Биологические свойства и принципы идентификации культур группы b urkholderia cepacia 03. 00. 07 микробиология

ЛОБОЙКО Алексей Давидович

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Волгоград – 2008

Научный руководитель: засл. деятель науки РФ,

доктор медицинских наук,

профессор В.И. Илюхин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор О.Г. Крамарь

кандидат медицинских наук,

Е.В. Резников

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Саратовский государственный

медицинский университет»
Защита диссертации состоится «___»________ 2008 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.06 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» (400131, г.Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1).

Автореферат разослан «___ » ____________2008 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор социологических наук

доцент М.Д. Ковалева

Общая характеристика, актуальность проблемы

В род Burkholderia в настоящее время входят более 30 видов грамотрицательных глюкозу неферментирующих бактерий, подавляющее большинство которых являются свободноживущими почвенными и водными микроорганизмами. Для медицинской практики имеет значение идентификация и биологические свойства 3–х видов буркхольдерий: B.mallei и B. pseudomallei, являющихся возбудителями особо опасных инфекций (сапа и мелиоидоза), а также B. cepacia, способной в определенных условиях вызывать оппортунистические и нозокомиальные инфекции у больных с иммунодефицитным состоянием (Беляков, 1990).

1. Выявить фенотипические признаки, имеющие принципиальное значение для установления видовой принадлежности культур B. cepacia.

2. Отобрать тесты, необходимые для внутривидового типирования (эпидемиологических маркеров) штаммов B. cepacia.

3. Оценить диапазон чувствительности культур B. cepacia к антибактериальным препаратам с целью разработки терапевтических рекомендаций и создания селективных сред.

4. Разработать практическую схему лабораторной идентификации и дифференциации культур B. cepacia.
Научная новизна:

В результате исследования набора штаммов B. cepacia и филогенетически близких буркхольдерий отобраны основные фенотипические дифференциальные признаки и разработан алгоритм идентификации культур вида B. cepacia.

Показана перспективность использования иммунологических реакций (РДД, МФА), особенно на этапе предварительной идентификации.

Изучен спектр чувствительности штаммов B. cepacia к современным химиотерапевтическим препаратам, и даны рекомендации по их использованию в диагностических и лечебно-профилактических целях.

Выявлены фено– и генотипические признаки внутривидовой дифференциации штаммов B. cepacia как факторов эпидемиологического анализа. Приоритетность исследований подтверждается двумя патентами на изобретение, оформленными по материалам диссертационной работы.
Практическая значимость:

Разработана схема идентификации B. cepacia, позволяющая определять вид, геномовары и биовары в условиях клинической бактериологической лаборатории.

На основании изучения спектра чувствительности культур B. cepacia к антибактериальным препаратам, предложен набор антибиотиков, пригодных для химиотерапии и разработки селективных сред.

Материалы диссертационной работы использованы при подготовке «Методических рекомендаций по приготовлению и использованию питательной среды для дифференциальной диагностики патогенных и близкородственных буркхольдерий», утвержденных директором Волгоградского НИПЧИ В.В.Алексеевым 12.12.07 г.

Документация на оформление двух патентов зарегистрирована в Государственном реестре изобретений Российской Федерации: «Селективная среда для выделения возбудителя сапа», № 2007126294 от 12 июля 2007 г и «Штамм бактерий Burkholderia cepacia КМ 203-авирулентный продуцент бактериофага, лизирующего культуры возбудителя сапа», №2007126293 от 12 июля 2007 г. Штамм B. cepacia КМ 203 – авирулентный продуцент сапного бактериофага депонирован в государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» 27.12.06 г.
Положения, выносимые на защиту

1. Отобранные на основе изучения фенотипических свойств культур B. cepacia стабильные и вариабельные признаки позволили создать практическую схему идентификации с определением вида и биоваров штаммов B. cepacia.

2. Иммунологические методы диагностики (РДД и МФА) позволяют исключать или отрицать принадлежность культур к виду B. cepacia на стадии предварительной идентификации.

3. Изучение антибиотикочувствительности культур B. cepacia позволяет выявить препараты, рекомендуемые для лечения инфекций (карбапенемы, хинолоны, тетрациклины), а также применяемые при создании селективных сред (полимиксин В, гентамицин, ванкомицин).

4. Идентификация культур вида B. cepacia с помощью автоматических тест-систем (API 20 NE или NEFERM-test) позволяет с высокой степенью достоверности (>90%) установить видовую принадлежность исследуемых культур, однако с целью исключения гипердиагностики за счет филогенетически близких видов буркхольдерий, требует постановки дополнительных лабораторных тестов.

5. Принцип полифазной таксономии требует для окончательной идентификации штаммов B. cepacia комбинированного исследования культур с применением методов генотипического, фенотипического, серологического исследования, позволяющих в конечном итоге установить принадлежность культур не только к виду, но и к определенному био- или геномовару), что имеет важное значение для эпидемиологического анализа инфекций B. cepacia.

Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь,2007), на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007) а также на научных межлабораторных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в 2007, 2008 гг.

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, включая 2 патента.

Диссертация изложена на 123 листах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 194 источника, в том числе 47 отечественных и 147 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 8 рисунками.

В работе использовали 25 культур B. cepacia, собранных в коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Большая часть штаммов получена из научных учреждений России, Украины, Франции путем личной переписки, поэтому штаммы не всегда имеют полную характеристику не только фенотипических свойств, но и сведений о месте, времени выделения и способах идентификации. Штамм B. cepacia 1934 – атипичный, дефектный по LDC и протеазе. Штамм B. cepacia 25416 является референтным не только для вида, но и для всего рода Burkholderia, был выделен в 1950 г W.Burkholder из лука.

В сравнительных опытах по изучению селективности сред и ряда биологических свойств использовались 50 штаммов 18 гетерологичных видов, наиболее часто встречающихся в лабораторной медицинской практике. Из числа близкородственных буркхольдерий опыты ставили с B. pseudomallei 107 и VPA (авирулентные штаммы); B. thailandensis 264, 251, 295.

Для выращивания и поддержания культур B. cepacia использовали набор сред, широко применяемых при работе с буркхольдериями и псевдомонадами – триптиказо-соевый агар (бульон), мясо-пептонный агар (бульон). При оценке питательных потребностей (ауксограммы) отдельных штаммов использовали минимальную среду G.Gilardi.

Для выделения B. cepacia из внешней среды и клинического материала использовались селективные среды: среда Мак-Конки с добавлением 600000 ЕД/л полимиксина В и 10 мг/л гентамицина и BCSA с добавлением полимиксина В 600000 ЕД/л, гентамицина 10 мг/л, ванкомицина 10мг/л.

В исследованиях использовали температуру выращивания 37⁰С, кроме реакций, методика постановки которых требует иную величину температуры. Учет результатов осуществляли через 24 ч.

Все биохимические реакции проводились по общепринятым методикам (Илюхин с соавт., 1998; Сенина, 2004; Gilardi, 1976; Palleroni, 1984;).

При постановке пробы на луке наносили каплю культуры 10⁷ –10⁸ м.к. на интактные изолированные чешуйки лука или же на срез луковицы. Учет результатов проводили через 24 - 48 ч по методике, описанной Wigley P. и Burton N.E. (1999).

Для выявления продукции цепациацинов использовали 3 метода: двуслойный, штриховой и метод выращивания штаммов продуцентов в бульоне.

При изучении фагопродукции спектр литической активности фагов буркхольдерий выявляли на индикаторном газоне тест-штамма при посеве методом агаровых слоев по Грациа.

Иммунологические диагностические исследования проведены по стандартным методам, адаптированным к условиям работы с патогенными буркхольдериями (Илюхин с соавт., 1998).

Активность антибактериальных препаратов определяли двумя способами: методом кратных разведений в жидкой питательной среде и методом диффузии в агар (метод дисков).

При идентификации штаммов буркхольдерий по системе NEFERMtest 24 исследование проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору.

Идентификацию бактерий, относящихся к ГНФ типу, проводили с помощью системы API 20 NE. Принцип оценки этим методом заключается в определении кода по 21 качественному признаку, последние сгруппированы в 7 групп.

Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 25 мкл в микроцентрифужных пробирках (500 мкл). Реакционная смесь содержала: ДНК, специфические олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буфер и фермент Taq-полимеразу. На поверхность смеси наслаивали 30 мкл минерального масла. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды. Амплификацию ДНК проводили на программируемом термоциклере “Терцик” (НПФ ”ДНК-технология”, Москва) с использованием ”горячего старта”.

Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом гель-электрофореза в 1,5 % агарозном геле согласно рекомендациям, изложенным в руководстве Т.Маниатиса с соавт. (1984).

При изучении вирулентности различных по источнику выделения штаммов B. cepacia использовали два вида лабораторных животных – белых мышей и золотистых хомячков. Заражение проводили как интактных животных, так и предварительно обработанных иммунодепрессантами (гидрокортизон, актиномицин Д, четыреххлористый углерод и ацетат свинца), которые существенно повышают чувствительность животных к ряду инфекций. Дозы и время введения иммунодепрессантов – гидрокортизон 5 мг за 3 ч до заражения; ацетат свинца 5 мг одновременно; четыреххлористый углерод 0,2 мл за 48 ч; актиномицин Д – 25 мкг одновременно; все препараты вводили подкожно в область бедра.

Результаты исследований и их обсуждение

Культуры B. cepacia отличаются неприхотливостью роста и успешно культивируются на большинстве широко используемых в лабораторной практике питательных сред. На плотных средах культуры B. cepacia через 24 ч культивирования при 37⁰С формируют гладкие полупрозрачные колонии, которые через 48 ч достигают размеров 2 - 3 мм светло-коричневого или бежевого цвета. В бульоне через сутки отмечается помутнение культур, на поверхности – тонкая пленка, через 48 ч – на поверхности плотная кремового цвета пленка, бульон мутный, отмечается придонный рыхлый осадок.

При окрашивании по Граму видны розовые, палочковидные бактерии. По размерам и цвету, бактерии B. cepacia не имеют отличий от других видов грамотрицательных бактерий (псевдомонады, эшерихии и т.п.).

Наряду с морфологическими признаками колоний и клеток B. cepacia, биохимическая активность культур, выявляемых в специальных тестах, является основой разработанных в настоящее время диагностических схем и ключей идентификации бактерий, включая и вид B. cepacia. На основе полученных нами данных и анализа литературных данных, составлена сводная таблица фенотипических свойств буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике. Обращают на себя внимание как обязательные положительные тесты для установления видовой принадлежности культур к виду B. cepacia оксидазная реакция и окисление, но не ферментация глюкозы, а также наличие лизиндекарбоксилазы и бета-галактозидазы. При этом отрицательными должны быть тесты на аргининдигидролазу, окисление рамнозы и способность образовывать газообразные продукты в тесте на денитрификацию (табл. 1).

Примечания: + и - обозначают наличие или отсутствие признака у ≥90%

штаммов данного вида; +/- - замедленная реакция;

R – резистентность; S – чувствительность к антибиотикам

При проведении серологических исследований в диагностических иммунологических реакциях считается вполне пригодной реакция преципитации в геле по Оухтерлони, где в качестве антигена используется густая взвесь (≥ 5х10⁹ м.к./мл) живой культуры испытуемого штамма. В наших опытах мы использовали для РДД преципитирующую сыворотку, полученную к ацетонвысушенным клеткам референтного штамма B. cepacia 25416. Титр сыворотки к гомологичной культуре в качестве антигена составлял 1:32. При постановке РДД со всеми штаммами B. cepacia и гетерологичными видами буркхольдерий установлено формирование многочисленных полос преципитатов с типичными культурами B. cepacia и формирование 1 или 2 минорных линий с близкородственными видами буркхольдерий. С гетерологичными видами других родов, особенно с культурами микрофлоры из внешней среды (почва, водоемы) формирование преципитатов в РДД с сывороткой B. cepacia не отмечалось.

При проведении оценки возможности использования МФА для диагностики B. cepacia, на основе преципитирующей гипериммунной кроличьей сыворотки были получены иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие к антигенам B. cepacia. Для идентификации микроорганизмов использовали мазки-препараты изучаемых культур в концентрации 5х10⁸ м.к./мл по ОСО мутности. Было показано, что МФА позволяет идентифицировать все типичные штаммы B. cepacia при полном отсутствии ложно позитивных случаев идентификации близкородственных буркхольдерий и гетерологичных видов микроорганизмов. Отрицательные результаты в МФА получены с 7 музейными штаммами B.cepacia, которые по фенотипическим признакам не соответствовали критериям соответствия виду B. cepacia.

Определение чувствительности штаммов B. cepacia к антибиотикам и сульфаниламидным препаратам имеет значение, как для назначения адекватной терапии, так и в диагностических целях. Известно, что для буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике, характерна высокая природная

Таблица 2. Чувствительность штаммов B. cepacia к химиотерапевтическим препаратам в методе серийных разведений

Антибактериальные Препараты	МПК50	S-R интервал	Показатели Чувствительности
Амоксиклав	64	6 – 24	R
Ванкомицин	>128	>128	R
Гентамицин	64	4 – 16	R
Доксициклин	16	4 – 6	R(I)
Имипенем	8	4 – 16	I
Канамицин	16	8 – 16	R(I)
Ко-тримаксазол	4	40 – 80	S
Ломефлоксацин	2	2 – 8	I(S)
Меропенем	4	4 – 16	I(S)
Офлоксацин	2	2 – 8	I(S)
Пиперациллин	8	16 – 64	S
Полимиксин В	>128	>128	R
Рифампицин	8	4 – 16	I
Спарфлоксацин	2	1 – 2	R(I)
Сульфаметоксазол	32	100 – 350	S
Хлорамфеникол	16	8 – 32	I
Цефепим	8	8 – 32	I(S)
Цефтазидим	2	8 – 32	S
Цефтриаксон	4	8 – 64	S
Ципрофлоксацин	1	1 – 4	I(S)

Примечания: цифровой материал выражен в мкг/мл; МПК₅₀ – медиана 25 показателей; S – R интервал определен по МУК 4.2.1890-04;

R, S, I – резистентный, чувствительный, промежуточный тип устойчивости, соответственно

устойчивость к пенициллинам, полимиксинам и аминогликозидам. Препараты этих типов антибиотиков включаются в селективные и транспортные среды для выделения буркхольдерий из клинического материала и внешней среды.

При оценке чувствительности штаммов B. cepacia имеющиеся в нашем распоряжении штаммы в большинстве своем резистентны или имеют умеренную чувствительность к препаратам, рекомендуемым при лечении заболеваний, вызываемых буркхольдериями и псевдомонадами (табл. 2).

При выделении бактериоцинов двуслойным методом в перекрестном изучении бактериоцинопродукции всех имеющихся у нас штаммов B. cepacia было установлено, что самый чувствительный штамм B. cepacia 3181. Он чувствителен ко многим штаммам-продуцентам бактериоцинов. Самые активные штаммы-продуценты B. cepacia 8237 и 8238. B. cepacia 1934 не является ни штаммом-продуцентом бактериоцинов, ни чувствительным штаммом. Есть штаммы, чувствительные только к одному, двум штаммам-продуцентам (25416, 8235, 8236, 3189, 323, 423, 506, 122, 610, 620).

При изучении фагопродукции методом Грациа, было выявлено, что 6 штаммов B. cepacia (323, 370, 423, 8237, 8238, 8240) продуцируют литические фаги. Наиболее активной по литическому спектру была фагопродукция у штамма B. cepacia 8238, выявить универсальный индикаторный штамм среди имеющихся культур B. cepacia не удалось.

При изучении вирулентности различных по источнику выделения штаммов B. cepacia на двух видах лабораторных животных – белых мышах и золотистых хомячках показано, что на модели нормальных и иммунодепрессивных животных можно выявлять уровень вирулентности штаммов B.cepacia только при введении максимальных доз уровня 10⁹ м.к.

При постановке пробы на луке из 11 штаммов B. cepacia изменения в луковичной пластине были у 8 штаммов. Мацерации не было у B. cepacia 1934, 8239 и 8240. Наличие мацерации проверялось надавливанием пинцета на луковичную чешуйку. При положительной реакции, особенно выраженной у штамма B. cepacia 25416, по ходу мацерации отмечалась коричневая пигментация зоны поражения. E. coli K-12 служила отрицательным контролем.

Основным требованием при разработке схем и ключей при идентификации бактерий является отбор простых и воспроизводимых тестов, которые при своей постановке с культурами данного вида проявляют в ≥90 % случаев положительный или отрицательный результат. Дополнительными тестами при первичной идентификации культур B. cepacia могут служить иммунологические реакции при наличии видоспецифической сыворотки (РДД, МФА), а также постановка теста на антибиотикочувствительность с полимиксином В и аминогликозидами (гентамицин), к которым B. cepacia как и другие буркхольдерии в отличие от псевдомонад является резистентной.

При идентификации буркхольдерий по системе Nefermtest 24 было исследовано 28 штаммов. Учет проводился по цветным реакциям, характер которых определен стандартами в соответствии с рисунками, прилагаемыми фирмой к набору тест-системы. Полученные нами данные показывают, что в данной тест-системе вариабельные результаты на тестах, которые при стандартных исследованиях были стабильными. Особенно принципиальными были расхождения в оценке декарбоксилаз и денитрификации. Причем % таких ошибок достаточно высок, а вероятность точности диагностики даже для референтных штаммов, в свою очередь, низкая. Также идентификацию бактерий проводили с помощью системы API 20 NE. Принцип оценки этим методом заключается в определении кода по 21 качественному признаку, последние сгруппированы в 7 групп. Учитывая, что B.cepacia обладает широким спектром ассимилируемых субстратов, а в этой системе идентификации, начиная с 3-й триады, оценивается спектр усвоения различных карбогидратов, становится понятным, что для B. cepacia идентификационный код характерен в своей заключительной части формулы высокими цифровыми показателями типа ХХ77777. Из 15 исследованных штаммов B. cepacia - 12 с вероятностью от 95,2% до 99,9% по определителю относятся к виду B. cepacia, три штамма (320, 5809 и 5812) не являются представителями этого вида. Все они исключались из вида B. cepacia как при постановке тестов в соответствии с идентификационным ключом, так и при иммунологических исследованиях.

«Золотым» стандартом в окончательной идентификации культур B. cepacia являются только генотипические методы: ДНК-зонды и ПЦР-диагностика. Получение видо- и геномоспецифических праймеров, как и постановка экспериментов с ПЦР, проведены на базе лаборатории молекулярной биологии совместно с к.м.н., доцентом В.А.Антоновым.

Исследованные 28 штаммов, фенотипически признанные раньше, как культуры B. cepacia или B. gladioli, в ПЦР-тестах с видовыми праймерами четко разграничились на 2 группы, соответствующие результатам, ранее полученными в опытах с МФА. 18 штаммов B. cepacia соответствовали, как по фенотипическим, так и по генотипическим свойствам виду B. cepacia (табл. 3).

Показано, что использование стандартных микробиологических фенотипических методов не позволяет идентифицировать более 10% культур B. cepacia, как в сторону гипердиагностики, так и гиподиагностики. Более того, разработанные современные генотипические методы также не обеспечивают 100% гарантию видовой и внутривидовой таксономической дифференциации штаммов B. cepacia.

МФА

РДД

В наших условиях, как впрочем, и в других научно-исследовательских учреждениях полифазность исследований обеспечивается сочетанием генотипических и фенотипических методов. В зависимости от цели исследований и условий идентификации алгоритм первых этапов может существенно отличаться. При нацеленном поиске изучаемая культура, уже на первом этапе выросшая на селективной среде или присланная для окончательной идентификации, может исследоваться как в ПЦР, так и в МФА, методами, не требующими в принципе наличия «чистой» культуры.

1. 
   Изучены фенотипические свойства 25 музейных штаммов B. cepacia, установлен набор стабильных и вариабельных признаков для данного вида микроорганизма; на основании стабильных признаков разработана схема для практической, ориентировочной идентификации культур B. cepacia
   
2. 
   Определены уровни чувствительности штаммов B. cepacia к 18 химиотерапевтическим препаратам, показана перспективность использования для лечения карбапенемов, хинолонов и ко-тримаксазола. Для разработки селективных сред можно использовать сочетание полимиксинаВ, гентамицина и ванкомицина, к которым все культуры B. cepacia высоко резистентны
   
3. 
   Патогенность культур B. cepacia на лабораторных животных не коррелирует с фитопатогенностью; при оценке вирулентности штаммов B. cepacia, выделенных из внешней среды и клинического материала, чувствительность животных к инфекции повышается при введении иммуноблокаторов – актиномицинаД или четыреххлористого углерода
   
4. 
   Иммунологические методы (РДД, МФА) показали перспективность их использования на этапах предварительной оценки, при этом показано, что в РДД происходит гипердиагностика за счет наличия у близкородственных буркхольдерий общих антигенов, а МФА высокоспецифичен, нами не отмечены случаи гипер- или гиподиагностики
   
5. 
   Использование для постановки ПЦР праймеров на основе ДНК recA гена B. cepacia позволили определять как видовую принадлежность исследуемых культур, так и их инфравидовую характеристику – геномовар
   
6. 
   Изучена возможность штаммов B. cepacia к фаго- и бактериоцинопродукции, имеющаяся коллекция штаммов разграничена на группы по их способности быть продуцентами или индикаторами, тем самым являясь механизмом типирования культур этого вида
   
7. 
   Учитывая принципы полифазной таксономии, нам удалось выявить набор биохимических, иммунологических и генетических методов, который обеспечил разработку схемы идентификации культур B.cepacia с установлением не только видовой принадлежности, но и определение геномо- и биоваров исследуемых штаммов
   

1. 
   Андропова Н.В., Лобойко А.Д. Физико-химические факторы, влияющие на результаты оценки чувствительности буркхольдерий к антибиотикам. «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России». Мат. научно-практ. конф. Ставрополь. – 2007. – С. 21 – 22.
   
2. 
   Калинкина Е.В., …. Лобойко А.Д. Применение модели простейших для определения вирулентности штаммов патогенных Burkholderia с множественной резистентностью к антибиотикам. «Международные медико-санит. правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекц. болезнями в государствах-участн. СНГ». Мат. VIII Межг. научно-практ. конф. госуд.-участн. СНГ. – Саратов. – 2007. – С. 212 – 214.
   
3. 
   Лобойко А.Д. Чувствительность патогенных видов буркхольдерий к антибактериальным препаратам. «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ». Мат. VIII Межгос. научно-практ. конф. государств-участн. СНГ. – Саратов. – 2007. – С. 239 – 240.
   
4. 
   Сенина Т.В., Лобойко А.Д. Методы выявления и определения специфичности бактериоцинов буркхольдерий. «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ». Мат. VIII Межгос. научно-практич. конф. государств-участн. СНГ. – Саратов. – 2007. – С. 287 – 288.
   
5. 
   Антонов В.А., Илюхин В.И., Сенина Т.В., Лобойко А.Д. и др. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia. Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунол. – 2008. - № 4 – С. 78 – 82.
   
6. 
   Решение о выдаче патента на изобретение Сеимова И.К., Илюхин В.И., Меринова Л.К., Сенина Т.В., Лобойко А.Д. и др. «Штамм бактерий Burkholderia cepacia КМ 203 - авирулентный продуцент бактериофага, лизирующего культуры возбудителя сапа», №2007126293 от 12 мая 2008г.
   
7. 
   Заявка на изобретение Жога Л.К., Илюхин В.И., Сенина Т.В., Андропова Н.В., Лобойко А.Д. «Селективная среда для выделения возбудителя сапа», № 2007126294 от 12 июля 2007 г.
   
8. 
   Сенина Т.В., Лобойко А.Д., Калинкина Е.В. Алгоритм идентификации
   

9. Сенина Т.В., Лобойко А.Д. Принципы и схема идентификации буркхольдерий, имеющих значение для медицинской практики. «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ» Мат. IX Межгос. научно-практич. конференции государств-участников СНГ. – Волгоград. – 2008. – С. 276 -277.