ОҚУ-Әдістемелік кешені

ОҚУ-ӘДІСТЕМЕЛІК КЕШЕНІ

5В070100 «Биотехнология»

«Клеткалық биотехнология » пәнінен

ОҚУ-ӘДІСТЕМЕЛІК МАТЕРИАЛДАРЫ

Семей - 2013

Мазмұны

1. 
   Глоссарий – антигендер иммунды жүйеде антидененің пайда болуына әкелетін заттарға спецификалық әсер туғаызатын ақуыз. Антидене – иммунды жүйеде түзілетін ағзаға түскен бөгде патогендерді агенттерді бекітетін ақуыз. Гаплоид, ядро, жасуша, ағза, бұл хромосома жиынтығынан тұратын, толық жиынтықтың жартысын көрсетеді. Ген – бір немесе бінеше полипептидті тіркесті белгілейтін немесе РНК молекуласының немесе белгілі регуляторлы қызмет атқаратын хромосоманың бір бөлшегі (ДНК молекуласы). Жасуша культурасы асептикалық жағдайда арнайы жасанды қоректік ортада жануарлар немесе өсімдіктердің белгілі бір тіндеріне жасушаларды өсіру. Каллус – жасушаның ұйымдастырылғын пролиферациялық жолмен алынған тін. Пролиферация – ол бір жасушадан көбею арқылы жаңа түзілістің пайда болуы. Өсімдік- регенерант- культурада пайда болған, тамыры мен дамыған асептикалық жолмен алыңған өсімдік яғни in vitro. Тотипотенттік өзіне тән гентикалық ақпаратты көрсете алатын жасуша құрамы дифференцировканы және ағзаның ары қарай дамуын жалғастырады.
   

Протопласт – бұл қабықшасынан айырылған «жалаңаш» жасуша. Фитогормондар - өсімдіктерде физиологиялық процестердің регуляциясына қатысатын қосылыс. Дифференциация – бұл анализ жасушаларымен дочерни жасушаларының немесе олардың өзара айырмашылығын көрсететін процестер кешені.

Инокулюм жаңа ортаға қайта отырғызу үшін қолданылатын суспензиялы культураның бір бөлігі. Компитенция индуцирленген әсерлерді қабылдайтын және өзгенген дамуына спецификалық жағдайда әсер көрсете алатын ктеткалардың қабілеті. Детерминация- жасушаға баайланысты арнайы тұқымдық құрылысты реализацияға дайындайтын жағдай.
Дәріс №1

Жоспар

1. 
   Клетка биотехнологиясының дамуы
   
2. 
   Биотехнологияның үш бағыты, жекеленген клеткалар мен ұлпалардың маңызы
   

ХХ ғасырда химизация, механизация, мелярацияның қолдануда ауылшаруашылық өнімдері жоғарылады, бірақ ол қоршаған ортаның ластануына, ресурстардің төмендеуіне себепші болды. Сонымен қатар қосымша прогресстің арқасында ауылшаруашылық өнімдерінің көрсеткіші өз шегінен асып кетті. Сондықтан жаңа ізденістер мен жаңа әдістер керек болды.

Жаңа әдістердің ішінде ең перспективтісі- жасуша инженериясы болып саналды. Жасушаның арнайы жаңа әдістерін қолдану арқылы құрылған оларды эукриоттық ағзалардың жекелеген жасуша әдісі.

2.Жекеленген жасушалар мен ұлпалар биотехнологиясын 3 бағытта қарастырады:

1. 
   Жекелеген өсімдік жасушаларынан бағалы медициналық өнімдер, парфюмериялар. косметикалар, бояулар және т.б. екіншілік өнімдер: алколоидтар, стероидтар, гликоидтар, гормондар, эфирлі майлар өндіреді.
   
2. 
   Екіншілік өнімдерді қатты немесе сұйық каусты ұлпалардан алады. Жасуша технологиясы арқасында диосгенинсияқты медициналық препараттар алады, оны парфюмерияда қолданады. Осы тәсілдің тиімділігі оның екіншілік синтезделген заттарының алынуына біздің табиғата бағынбайтын өсімдіктерден алуға болады. Екінші бағыты – отырғызатын материалдардың көбеюінде жекелкенген тіндердің культурасын пайдалану болып саналады. Бұл әдіс өсімдіктің микрокөбею клоналімен аталған. Бұнда бір мерисистемадан бір жылда мыңдаған өсімдік алуға болады.
   
3. 
   Селекциялық өсімдіктерде жекеленген жасушаларды пайдалану арқылы жасалады. Бұнда тез өсетін өсімдіктерді табиғаттың қолайсыз жағдайына: ыстық, суыққ, сусыздыққа төзе алатын өсімдіктерді алу жатады.
   

Тақырып: Клеткалық биотехнологияның теориялық негіздері

Жоспар

1. 
   Тарихи ақпарат
   
2. 
   Өсімдік жасушаларының тотипатенттігі
   

1. 
   «Тін», «ағза», «жасуша культурасы» - термині толығымен өсімдікер бөлігінің асептикалық өндірілуінде қолданылады:
   
   • 
     агарирленген ортадағы каллусты тіндерге
     
   • 
     жасушаның суспензиялы культурасына және сұйық ортадағы аздаған агрегаттарға
     
   • 
     протопластар культурасында
     
   • 
     жекеленген ұрықтарда
     
   • 
     жекеленген ағзаларда (тамыр ұштары, өркендеуші меритемаларда)
     

1 кезең (1892-1902) Х. Дерканд, Фехтинг, Ресимгер деген неміс ғалымдарының атымен тығыз байланысты. Олар сахароза ерітіндісінде көптеген өсімдіктер тіндерін культивирлеуге тырысқан.

Бақбақ пен теректің сабақтарының бөлшектерін зерттеуіне біріншілік каус қолданылған. Оң нәтиже алмаған ғалымдар бірнеше ойлар мен пікірлерайтқан, бірақ олар кейіннен расталды. Соған байланысты Хаберланд арнайы культивирленген жағдайда өсімдіктер өзінің даму потенциалын құрастыра алады деген болжам айтқан.

2 кезең (1902-1922) жануарлар тіндерін культивирлеу арнайы қоректік орталарда жасалу негізделген. Бұл орталар табиғаты жағынан қан сарысуынан және ұрықтық ерітіндіден құралған. Жасанды құрамында өсімдік экстрактылары бар қоректік ортада жекеленген өсімдік тіндерін өсіру дұрыс нәтиже әкелген жоқ, өйткені ол жасушаның және өсімдік тіндерінің өсу жылдамдығына қатысын аз тигізді.

3 кезең (1922-1932) Ағылшын ғалымы Робинс және неміс ғалымы Котте қатты қоректік орталарда культивирлеуге болатынын айтты, бірақ та белгілі бір уақытта өсімдік тіндері өліп қалды.

4 кезең (1932-1940) француз ғалымы Р. Готри өсімдік тіндерінің жаңа қоректік ортада периодтық отырғызу арқылы in vitro жағдайында ұзақ культивирлеуді көрсетті.

5 кезең (1940-1960) 1955ж цитокин – фитогормон класының ашылуы табак паренхимасының жасушалық бөлінуіне ықпал етті. Осы арқылы морфогенезді индуцирленген каллустық тіндердің өсуін қамтамасыз етуге, эксплантты жасушаларды қолданды.

6 кезең (1960-1975) Нотинген университетінің профессоры Э. Коккинг ферментативтік әдісті ойлап шығарды. Оның әріптесі Пауэроль соматикалық гибридтарды шығарды. Француз ғалымы Ж. Морель in vitro жағдайда культура меристемасын қолдана отырып орхидеяның отырғызылған түрлерін алатын әдісті ойлап тапты.

7 кезең (1975- қазіргі уақытқа дейін) in vitro техникасы тез дамуды жалғастыруда, протопластардың электрслияния әдісі, мутагенез әдісі, гаплоидты өсімдіктер алу әдісі, вектормен протопластардың жекеленуі арқылы жасушаларды терең культивирлеу әдісі пайда болды. Генді инженерия әдісі арқылы екі үйлі өсімдіктер үшін генді жеткізу әдісі ойлап шығарылды.

2. Өсімдіктің жекеленген бөліктерін культивирлеу әдісі - өсімдіктің жасушасының маңызды құрамын тотипотенттілігін зерттеуде пайда болған. Тотипотенттілік (лат. тотус- бүкіл, потенция –күш) – бұл жасушаның генетикалқ ақпаратын ұйымдастырады. Онда бүкіл ағзаның өсуін және дифференциациясын қамтамасыз етілетін жағдайлар туады. Тотипотенттілікке жануарлар жұмырқаларының және өсімдіктердің жұмырқа жасушаларының ұрықтануы тән.

Өсімдіктерде тотипотенттілікті табиғи жағдайда арнайы жасушалар көрсете алады. Өсімдіктер тотипотенттілігі жараның жазылуында пайда болады. Өсімдіктердің жаралы бетінде арнайы емес жасуша пролиферациясы себебінен каустық пайда болады. Каллус жараның жазылуына әсер етеді.
Дәріс №3

Тақырып: Клеткалық биотехнологияның объектілері. In vitro – өсірілетін клеткаларды биологиялық активті заттарды алу үшін пайдалану.

Жоспар

1. 
   Каллусты культураны алу
   
2. 
   Каллусты клеткалар қасиеті
   
3. 
   Каллусты жасушаың генетикасы
   
4. 
   Гормонға тәуелсіз өсімдіктер тіндері
   

Өсімдік жасушаларының каллусқа айналуы қоректік ортада фитогормондардың болуына байланысты.

Әрбір жасушаның өсуі 3 фазадан өтеді:

1. 
   бөліну
   
2. 
   созылу
   
3. 
   дифференцирлену
   

2. Каллусты клекалардың ерекшеліктері. in vitro жағдайда өсірілген каллусты клеткалар жай клеткаларға тән физиологиялық, химиялық қасиеттерін сақтайды. Каллусты клеткалар 2-ші метаболиттік синтездік қасиетті сақтайды. Суыққа төзімді өсімдік клеткаларынан алынған каллусты клеткаларда қатты суыққа төзімділік, шынығуға бейімділік қасиеті байқалады.

Каллусты және пористі клеткаларға тән ортақ қасиет жоғарғы температуға, осмотикалық белсенді заттарға, тұздалуға төзімділік.

Жай клеткалардан каллусты клеткалар жекеленген қасиеттерімен ерекшелінеді. Оларда спецификалық белоктар пайда болады және фотосинтезделген жапырақ клеткаларына тән белок мөлшері азаяды немесе мүлдем жойылады. Каллусты клеткалар генетикалық гетерогенділігімен және физиологиялық асинхрондылығымен ерекшелінеді.

Ағзаның бақылауынан шығу нәтижесінде каллусты клеткалардың өсуі ұйымдастырылмаған, асинхронды және шексіз болады. Р. Готре 60 жыл бұрын жаңа қоректік ортаға отырғызған сәбіз тінінің культурасы әлі күнге дейін коллекцияда өсіп жатыр. Ашық грунтта өсіп жатқан өсімдікке қарағанда, каллусты клеткалардың өсу циклы ұзақ.

Каллусты клеткалардың ерекшелігі, жас бойынша гетерогенді болуы: клеткалар бір уақытта каллусты тіндерде кәрі және жас болады.

Каллусты клеткалар энергетикалық алмасуында елеулі өзгерістер байқалады. Олар жай клеткалармен салыстырғанда ауаны аз тұтынады.

3. Каллусты клеткалардың генетикасы. каллусты тіндер клеткасы генетикалық гетерогенді болады. Каллусты клеткалардың генетикалық біртексіздігі алдымен әртүрлі тығыздықта байқалады, яғни каллусты клеткалар хромосома санымен өзгешеленеді. Генетикалық стабильді in vitro болып меристемалық тіндер саналады.

Каллусты және суспензиялы культураларда өсімдікке тән диплоидты хромосома жиыны бар, клеткалар құрамында 3,4,5 және одан да көп хромосама жиыны бар полиплоидты клеткалар кездеседі. Плоиплоидиямен қатар каллусты клеткалар культурасында анеуплоидия (хромосома жиынының өсуі немесе төмендеуі бінеше хромосомаға) кездеседі. каллусты клеткалар ұзақ культивирлеген сайын плоидтылығымен көбірек ажыратылады.

Темекінің каллусты клеткаларын төрт жыл культивирлегенде диплоидты клеткалар жойылып, барлық клеткалар полиплоидты немесе анеуплоидты болады.

Плоидтылықтың өзгеруінен басқа өсімдікткрдің тіндері мен клеткаларын in vitro культивирлеу клеткаларда хромосомалық аббербацияның пайда болуын шақырады. Ақырғысы культивирленетін тіндердің биологиялық ерекшеліктеріне, сыртқы көрінісіне, зат алмасуына, өсу жылдамдығына әсер етеді.

Каллусты клеткалардың генетикалық әртүрлілігі оларды клеткалық селекциядажағымсыз факторларға төзімділікке, фитопатогендерге және жоғары продуктивтілікке қолдануға мүмкін,дік береді.

4. Гормонға тәуелсіз өсімдік тіндері. Каллусты клеткалар қоректік орталарда гормондардың мөлшеріне байланысты ғана бөлінеді. Бірақ та, ұзақ культивирлеу нәтижесінде ортада гормонсыз өсу қабілетіне ие болуы мүмкін, яғни ауксин мен цитокининге қатысы бойынша автономды болады. Бұндай клеткаларды «қалыптасқан» деп атайды. Қалыптасқан клеткалар ісік клеткалары сияқты, көп жағдайда қалыпты регенерацияға қабілетсіө және тек тератомдар түзеді.

Барлық каллусты тіндерде, кейбір культураларда 4-ші апссаждан абстап, регенерацияға қабілетілігі төмендейді, одан мүлдем жоғалады. Ескі егілген культураларда өсімдік регенеранттар алынбайды. Химиялық ісіктермен негізделеген «қалыптасқан» тіндерден басқа бактериямен, вируспен туындайтын өсімдік тектес тіндермен және өсімдіктердің түраралық гибридтерден туындайтын генетикалық ісіктер де бар.

«Қалыптасқан» тіндерде және ісіктерде өзіндік гормондардың интенсивті синтезі жүреді, сондықтан олар қоректік орталарға енгізуді қажет етпейді.

«Қалыптасқан» тіндерде гормонға тәуелділік гормондар ситезіне, грмон молекулаларының құрылысуына қатысуына, ферментті белоктардың синтезіне жауапты гендер белсенділігінің өзгерісі нәтижесінде туындайды. Ісік тіндерінде гормондар синтезі осы процесске жауап беретін бактериалды генді клеткаға ауысуына қатысты.

Дәріс №4

Тақырып: In vitro – өсірілетін клеткаларды организмге, ұлпаларға және мүшелерге түрлі биологиялық активті қосылыстардың, дәрі-дәрмектердің, токсиндердін, әр түрлі патогендердің әсерін зерттеу үшін модельді объект ретінде пайдалану.

Жоспар

1. 
   Жинақтағыш немесе кезеңдік культивирлеу
   
2. 
   Үздіксіз культивирлеу
   

1. 
   Сұйық ортада клеткаларды культивирлеу бірнеше әдіспен іске асады. Қарапайым және көп таралғантүрі жинақтағыш немесе кезеңдік культивирлеу болып табылады. Клеткалар тұрақты көлемде қоректік роллерлі немесе тербеткіш типті құралдарда өседі. мұндай жүйелер газ және метаболизмнің ұшқыш өнімдерінен басқа барлығы үшін жабық. Осы кезде колбаларда көп мөлшерде көмір қышқыл газының біраз көлемі жиналады. Өсу аяулағаннан кейін суспензия алғашқы тығыздыққа келеді, өсіру циклы қайталанады.
   

2. 
   Ағынды режимде культураларды өсіру әдісі үздіксіз культивирлеу деп аталады. Ағынды жүйені құру негізіндегі тәжірибелерде культураның экспоненциалдық өсу фазасында жаңа қоректік орта бөлігін супензияға қосу клеткалардың бөлінуін ұзақ қолдайды. Үздіксіз культивирлеу жабық ағынды және ашық ағынды жүйелермен іске асады.
   

Ашық ағынды жүйе жаңа қоректік ортаның ағып келуі мен клетка суспензиясының тең көлемін жою арасындағы балансты қамтамасыз етеді. Клетка бөлігін жүйеден жою жылдамдығы бөліну нәтижесінде, клетаның бөліну жылдамдығына сәйкес келуі керек, ол клетканың өсуі және биосинтез арасында тең жағдай туғызады.

Үздіксіз культивирлеу негізіне микроорганизмдерді культивирлеуде құрылған турбидостат және хемостат принциптері кіруі мүмкін. Хемостатты режимде үздіксіз культивирлеу ламитирлеуші өсу факторының әсерінен жүреді.

Турбидостат принципі сыртқы лимитирлеусіз үздіксіз культивирлеуді көрсетеді, клетка популяциясының өсуі белгілі бір деңгейде клетканың оптикалық тығыздығын реттеуде қолданылады. Бұл үшін төмен тығыздықты клеткалы және жоғарғы өсу жылдамдықты суспензиялар келеді, яғни алғашқы өсу фазасы популяциясы. Турбидостат тығыз культураға сезімтал фотоэлектрлік элементпен толтырылған хемостатпен сипаттайды. Клетканың өсу популяциясы берілген деңгейде автоматты түрде фотометрикалы ортаны беру регуляциясымен қолданылады.

Тақырып: Клеткаларды культивирлеу

Жоспар

1. 
   Әдіс тарихы
   
2. 
   Клеткаларды культивирлеу
   

Культурада жануар клеткаларының өсу және бөліну қасиетін көрсету үшін, әдістер қатарын меңгеру қажет етілді.

1. 
   Экзогенді прокариоттардан және саңырауқұлақтардан таза клеткалар алу әдістемесі.
   
2. 
   «Тіннен бөлініп алынғын» немесе жекешеленген клеткалары бар ортаны жасау әдістемесі ығыстырылмайды.
   
3. 
   Динамикада клетканың дамуын бақылау әдістемесі.
   
4. 
   Жануарлар клеткасын үздіксіз in vitro жағдайда культивирлеу және оларды басқа биологиялық агенттерден бос ұстау әдістемесі.
   

Одан кейінірек 1885 жылы У. Рукс организмнен тыс тірі организмдерді сақтайһу мүмкіншілігін практика жүзінде көрсетті. Ол тауық эмбрионының қабықшасын физиологиялық ерітіндіде тіршілікке қабілетті күйде сақтады. Кейінірек 1897ж Леб жалғағыш тіндермен қан клеткаларын сарысу мен қант плазмасы бар пробиркаларда тіршілкке қабілетті күйде сақтады. Льюнгрен (1898ж) реиплантацияға қабілетін сақтаған қышқылды ортада адам терісінен алынған экспланттарды тіршілікке қабілетті күйде ұстады. Қосымша эксперименттерді Джолли (1903) саламандра лейкоциттері бпар ілмелі тамшыларда клетканың бөлінуін бақылады., ал Биб және Эвинг (1906) бұл ит тінінің лимфосаркомасын қайта отырғызу деп бекітті.

Ру және Росс Харрисон жұмысты жалғастыру барысында ілмелі тамшылар әдістемесін жетілдірді. 1907 жылы камераның көмегімен бірнеше апта ішінде нерв клеткаларының өсуін бақылай алды: ол бұл клеткалардың өсу жылдамдығы 25 минутта 20мкм болатынын бекітті.

1913ж Алексис Каррель эмбрион экстрактысымен байытылған қан плазмасын қолданды. Бұл әдістеме үлкен жетістікті қамтамасыз етті. Рид теңіз шошқасының сүйек миынан культура дайындап және белгілі химиялық құрамдық ортада экспланты өсіруге талпынды. Левис (1911) және Рид (1908) қолданған. Каррельдің жұмысы «өлмейтін» клеткаларды культивирлеу деген атпен жариялағандықтан көпшіліктің үлкен назарын аудартты. 1912 жылдың 17 қаңтарының басы тауық эмбрионының жүрегінің клеткаларының инкубациясын алу кезеңі болды. Клеткаларды қайтара егуді 34 жыл бойында Эблинг жалғастырды. Каррель хирург болғандықтан және асептика жөнінде білгендіктен жануарлардың клеткаларын in vitro культивирлеуге үлкен үлесін тигізді. Каррель өзінің әріптестеріне клеткаларды қайтадан өткізу процесі кезінде жасалатын бақылаулар туралы демонстрация жасады. Істелінген жұмыс барысында культивирлеу ортасы рецептурасына бірқатар өзгертулер енгізді. Тирод Ренгердің ерітіндісін модифицирледі және тауық сарысуымен эмбриональды экстракты толтыруда фибрин коагулятын қолдана бастады. Бөлініп жатқан жануарлар клеткаларын бақылау үшін 1928ж Канти кинофотомикрография тәсілін шығарды. Осы кезеңде клеткалық жұмыс техникамына қосымша және түбірлі өзгерістер болды. Ең бірінші жалғыз клетка культуралар клонын 1948 Эрли мен оның әріптестері алды.

Тақырып: Жануарлар клеткаларын культивирлеу

Жоспар

1. 
   Культураға клетканы енгізу
   
2. 
   Клеткалардың шығуы
   

• 
  клеткалар культурасы
  
• 
  ағза мен тін культуралары (ағзалық культуралар)
  

Клеткалар түрінің культураға кірген тізімі жетерліктей көп. Олар адамның қосалқы тін элементі (фибробластар), скелет тіндері (сүйек және сіңір), жүрек және тегіс бұлшықеттер, эпителий тіндері (бауыр, бүйрек т.б.), нерв жүйесінің клеткалары, эндокринді клеткалар (бүйрек үсті, гипофиз), меланоцит және әртүрлі ісік клеткалары. Клеткалар популяциясы үнемі гомогенді болмайды және фиксирленген фенотипі бар. Культураға енгізуге қандай ті алуға болады, ересек немесе эмбринальды, калыпты немесе ісіктік? Эмбриональды тіннен алынған культуралардың тіршілікке қабілеттілігімен және ересек тіндерге қарағанда белсенді өсу қабілетімен сипатталады. Мұның себебі болып, мамандандырудың төменгі деңгейі қызмет етеді. Ересек тіндерді пролиферативті қабілеті болып, олардың бөлінбейтін маманданған клеткалардың көп болуы. Үлкен тіндердің біріншілік клетка культураларын алу және олардың көбеюі қиын болғандықтан, мұндай клеткалардың өмірі ұзақ емес. Ісіктен алынған культуралар үздіксіз ұзақ уақыт пролиферленгенде қалыпты тіндер культуралар өміріне белгілі бір уақыт береді. Ісік клеткалары культурасында пролиферацияға қабілеттілікті сақтауда аздаған бөлікте дифференцировка болуы мүмкін.