T cell suppression occurs through secreted galectins. Int J Oncol. 2011 Feb;38(2):385-90.

[8] Gil, C., Gullo, C. and Oliani, S. Effect of exogenous galectin-1 on leukocyte migration: modulation of cytokine levels and adhesion molecules. Int J Clin Pathol. 2011;4(1):74-84.

[9] Sioud, M., Mobergslien, A., Boudabous, A. and Floisand, Y. Evidence for the involvement of galectin-3 in mesenchymal stem cell suppression of allogeneic T-cell proliferation. Scandinavian J Immunol. 2010 Apr;71(4):267-274.

[10] Opitz, C. et al. Toll-Like Receptor Engagement Enhances the Immunosuppressive Properties of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells by Inducing Indoleamine-2,3-dioxygenase-1 via Interferon-b and Protein Kinase R. Stem Cells 2009;27:909–919.

[11] Pevsner-Fischer M, Morad V, Cohen-Sfady M, Rousso-Noori L, Zanin-Zhorov A, Cohen S, Cohen IR, Zipori D. Toll-like receptors and their ligands control mesenchymal stem cell functions. Blood.2007;109(4):1422–1432.

[12] Waterman RS, Tomchuck SL, Henkle SL, Betancourt AM (2010) A New Mesenchymal Stem Cell (MSC) Paradigm: Polarization into a Pro-Inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 Phenotype. PLoS ONE 5(4): e10088.

УДК 575.113

mTOR комплекс 2 (mTORC2) в своем составе имеет mTOR, рапамицин- нечувствительный спутник mTOR - rictor (rapamycin insensitive companion of mTOR), mLST8, mSIN1 (mammalian stress-activated protein kinase interacting protein , белок взаимодействующий со стресс-активируемой протеинкиназой 1 млекопитающих), protor 1 (protein observed with rictor-1, белок взаимодействующий с rictor-1), и deptor.

mTOR -серин-треониновая протеинкиназа семейства фосфатидилинозитол 3-киназ, играет важную роль в канцерогенезе. Однако механизм этого сложного и многоэтапного процесса до конца не изучен. Одним из важных методов исследования специфической роли mTOR в развитии раковых опухолей различного генеза является использование системы РНК-интерференции.
Для исследования функций mTOR комплексов нами был проведен генный нокдаун mTOR в двух типах клеточных линий - HEK 293Т и MDA-MB-435. Результаты эксперимента (рис.1 В) продемонстрировали как уменьшение количества клеток, вследствие апоптоза, так и изменение формы и клеточных размеров по сравнению с контролем (рис 1 А). Причиной последнего эффекта предположительно является ингибирование сигнального пути, опосредованного действием факторов роста, прежде всего инсулино подобного фактора роста (IGF). Как видно из рисунка 2, нокдаун mTOR приводит к снижению фосфорилирования киназы Akt, являющейся ключевым регулятором многих сигнальных путей, в том числе и mTOR сигналинга.

Предыдущие исследования показали, что для активации Akt необходимо фосфорилирование данной киназы по двум сайтам – Thr308 и Ser437. Вестерн-блотинг с применением анти-pAkt437 антител выявил ингибирование активности Akt в клетках, где наблюдается сайленсинг mTOR.