Пцр в реальном времени как новый метод детекции остаточной ДНК клеток vero в препаратах вирусов вакцинного назначения

ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных», Казань, Татарстан, Россия

Набережночелнинский государственный педагогический институт, Набережные Челны, Татарстан, Россия

Курский государственный университет, Курск, Россия

Смоленский государственный университет, Смоленск, Россия
В настоящее время иммуноферментный анализ и гибридизационный метод с использованием радиоактивных изотопов являются основными для детекции содержания остаточной геномной ДНК в препаратах, используемых для получения вакцин. Однако существует более простой, дешевый и безопасный метод для определения содержания остаточной ДНК в вакцинных препаратах – это полимеразная цепная реакция в реальном времени (реал-тайм ПЦР). Данный метод является удобной альтернативой вышеупомянутым методам, однако, до настоящего времени не применялся в нашей стране.

Главной целью данной работы было разработать методику количественного определения остаточной ДНК клеток Vero в очищенных инактивированных препаратах хантавируса Пуумала и вируса клещевого энцефалита, предназначенных для получения вакцин.

Вторичные концентраты хантавируса Пуумала и вируса клещевого энцефалита являлись вакцинным материалом в настоящем исследовании. Для проведения аналитических измерений использовали анализатор нуклеиновых кислот и фотометрический колориметр со встроенными функциями обработки данных фирмы Amersham. Для того чтобы получить контрольный препарат геномной ДНК клетки культуры Vero выращивали на среде Игла МЕМ с 4% раствором сыворотки, затем из клеток осажденных специально разработанным способом выделяли геномную ДНК в соответствии с рекомендациями производителя набора «Комплект реагентов для выделения геномной ДНК из тканей животных» (ЗАО Синтол). Полученный осадок клеток инкубировали с раствором протеиназы К (№1) в течение 14-16 часов при +50С. Далее проводили двойное переосаждение изопропанолом и 70%-ым этанолом. Концентрацию полученного осадка ДНК измеряли спектрофотеометрически без построения калибровочного графика с использованием прибора Amersham Bioscience Ultraspec Pro 6300, пользуясь встроенным методом «Определение концентрации ДНК». Фенольную экстракцию ДНК из препаратов вторичного концентрата (полуфабрикат вакцины) проводили с 750 мкл исследуемого препарата вторичного концентрата. ДНК инкубировали с фенолом и хлороформом при 65С в течение 5 минут. Разделение водной и органической фаз проводили центрифугированием и осадок переосаждали хлороформом, изопропанолом и этанолом, и высушивали при 37±1С в течение 10 мин, растворяя затем в воде. До проведения ПЦР-анализа полученный препарат экстрагированный из вакцинного препарата нуклеиновой кислоты может храниться в течение 24 часов при 2-8С. Непосредственно перед использованием, находившийся на хранении раствор ДНК должен быть прогрет в течение 5 минут при +65С. Из полученного препарата очищенной ДНК отбирали 5 мкл раствора в качестве образца для внесения в реакционную смесь ПЦР. Для получения серийных разведений стандартной ДНК клеток Vero с шагом в 4 раза, первичный рабочий раствор ДНК с концентрацией 1 мкг/мл разводили с водой и прогревали в течение 15 минут при +65С. Полученный контрольный ряд разведений хранят при температуре 4±2С не более 1 суток.

Состав реакционной смеси для проведения ПЦР содержал (мкм): реакционная смесь (dNTP 500 мкМ каждого, термобуфер B9004S (New England Biolabs), MgCl2 2,5 мМ) – 10; праймеры - 5 пмоль/мкл каждого – 2; зонд (3 пмоль/мкл) – 1; вода – 7; ДНК-полимераза (Антительный хот-старт, 10 ед/мкл) - 0,2. В каждую из пробирок с реакционной смесью вносили по 5 мкл ДНК. В качестве ряда серийных разведений контрольной ДНК для построения калибровочного графика использовали 6 образцов с концентрацией ДНК 977 пг/мл, 3906 пг/мл, 15625 пг/мл, 62500 пг/мл, 250000 пг/мл, 1000000 пг/мл. Для проведения ПЦР использовали следующую программу: предварительная денатурация 95С – 300 сек; основной режим (50 циклов) - 95С – 50 сек;- 60С – 50 сек.

Результаты анализировали при условии величины сигнала в ПКО, рассчитанной в автоматическом режиме, менее 10⁵ пг/мл и величины сигнала ОКО не более 5×10⁴ пг/мл, затем проводили построение калибровочного графика. Для расчета истинной концентрации ДНК в исследуемых препаратах полученные в результате значения определенной геномной ДНК делили на 75, чтобы учесть эффект концентрирования препарата в процессе его фенольной экстракции. Расчет концентрации остаточной ДНК в образце проводили по формуле:

[С₀] = [C_r1]Ct_r2 – [C_r2]C_tR1

Ct_r2-Ct_r1

[С₀] – условная точка, соответствующая параметру Ct при нулевой концентрации ДНК в образце (результат линейной экстраполяции).

[C] – lg концентрации ДНК, пг/мл;–

[Ct] - значения

[C_r1] - произвольных точки R1 и R2 с точно известными координатами

Концентрацию ДНК в экспериментальной точке Х (в виде lg концентрации ДНК, пг/мл) рассчитывали по формуле:

[Cx] = [С₀] – ([C₀]- [C_r1])Ct_x

Ct_r1