Цкп «Генетический полиморфизм» обн ран

ЦКП «Генетический полиморфизм» ОБН РАН

Московская гимназия на Юго-Западе №1543

Разработка тест-систем для определения пола и идентификации особей амурских тигров по любому биологическому материалу методом ПЦР «в реальном времени»

Исполнитель:

И.Г. Буянов

Научный руководитель:

д.б.н. Д.В. Ребриков

Москва, 2014

Содержание

Введение……………………………………………………………………………………..4

1. 
   Обзор литературы…………………………………………………………………………..6
   

1. 
   Полная научная классификация………………………………………………..6
   
2. 
   Описание вида…………………………………………………………………...6
   
3. 
   Распространение вида…………………………………………………………...7
   
4. 
   Образ жизни………………………………………………………………………8
   
5. 
   Питание…………………………………………………………………………...9
   
6. 
   Размножение ……………………………………………………………………..9
   
7. 
   Охрана амурского тигра...………...……………………………………………10
   

2. 
   Методы геномной идентификации особей живых существ………………..……….10
   

1. 
   Анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ-анализ)……...10
   
2. 
   ПЦР-анализ………………………………………………………………………. 11
   

1. 
   Анализ коротких тандемных повторов (КТП-анализ, STR-анализ)…...11
   
2. 
   Анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP-анализ)………….….12
   
3. 
   1.2.2.3 Митохондриальный анализ……………………………….……... 12
   

2. 
   Применение генотипирования животных на практике…………………………… 13
   
3. 
   Метод ПЦР…………………………………………………………………………… 13
   

2. 
   Некоторые работы в области генотипирования животных по различному биологическому материалу………………………………………………………….16
   
3. 
   Некоторые работы в области идентификации представителей семейства кошачьих (Felidae)………………………………………………………………………..………17
   

2. 
   Материалы и методы……………………………………………………………………...18
   
   1. 
      Образцы для исследования…………………………………………………………18
      
   2. 
      Очистка ДНК из различного биологического материала тигра….………………19
      
   3. 
      Проведение ПЦР……………………………………………………………………..20
      
   4. 
      Электрофорез в агарозном геле…………………………………………………….22
      
   5. 
      Использованное программное обеспечение и программы……………………….22
      
   6. 
      Материалы……………………………………………………………………………22
      
3. 
   Результаты и их обсуждение………………………………………………………………23
   
   1. 
      Создание тест-системы для определения пола тигра методом ПЦР «в реальном времени»………………………………………………………………………………23
      
      1. 
         Отработка методов очистки ДНК из мышечной ткани и фекалий тигра……………………………………………………………………………….23
         
      2. 
         Подбор праймеров для специфичной наработки фрагментов Х и Y хромосом тигра……………………………………………………………………………….24
         
      3. 
         Проверка специфичности срабатывания праймеров на образцах ДНК самок и самцов тигра………………………………………………………………………25
         
      4. 
         Проверка работоспособности тест-системы в формате ПЦР «в реальном времени»…………………………………………………………………………..30
         
   2. 
      Создание тест-системы для идентификации особи тигра по однонуклеотидному полиморфизму в геноме……………………………………………………………...32
      
      1. 
         Подбор праймеров на предположительно вариабельные генетические маркеры (однонуклеотидный полиморфизм)…………………………………...32
         
      2. 
         Проверка работоспособности тест-систем на SNP………………………….. 32
         
4. 
   Выводы……………………………………………………………………………………...35
   
5. 
   Благодарности……………………………………………………………………………....35
   
6. 
   Список литературы………………………………………………………………………....35
   
7. 
   Список ссылок на электронные ресурсы………………………………………………….36
   

Одним из следствий интенсивного заселения планеты человеком является постепенное вымирание эндемичных популяций животных; так, за прошедшие 300 лет вымерло несколько видов крупных животных (1768 – Hydrodamalis gigas (Стеллерова корова) [1], 1930-1936–Thylacinus cynocephalu (Сумчатый волк) [2], 1957 – Panthera tigris virgata (Закавказский тигр) [3], 19799 год – Panthera tigris sondaica (Яванский тигр) [4]), и не последнюю роль в этом сыграл человек. Несмотря на действия ряда региональных и международных организаций по охране природы, многим популяциям живых существ по прежнему угрожает человеческий фактор [5,6,7].

В этой связи важной задачей является изучение популяций животных, находящихся под угрозой исчезновения, с целью их более эффективной защиты от браконьеров, организации заповедников, перемещению животных и т.п.

Одной из таких популяций является популяция амурского тигра (Panthera tigris altaica), обитающая в Приморском крае, на северной границе ареала обитания вида Panthera tigris. В течение последних 100 лет данная популяция, несмотря на все попытки организаций по защите природы, неуклонно сокращалась. На это есть много причин, и первая из них – это сокращение численности основной добычи амурского тигра – копытных животных, в том числе из-за болезней и истребления человеком [8,9,10]. Нередко убийцами становятся жители деревень, в которые заходит тигр, когда долгое время не может добыть себе пищу.

Популяции тигра трудно подаются охране, так как площадь территорий, занимаемых одной особью в среднем достигает 600 км², из-за чего исследователям трудно наблюдать за животными (в последнее время для наблюдений пытаются использовать радиопередатчики). Для понимания структуры и численности популяции, ареала обитания, изучения поведения, жизненного цикла и перемещений тигра актуальным является развитие методов, в том числе – методов генетической идентификации особей по обнаруживаемому биологическому материалу.

Тигры (Panthera tigris) – одни из наиболее крупных представителей семейства кошачьих (Felidae). Они относятся к роду больших кошек (Panthera), к которому также относятся лев и леопард.

Нашим объектом был амурский тигр (Panthera tigris altaica). Данный подвид тигра является единственным, адаптировавшимся к жизни в северных районах со снежными зимами. Обитают в России лишь в Приморском и Хабаровском крае. Тигр венчает вершину пищевой пирамиды уникальной экологической системы – уссурийской тайги. Поэтому состояние тигриной популяции – это индикатор состояния всей дальневосточной природы. В связи с резким сокращением популяции в 20 веке тигр был занесен в Красную книгу СССР. Однако благодаря действиям различных организаций, в числе которых и WWF, численность амурских тигров выросла с 200 в 1984 г. до стабильной популяции в 450 особей в настоящий момент. Несмотря на то, что популяция амурских тигров на сегодняшний день не находится в такой опасности, как в середине 20 века, на них все еще ведется охота и существуют ряд других антропогенных факторов, по причине которых эти тигры по-прежнему находятся под угрозой вымирания. Поэтому исследование популяции амурских тигров является важной задачей [Соколов и др., 1989].

Одним из ведущих методов исследования популяций является мониторинг. Мониторинг – это процесс наблюдения за параметрами популяции (например, численности) и их изменением во времени. Приморская популяция тигров активно подвергается мониторингу [11], который позволяет зоологам следить за изменениями, происходящими в популяции этого редкого хищника. Однако для того чтобы не подвергать тигров стрессу и снизить до минимума неоправданное вмешательство в жизнь популяции, ученым необходимо применять новые методы исследования, например, брать на анализ биологические образцы тигров, с последующей идентификацией особи или изучать следы животных, либо маркировать их датчиками слежения [12] и др.

Одним из стандартных видов биологического материала тигра, обнаруживаемого в тайге, являются фекалии. Чтобы проанализировать собранный материал, зоологам необходимо применять методы молекулярной биологии, связанные с очисткой, амплификацией и др. процессами, касающимися ДНК.

Целью данной работы было создание тест-систем для определения пола тигра и идентификации животного методом ПЦР «в реальном времени».

Задачами работы были:

1) Отработать методику экстракции ДНК и выделить ДНК из различного биологического материала тигра (фекалий, мышечной ткани);

2) Подобрать специфичные праймеры и флуоресцентные зонды к предполагаемым участкам X и Y хромосом тигра;

3) Проверить ПЦР-тест-систему для определения пола на особях амурских тигров;

4) Проверить ПЦР-тест-систему для определения пола тигра на ДНК из разного типа биологического материала;

5) Подобрать специфичные праймеры и флуоресцентные зонды к предполагаемым полиморфным однонуклеотидным позициям в ДНК тигра;

6) Проверить ПЦР-тест-систему для идентификации особи тигра.

1.Обзор литературы

1.1Амурские тигры

1.1.1 Полная научная классификация амурского тигра (Panthera tigris altaica)

Домен: Эукариоты (Eukaryota)

Царство: Животные (Animalia)

Тип: Хордовые (Chordata)

Класс: Млекопитающие (Mammalia)

Отряд: Хищные (Carnivora)

Семейство: Кошачьи (Felidae)

Род: Пантеры (Panthera)

Вид: Тигр (Panthera tigris).

Подвид: Амурский тигр (Panthera tigris altaica)

Амурский тигр относится к наиболее крупным подвидам тигра. Основной окрас шерсти в зимнее время — оранжевый, с белой шерстью на животе, шерсть гуще, чем у тигров, живущих в тёплых районах, а его окрас светлее. Тело вытянутое, гибкое, голова округлая, лапы недлинные, длинный хвост (рис. 1, 2). Уши очень короткие, так как обитает в холодной местности. Длина тела у самцов амурского тигра до кончика хвоста достигает 2,7—3,8 м, самки обычно меньше. Высота в холке до 115 см, масса 160—270 кг. Самый крупный амурский тигр имел в длину тела 317 см, хвоста 114 см.

Это единственный тигр, имеющий на брюхе пятисантиметровый слой жира, защищающий от леденящего ветра при крайне низких температурах. Продолжительность жизни около 15 лет. [13]

Рисунок 1. Молодой амурский тигр (3 года) [14]

Рисунок 2. Взрослый амурский тигр [15]

Ареал амурского тигра сосредоточен на юго-востоке России, по берегам рек Амур и Уссури в Хабаровском и Приморском краях (см. рис. 3). По данным учета тигра, проведенного зимой 2004-2005 годов на всем ареале обитания, показал, что численность амурского тигра в России составляет по разным данным 334-417 взрослых особей и 97-112 тигрят, или всего порядка 500 особей. Предыдущий учет амурского тигра, прошедший в 1995-96 годах, показал численность в 450 особей, из чего можно сделать вывод, что популяция стабилизировалась [16].

Более всего амурские тигры распространены в предгорьях Сихотэ-Алинь в Лазовском районе Приморского края, где на сравнительно небольшой территории живёт 15% от популяции всех диких амурских тигров. Около 10 % (40—50 особей) популяции амурского тигра обитает в Китае (в Маньчжурии). В зоопарках мира на 2007 год содержалось около 450 особей (на 1 января 1979 было 844 особи) [17].

Рисунок 3. Ареал обитания амурского тигра

Амурский тигр занимает огромные охотничьи территории, площадь которых у самки составляет 300—500 км², а у самца — 600—800 км². Если в пределах своих владений корма достаточно, то тигр не покидает свою территорию. При недостатке дичи увеличивается количество случаев нападения тигров на крупный домашний скот и собак.

Амурский тигр активен ночью. Самцы ведут одиночную жизнь, самки же нередко встречаются в группах. Тигры приветствуют друг друга особыми звуками, образующимися при энергичном выдыхании воздуха через нос и рот. Знаками выражения дружелюбия также являются прикосновения головами, мордами, и даже трение боками. [18]

1.1.5 Питание

Несмотря на огромную силу и развитые органы чувств, тигру приходится много времени уделять охоте, поскольку успехом завершается лишь одна из 10 попыток. Тигр ползком подбирается к своей жертве, двигается при этом он особенным образом: выгнув спину и упираясь задними лапами в землю. Мелких животных он умерщвляет, перегрызая горло, а крупных сначала валит на землю и лишь затем перегрызает шейные позвонки.

Убитую добычу тигр обычно тащит к воде, а перед сном прячет остатки трапезы. Ему часто приходится отгонять конкурентов. Тигр ест лёжа, придерживая добычу лапами. Специализация тигров — охота на крупных копытных животных, однако при случае они не брезгуют также рыбой, лягушками, птицами и мышами, едят и плоды растений. Основу рациона составляют изюбрь, пятнистый и благородный олени, косули, кабаны, лось, рысь, и мелкие млекопитающие. Суточная норма тигра — 9—10 кг мяса. Для благополучного существования одного тигра необходимо порядка 50—70 копытных в год.

Несмотря на распространённое мнение о людоедстве, амурский тигр почти никогда не нападает на человека и редко заходит в населённые пункты. На самом деле он всячески старается избегать человека. С 1950-х гг в Приморском и Хабаровском краях в пределах населённых пунктов зафиксировано лишь около десятка попыток нападения на человека. В тайге нападения даже на преследующих охотников довольно редки. [19]

Половое созревание у амурского тигра наступает к 4—5 годам. Период спаривания не приурочен к определённому сезону. Самка во время течки оставляет метки мочи и царапины на коре деревьев. Поскольку владения тигров очень большие, самка нередко сама отправляется на поиски партнёра. Она готова к спариванию на третий—седьмой день течки. Спаривание у тигров многократное, в это время животные держатся вместе. Затем самец покидает самку и отправляется на поиски новой партнёрши. Спустя 95—112 дней рождается 3—4 слепых детёныша. Мать кормит их молоком. Глаза тигрят открываются примерно через 9 дней, а в двухнедельном возрасте у них начинают расти зубы. Тигрята впервые покидают убежище в возрасте двух месяцев. Мать приносит им мясо, хотя ещё 5—6 месяцев продолжает кормить молоком. С шести месяцев тигрята сопровождают мать во время охоты. Самка учит детёнышей охотиться. Такая подготовка к самостоятельной охотничьей жизни длится долгие месяцы. Тигрята много играют, что также помогает им усвоить необходимые для охоты навыки. В годовалом возрасте детёныши впервые отправляются на самостоятельную охоту, а к двум годам они уже способны одолеть крупную добычу. Однако первые несколько лет своей жизни тигрята держатся с матерью. Тигрица охотится вместе с молодыми тиграми до тех пор, пока они не достигнут половой зрелости. [20]

Амурский тигр занесён в Красную книгу России. В апреле 2007 года эксперты Всемирного фонда дикой природы (WWF) объявили, что популяция амурских тигров достигла столетнего максимума и что тигр больше не находится на грани вымирания.

В 2008—2009 годах состоялась комплексная экспедиция сотрудников ИПЭЭ РАН в рамках Программы «Амурский тигр» на территории Уссурийского заповедника Дальневосточного отделения РАН в Приморском крае Дальнего Востока России. Удалось выяснить, что на этой территории обитает шесть особей амурских тигров. С помощью спутниковых ошейников ученые следят за их маршрутами, и для первой помеченной самки тигра в течение года удалось получить 1222 локации. Согласно опубликованным исследованиям животное использует площадь почти 900 км² — при том, что площадь заповедника — всего 400 км². Это означает, что тигры выходят далеко за пределы охраняемой зоны, подвергаясь повышенной опасности. Эти данные, согласно публикации, дают основание говорить о необходимости создания охранной зоны заповедника и регламентации деятельности человека за его пределами. [21]

1.2 Методы геномной идентификация особей живых существ

Методы геномной идентификации применяются в различных научных исследованиях и используются в практике многих государственных структур, в том числе и правоохранительных органов. Например, в криминалистике используется совокупность методов геномной идентификации, для того чтобы установить личность человека, причастного к тому или иному правонарушению (используют обнаруженные биологические образцы). Ниже рассмотрены технологические особенности существующих методов геномной идентификации.

Одним из первых методов генетического анализа, использовавшихся для идентификации отдельных организмов внутри вида, был метод ПДРФ-анализа. Суть метода заключается в том, что полученную геномную ДНК разрезают при помощи ферментов (эндонуклеаз рестрикции), затем при помощи гель-электрофореза выполняют разделение фрагментов с проявкой положения фрагментов в геле мечением изотопами (рис. 4). Эти ранние методы были вытеснены методами ПЦР-анализа. [22]

Рисунок 4. Пример ПДРФ-анализа. 1, 2, 3, 4– используемые образцы ДНК. [23]

С изобретением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК-идентификация сделала огромный шаг вперёд как в отношении дифференциации, так и в возможности восстановления информации по очень малым образцам. ПЦР позволяет наработать конкретный регион ДНК, используя олигонуклеотидные праймеры и термостабильные ДНК-полимеразы

Метод ДНК-профилирования, используемый в настоящее время, основан на ПЦР и использует короткие тандемные повторы (КТП). В этом методе анализируются участки с высокой степенью полиморфизма, которые имеют короткие повторяющиеся последовательности ДНК (чаще всего для человека используют 4-х нуклеотидные повторы, но встречаются и другие длины повтора, в том числе 3 и 5 оснований). Поскольку разные люди имеют разное число повторяющихся звеньев, эти участки ДНК могут использоваться для установления различий между индивидуумами. Эти КТП локусы являются целью специальных праймеров и усиливаются с помощью ПЦР. Результирующие фрагменты ДНК затем отделяются и распознаются с помощью электрофореза. Есть два распространенных методов разделения и распознавания: обычный гель-электрофорез (рис. 5) и капиллярный электрофорез.

Метод ПЦР был адаптирован для анализа локусов тандемного повтора. В США ФБР стандартизировало набор из 13 тандемных повторов для ДНК-профилирования, а также организовало базу данных CODIS для судебно-медицинской идентификации в уголовных делах. Подобные анализы и базы данных были созданы и в других странах. Кроме того, разработаны комплекты инструментальных средств, которые позволяют анализировать одиночный нуклеотидный полиморфизм (ОНП).

В другом варианте, для человека при STR-анализе применяется 16 маркеров, каждый из которых имеет несколько десятков аллелей. [24]

Рисунок 5. Пример STR-анализа. М –маркер длин. S1, S4, S2, S3, R1, R4 – образцы ДНК. VC – негативный контроль. [http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3168162_IJHG-13-69-g002&req=4]

Single nucleotide polymorphism (SNP) – это отличия последовательности ДНК размером в один нуклеотид (A, T, G или C) в геноме (или в другой сравниваемой последовательности) представителей одного вида или между гомологичными участками гомологичных хромосом. Например, если две последовательности ДНК — AAGCCTA и AAGCTTA — отличаются на один нуклеотид, в таком случае говорят о существовании двух вариантов: C и T. SNP возникают в результате точечных мутаций.

При таком подходе для идентификации человека с выполнением требования криминалистических баз данных достаточно 40 маркеров, каждый из которых имеет два варианта (при условии примерно равной частоты каждого из вариантов в популяции).

Важным преимуществом SNP-анализа перед методами ПДРФ и КТП является отсутствие этапа электрофоретического анализа фрагментов ДНК (что снижает вероятность загрязнения лаборатории продуктами ПЦР), а также возможность полной автоматизация исследования. В настоящее время подход используется наряду с КТП-анализом при идентификации личности.[25]

Для сильно деградировавших образцов иногда бывает невозможно получить полную информацию о коротких тандемных повторах. В таких ситуациях анализируется ДНК (мтДНК), поскольку в клетке существует много копий мтДНК, тогда как ядерной ДНК может быть не более 1-2 копий. Митохондриальный анализ является полезным дополнением в определении чёткой идентификации в таких случаях, как поиск пропавших без вести лиц, когда имеются только родственники, связанные по материнской линии. Митохондриальная ДНК может быть получена из такого материала, как волосы и старые кости или зубы. [26]

Генотипирование животных широко используется в области сельского хозяйства для различения пород сельскохозяйственных животных. Например, при генотипировании пород крупного рогатого скота учитываются аллели, влияющие на такие важные факторы как мясная и молочная направленность породы, также одна из важных целей таких исследований – поиск пород с хозяйственно ценным генотипом [Столповский и др., 2013]. При генотипировании овец ведутся исследования генетической структуры породы. Исследования ведутся с использованием оценок полиморфизма различных участков ДНК. В частности, в работах Столповского обнаружен высокий уровень гетерозиготности, оцениваемый по разным типам молекулярно-генетических маркеров [Столповский, 2008].

Другой любопытный пример использования генотипирования – идентификация домашних животных. Так, власти города Петах Тиква (пригорода Тель-Авива, Израиль) решили отслеживать нарушителей общественного порядка (хозяев, не убирающих за своими питомцами на прогулке) с помощью анализа ДНК фекалий. Для этого в городе создается специальная база данных (пока для собак).

Чиновники Петах Тиквы уже обратились к горожанам с просьбой показать свое животное местному ветеринару. Ветеринар берёт у собаки образец слюны, а затем в лаборатории определяют генотип животного. Экскременты, найденные на улице, будут «пробивать» по созданной базе, после чего владельцу животного будут высылать муниципальный штраф. Как уверяют авторы эксперимента, горожане, заботящиеся о чистоте улиц и выбрасывающие фекалии своих собак в специальные контейнеры, будут получать награды — купоны на еду для питомцев и собачьи игрушки.

В будущем созданную базу ДНК собак планируют использовать, чтобы исследовать генетические болезни животных и изучить собачью родословную. Также в нее войдут данные о беспризорных животных, а это даст возможность отказаться от создания электронного чипа для каждого пса. Местные жители уже согласились участвовать в эксперименте, если через полгода его признают успешным, то постановка домашнего питомца на ДНК-учет станет принудительной для всех собаководов страны [27].

1.4 Метод ПЦР

В современной молекулярной биологии одним из лидирующих методов является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакция была изобретена американским биохимиком Кари Маллисом в 1983 году, после чего она стала рутинным и ежедневным инструментом в каждой молекулярно-биологической лаборатории [Теликов, 2006]. С помощью ПЦР можно увеличить содержание (концентрацию) нужного для исследований участка ДНК, не прибегая к сложной методике.

Для наработки определённого участка ДНК нужно подобрать последовательности и синтезировать олигонуклеотидные затравки (праймеры), комплементарные границам этого участка, и, во время реакции, этот участок будет нарабатываться в пробирке.

Основными компонентами ПЦР-реакции являются:

1. 10-ти кратный ПЦР-буфер (в дальнейшем PCRB). Он обеспечивает постоянство pH во время реакции.

2. Нуклеотиды (в дальнейшем dNTP). Из них строится амплифицированная ДНК.

3. Taq-полимераза. Это специальный белок, участвующий в синтезе новой цепи ДНК.

4. Праймеры. Это олигонуклеотиды, которые являются границами амлифицируемого участка.

5. Деионизованная вода (в дальнейшем MQ).

6. В случае ПЦР «в реальном времени» - зонд: специальный олигонуклеотид, разрушающийся во время амплификации и дающий свечение.

7. Минеральное масло. Для предотвращения изменения объема смеси и испарения

Для приготовления смеси для ПЦР эти компоненты нужно смешать в таком порядке:

MQ, PCRB, dNTP, праймеры, зонд, ДНК, Taq-полимераза.

Существуют также приборы – ДНК-амплификаторы. Они работают, охлаждая и нагревая пробирки по температурам, которые вводятся в программу на компьютере. Количество и время циклов также вводятся пользователем в специальной программе [Ребриков и др., 2009].