Курсовая студентки второго курса Цыгановой Марины Тьюторы: Герасимова А. В., Равчеев Д. А. Супервайзер: д б. н проф. Гельфанд М. С

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Факультет Биоинженерии и Биоинформатики

Изучение регуляции азотофиксации в различных видах архебактерий

Курсовая студентки второго курса

Цыгановой Марины
Тьюторы: Герасимова А.В., Равчеев Д.А.
Супервайзер: д.б.н. проф. Гельфанд М.С.

Москва, 2004

Изучение прокариотических организмов на молекулярно-биологическом уровне имеет важное практическое и теоретическое значение. Сейчас активно ведутся работы по исследованию малоизученной группы организмов, архебактерий. О ее существовании стало известно в 1977 году, и уже к 1978 было предложено выделить этих организмов в новый домен, то есть определить их как третью форму жизни. Расхождение трех основных эволюционных линий произошло на ранних этапах развития жизни (Doolittle and Brown, 1994). При этом эубактерии, скорее всего, отделились от общей ветви до расхождения архей и эукариот, которые в своей истории имели значительный период совместного развития. В связи с этим археи и эубактерии схожи по морфологической организации клетки и по многообразию метаболических и физиологических процессов, но на уровне организации транскрипции и трансляции археи проявляют большее сходство с эукариотами. Так, РНК-полимераза архей подобна таковой у эукариот. Таким образом, археи совмещают в себе как признаки эубактерий, так и признаки эукариот, но, в тоже время, обладают уникальными свойствами, многие из которых позволяют этим организмам жить и развиваться в разнообразных, в том числе и экстремальных условиях. Археи имеют чрезвычайно маленький геном и являются единственными живыми организмами, производящими метан, как продукт метаболизма. Своеобразны и некоторые особенности строения архебактерий. Так, археи не имеют муреина в клеточной стенке, а гидрофобные цепи фосфолипидов одной стороны бислоя мембраны связаны при помощи эфирных связей с соответствующими гидрофобными участками противоположной стороны (Bell and Jackson, 1998).

Однако, несмотря на то, что эти факты уже известны, архебактерии остаются весьма малоизученной группой. Как известно, экспериментальное изучение регуляции представляет собой очень трудоемкий процесс. Поэтому в настоящее время активно разрабатываются и применяются теоретические методы анализа. Так, в случае архей классические экспериментальные методы зачастую не могут быть применены. Причиной являются экстремальные условия обитания многих видов архей, которые трудно воспроизвести в лабораторных условиях. Теоретические же методы позволяют проводить исследования на основе уже известных генетических последовательностей. И значительно облегчают процесс аннотации геномной последовательности.

В связи с успешным применением биоинформатических методов в отношении бактериальных геномов (Mironov et al., 1999) возник вопрос о возможности использования подобных стратегий в отношении и другой группы прокариотических организмов, архей .

Детальный анализ белков, кодируемых в полных геномах архей привел к предсказанию некоторого числа белков, имеющих строение типа спираль-поворот-спираль, аналогичных регуляторам у бактерий (Aravind and Koonin, 1999).Также было установлено несколько групп совместно регулируемых генов и соответствующие им регуляторные сигналы. Одной из изучаемых систем стала система регуляции азотофиксации (Gelfand et al., 2000).

Под азотофиксацией понимается процесс включения аммония в состав органических соединений организма. Первичными продуктами усвоения аммония, поступившего извне, являются глутамин и глутамат. Прямо или опосредованно они предоставляют азот всем азотсодержащим соединениям клетки. Реакция образования глутамина из глутамата, собственно включение молекулы аммония, регулируется ферментом глутамин-синтетазой. Данная реакция сопряжена с расщеплением АТФ и требует присутствия ионов магния (Рис.1).

Некоторые бактерии и археи способны также фиксировать молекулярный азот, превращая его в аммоний с последующим включением в соединения организма (Рис. 2). Процесс шестиэлектронного восстановления молекулярного азота в аммиак, катализируется ферментом нитрогеназой.

Нитрогеназная система включает в себя два компонента: железосодержащий белок, имеющий активный железосерный [Fe4S4]-центр, и белок, включающий железомолибденовый (FeMo) кофактор (Dixon and Kahn, 2004).

Кроме того, существуют молибден-независимые нитогеназы, кофактор которых вместо молибдена содержит ванадий или не содержит ни одного из этих металлов. Оба типа таких альтернативных нитрогеназ были обнаружены в организме Methnosarcina acetivorans (Kessler et al.,1996).

Рис. 1. Синтез глутамина из глутамата.

Регуляция азотофиксации в археях подробно изучена лишь для Methanococcus maripaludis (Kessler et al.,1998). Набор генов и оперонов, которые регулируются в ответ на доступность азота, называется регулоном азотофиксации. В состав этого регулона входят следующие гены:

• 
  glnA, кодирующий глутамин-синтетазу;
  
• 
  amtB, кодирующий мембранный транспортер аммония;
  
• 
  glnB и glnK, кодирующие регуляторные PII белки, причем amtB и glnB гены часто образуют оперон.
  
• 
  nif-оперон, в состав которого входят 6 генов, кодирующих различные составляющие части нитрогеназы и два гена, кодирующих PII белки. К первой группе относятся гены nifH, nifD, nifK, nifE, nifN и nifX. nifD и nifK кодируют структурные субъединицы гетеротетрамера динитрогеназы. nifH кодирует железосодержащий белок, а nifE и nifN- поддерживающие структуры, в которых находится кофактор. Роль гена nifX не выяснена. Возможно, что его продукт участвует в биосинтезе кофактора.
  

В общем случае регуляция азотофиксации в археях к настоящему времени плохо изучена. Регуляция транскрипции генов, отвечающих за процесс азотофиксации, происходит у архей по механизму репрессии (Cohen-Kupiec et al.,1997). Экспериментально были определены белок-регулятор NrpR и регуляторный сигнал для генов регулона азотофиксации, состоящий из 14 нуклеотидов и имеющий палиндромное строение GGAA-(6)-TTCC (Kessler and Leigh, 1999). NrpR представляет собой димер, каждая часть которого связывается с соответствующим плечом палиндрома, в результате чего ингибируется процесс транскрипции. В случае, когда перед геном располагается два регуляторных сайта происходит кооперативное связывание двух димеров с образованием тетрамера (Lie and Leigh, 2002). Полные гомологи NrpR были найдены в Methanobacterium thermoautotrophicum delta H и Methanocaldococcus jannaschii и их наличие коррелирует с присутствием установленного для Methanococcus maripaludis сигнала. У Methanosarcina mazei, Methanosarcina acetivorans, Methanopyrus kandleri, Archaeoglobus fulgidus присутствуют неполные гомологи, состоящие из ДНК-связывающего домена и еще одного домена с неизвестной функцией. Связывание NrpR с сайтом определяется концентрацией α-кетоглутората. Неизвестно, связывается ли NrpR c α-кетоглуторатом непосредственно, или α-кетоглуторат вызывает регуляторный каскад, активирующий NrpR. Избыток α-кетоглутората, предшественника глутамата, свидетельствует о недостатке связанного азота в клетке (Рис.3). Поэтому при увеличении концентрации α-кетоглутората NrpR не может связываться с регуляторным сайтом и репрессия снимается.

Кроме того, показана регуляция азотофиксации на посттранскрипционном уровне, которая обеспечивается гомологами белка РII (Kessler et al., 2000).
Рис. 3. Синтез глутамата из α-кетоглутарата

.

За последние годы были дополнены ранее расшифрованные геномы архей и стали известны новые геномные последовательности организмов этой группы. Цель настоящей работы состояла в изучении регуляции процессов азотофиксации в различных группах архей.

Были сформулированы следующие задачи:

1. 
   Поиск белков-регуляторов, отвечающих за репрессию генов азотофиксации;
   
2. 
   Поиск ортологов белков, участвующих в азотофиксации. Выявление неортологичных замен.
   
3. 
   Построение матрицы позиционных весов нуклеотидов для поиска потенциальных регуляторных сайтов на основе анализа 5-областей генов, входящих в регулон азотофиксации в M. thermoautotrophicum, M. jannaschii и M. maripaludis; поиск потенциальных регуляторных сайтов в геномах родственных организмов с помощью полученной матрицы.
   
4. 
   Создание новой матрицы позиционных весов нуклеотидов для распознавания сайтов на основе анализа 5-областей генов азотофиксации из геномов родственных организмов с целью поиска новых сайтов. Подобная задача может возникнуть в тех случаях, когда перед генами, ответственными за процесс азотфиксации, не найдено сайтов, схожих с известными сигналами.
   

Нами было рассмотрено девять геномов архей, принадлежащим к различным группам. Полные геномы Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH (Smith et al.,1997), Methanosarcina acetivorans C2A (Galagan et al., 2002), Methanosarcina mazei Gol (Deppenmeier et al., 2002), Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 (Klenk et al.,1997), Methanocaldococcus jannaschiiDSM 2661 (Bult et al.,1996), Methanococcus maripaludis S2 и Methanopyrus kandleri AV19 (Slesarev et al., 2002), а также неполные геномы Methanosarcina barkeri str. fusaro и Methanococcoides burtonii DSM 6242 были взяты из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

Для построения матриц позиционных весов и использовалась программа SignalX (Mironov et al, 2000).

Для поиска ортологов и потенциальных сайтов использовался пакет программ GenomeExplorer (Mironov et al., 2000). Для поиска гомологичных белков использовалась программа BLAST (Altschul et al., 1997).

Для построения выравниваний нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и филогенетических деревьев применялась программа ClustalХ (Thompson, 1997).

Для визуализации деревьев использовалась программа GeneMaster (А.А. Миронов, неопубл.).

Для определения структуры регуляторного сигнала использовались диаграммы лого, построение которых производилось с помощью программы WebLogo (Crooks, 2004).

Отдельного внимания заслуживает процедура поиска ортологов в геномах M.barkeri и M.burtonii. В настоящее время доступны лишь фрагментарные последовательности данных геномов, и поэтому, применяя общий подход, не удалось найти ортологи регулятора. Тем не менее, в белковой базе данных с помощью программы BLAST были найдены по два гомолога NrpR для каждого организма. При этом наилучшими гомологами NrpR оказались белки NrpR из M.barkeri и белок, кодируемый геном MCB_063_0041, из M.burtonii . Поиск их гомологов в M.maripaludis показал, что именно NrpR является их наилучшим гомологом. Кроме того, из построенного на основе НТН-доменов NrpR филогенетического дерева видно, что эти белки близки к NrpR M.maripaludis (Рис.4). Таким образом, именно эти белки и представляют собой наилучшие гомологи NrpR.