Поляризация флуоресценции

В противоположность этому средняя анизотропия r определяется как

(5.6)
где r_i- — анизотропия индивидуальных форм. Ясно, что последнее выраже­ние предпочтительнее. Более того, затухание анизотропии флуоресценции [r (t)] сферы после импульсного возбуждения записывается в виде

(5.7)

где r₀ - анизотропия в момент t = 0; φ - время вращательной корреляции сферы. Затухание поляризации не подчиняется одноэкспоненциальному за­кону даже для сферической молекулы.

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЙ ПОЛЯРИЗАЦИИ И АНИЗОТРОПИИ. Может вызвать удивление, почему для одного и того же явления существуют две широко используемые меры. Как Р, так и r имеют рациональное происхож­дение. Рассмотрим частично поляризованный свет, направленный вдоль оси х (рис. 5.2) и предположим, что измеряют интенсивности /_z и 1_у детектором, ориентированным вдоль оси х. Поляризация этого света определяется как доля света, который поляризован линейно. Иначе говоря,

(5.8)
где р - интенсивность поляризованной составляющей; п — интенсивность естественной компоненты, которая дается выражением n = 2I_y .Остающаяся интенсивность является поляризованной составляющей и равна Р =I_z-I_y . Для вертикально поляризованного возбуждения I_z = I_|| и 1_у = I_┴ . Подстановка в уравнение (5.8) дает уравнение (5.1), которое и яв­ляется стандартным определением поляризации.

Анизотропия r источника света определяется как отношение поляри­зованной составляющей к общей интенсивности I_общ :

(5.9)

Если возбуждение поляризовано вдоль оси z, то оно симметрично по отно­шению к х и у. Как результат, дипольное излучение флуорофора также симметрично по оси z. Следовательно, /_х = I_y . Учитывая, что 1_у = 1_┴ и I_z = I_|| , получаем уравнение (5.2).

П
оляризация - более полезный и удобный параметр для описания ис­точника света, когда свет направлен вдоль выбранного направления, как по­казано в верхней части рис. 5.2. В этом случае р + п — общая интенсивность и Р - отношение избыточной интенсивности вдоль оси z, поделенной на об­щую интенсивность.

РИС. 5.2. Схематическое представление поляризации и анизотропии света.

В противоположность этому излучение, испускаемое флуорофором, симметрично распределено вдоль оси z (нижняя часть рис. 5.2). По этой причине общая интенсивность дается не выражением I_|| +I_┴ , a I_общ= I_|| +2I_┴. Это происходит потому, что свет, излучаемый диполем, равномерно распределен вдоль осей х и у. Следовательно, анизотропия пред­ставляет собой отношение избыточной интенсивности, которая параллельна оси z, к общей интенсивности. С этой точки зрения параметр поляризации, возможно, неудобен для описания испускания флуоресценции. Однако он был принят в оригинальной литературе, и большинство теорий изложено с исполь­зованием этого термина. Этот параметр все еще широко применяют, но воз­растает и использование анизотропии. Вероятно, одной из причин предпоч­тения, отдаваемого поляризации, была та, что возбуждение направленным пучком правильнее описывается параметром поляризации. Понятно, что тот же самый параметр затем был применен для описания испускания флуорес­ценции, хотя пространственное распределение этого испускания другое.
5.2. Теория поляризации для разбавленных растворов, находящихся в стеклообразном состоянии

Анизотропия флуоресценции, измеряемая в разбавленных стеклообраз­ных растворах, определяется собственными спектральными свойствами флуорофоров. Это происходит потому, что высокая вязкость раствора препятст­вует заметной вращательной диффузии до испускания. Более того, в очень разбавленных растворах ни перенос энергии, ни реабсорбция не могут выз­вать деполяризацию испускания. Этот особый случай будет описан детально потому, что его обсуждение без чрезмерного усложнения выявляет фунда­ментальные свойства анизотропии.

Теория поляризации флуоресценции основывается на рассмотрении флуорофора как осциллирующего диполя, имеющего момент

где ω_L - круговая частота испускаемого света; t — время. Естественно, флуорофор испускает отдельные фотоны. Однако пространственная зависи­мость энергии точно описывается классическими (не квантовыми) теория­ми электричества и магнетизма. Предположим, что данный флуорофор ориентирован вдоль оси z, как показано на рис. 5.2. Пространственное распределение энергии, излучаемой осциллирующим диполем, идентично распределению излучения антенны, которая также является осциллирую­щим диполем. Электрическое поле А такого диполя на определенном расстоя­нии пропорционально sin ψ где ψ - угол по отношению к оси z:

Испускаемая энергия и, следовательно, наблюдаемая интенсивность I про­порциональны квадрату интенсивности электрического поля. Следовательно,

Применительно к поляризации флуоресценции наиболее важной харак­теристикой излучаемого света является его круговое симметричное распре­деление вдоль оси z. Для диполя, ориентированного вдоль оси z, следует ожидать одинаковой интенсивности света в направлениях у и х. Интересно отметить, что в направлении оси z нельзя наблюдать этот осциллирующий диполь, так как вдоль этого направления энергия не излучается. Мы будем говорить о моментах переходов при возбуждении и испускании как о погло­щающих и испускающих диполях.

РИС. 5.3. Система координат дпя флуорофора.

Рассмотрим флуорофор, диполи поглощения и испускания которого па­раллельны. Это практически верно для 1,6-дифенилгексатриена (рис. 5.3), который широко используется как зонд при изучении биологических мембран. В данный момент примем, что эта молекула ориентирована под углом в по отношению к оси z и ф - по отношению к оси у. Естественно, молекулы DPH будут случайным образом ориентированы в изотропном и гомогенном стекло­образном растворителе, и возбуждение поляризованным светом отбирает определенный диапазон ориентации (разд. 5.2.1). Пусть нужно вычислить ани­зотропию, которая наблюдалась бы для этой молекулы в стеклообразном растворе. Предварительное условие параллельности диполей, неподвижность и случайный характер ориентации упрощают вывод. Тем не менее рассмот­рение этого простого случая иллюстрирует смысл измеряемого значения анизотропии.

Интенсивность света, излученного диполем, пропорциональна квадрату проекции его вектора на ось наблюдения. Следовательно,

(5.10), (5.11)
В реальных экспериментах возбуждение будет направлено вдоль оси х. При этом с одинаковой вероятностью должны возбудиться все молекулы, имею­щие равные углы 9, т.е. популяция возбужденных флуорофоров будет сим­метрично распределена вокруг оси z, Любая экспериментально доступная популяция молекул будет ориентирована так, что угол ф будет принимать значения от 0 до 2 π с равной вероятностью. Следовательно, мы можем ис­ключить зависимость от φ в уравнении (5.11). Среднее значение sin²φ опре­деляется выражением


(5.12)

и, следовательно,

(5.13),(5.14)
Теперь предположим, что наблюдаем набор флуррофоров, которые ориенти­рованы по отношению к оси z с вероятностью f(θ). В следующем разделе будет рассмотрен вид f(θ), предполагаемый для случайного распределения. Измеряемые интенсивности флуоресценции для этого набора молекул равны:

(5.15)

(5.16)

где f(θ)dθ — вероятность того, что флуорофор ориентирован между θ и θ + dθ. Используя уравнение (5.2) и равенство sin²θ = 1 — cos^aθ, можно по­казать, что

(5.17)

Следовательно, величина анизотропии на самом деле является мерой сред­него значения cos ²θ, где θ — угол диполя испускания по отношению к оси z. Это происходит потому, что наблюдаемые интенсивности I_|| и I_┴ пропорцио­нальны квадрату проекций индивидуальных моментов перехода на оси х и z (см. рис. 5.2). Полезно рассмотреть взаимосвязь между r и θ. Рассеянный свет полностью поляризован, следовательно, θ = 0 и r =1,0. Полное исчез­новение анизотропии эквивалентно θ = 54,7°. Это не означает, что каждый флуорофор поворачивается на 54,7°, но среднее значение cos²θ =1/3, где θ -угловое смещение между диполями возбуждения и испускания. Напомним, чт( при выводе уравнения (5.17) предполагалось, что эти диполи параллельны. Не сколько более сложное выражение необходимо практически для всех флуоро-форов, поскольку диполи редко бывают параллельны. К тому же мы еще не рассмотрели влияние фотоотбора на величину анизотропии.

ВОЗБУЖДЕНИЕ И ФОТООТБОР ФЛУОРОФОРОВ. Для наблюдения флуорес­ценции флуорофоры, разумеется, необходимо возбудить. Электрический диполь флуорофора не обязательно должен точно совпадать с направлением оси z для поглощения света, поляризованного вдоль этой оси. Вероятность поглощения пропорциональна cos² θ, где θ — угол, образуемый диполем пог­лощения с осью z [ 3]. Следовательно, возбуждение поляризованным светом приводит к появлению популяции возбужденных флуорофоров, которая сим­метрично распределена вокруг оси z (рис. 5.4).

РИС. 5.4. Схемы, иллюстрирующие фотоотбор и вероятность распределения флуорофоров.

Это явление называется фотоотбором. Распределение cos²θ видоизменяется в дальнейшем путем учета вероятности того, что молекула образует угол θ с осью z. Для случайного распределения, которое должно существовать в неупорядоченном растворе, число молекул с величиной угла между 6 и 9 + dθ пропорционально sinθdθ, a также площади поверхности на сфере внутри угла от θ до θ + dθ. Следо­вательно, распределение возбужденных вертикально поляризованным све­том молекул выражается как

(5.18)

Распределение вероятности, даваемое уравнением (5.18), определяет мак­симум отбора, который может быть достигнут при использовании оптичес­кого возбуждения изотропного раствора. Напомним [уравнение (5.17)], что анизотро­пия является просто линейной функцией cos²θ. Следовательно, для одно­направленных диполей поглощения и испускания максимальные значения cos²θдаютсявыражением
(5.19)
Подстановка (5.18) в (5.19) дает cos²θ = 3/5. С учетом уравнения (5.17) мож­но найти максимальную анизотропию, равную 0,4, Это значение получается, когда диполи поглощения и испускания параллельны и нет других процессов, приводящих к деполяризации. Легко заметить, что это значение (0,4) гораз­до меньше, чем возможное для рассеянного света (1,0). Фактически, если измеренная анизотропия для случайно ориентированного образца больше чем 0,4, можно уверенно сделать вывод о присутствии рассеянного света в до­полнение к флуоресценции. Максимальное значение анизотропии 0,4 для па­раллельных диполей поглощения и испускания является следствием того, что вероятность поглощения света равна cos ² θ.
5.6. Влияние вращательной диффузии на анизотропию флуоресценции. Уравнение Перрена
Главная причина деполяризации флуоресценции - вращательная диффузия флуорофоров. Этот вид деполяризации описывается уравнением Перрена которое может быть выведено несколькими способами [3, 8]. Мы предпочитаем прямой вывод, основанный на том факте, что после возбуждения 5-импульсом кинетика затухания анизотропии r(t) для сферической молекулы описывается одноэкспоненциальным уравнением:
(5.40)
В этом уравнении ф - время вращательной корреляции флуорофора, которое зависит от вязкости η, температуры Т раствора и объема вращающейся области V;
(5.41)
Одноэкспоненциальное затухание r(t) верно только для сферических молекул. Для несимметричных частиц или молекул предсказываются более слож­ные выражения.

Пусть I(t) отображает кинетику затухания общей интенсивности флуоресценции [I₁₁(t) + 2 I₁(t)]. Стационарное измерение анизотропии является в действительности усреднением r(t) с весом I(t). Таким образом,

(5.42)
Для флуорофоров в гомогенном окружении можно ожидать, что затухание I(t} будет одноэкспоненциальным:
(5.43)
где т - время затухания флуоресценции. Подстановка уравнений (5.40) и (5.43) в (5.42) дает уравнение

(5.44),
которое и является одной из форм уравнения Перрена,

Полезно рассмотреть влияние вращательной диффузии, или, иначе говоря, времени вращательной корреляции, на стационарную анизотропию. Рассмотрим два случая: сильно вязкий раствор, где у » т и измеряемое значение равно r ₀, и молекулу в жид­ком растворе, где <р « т, а наблюдаемая анизотропия будет равна нулю. В качестве примера мы можем использовать уравнение (5.41), для того чтобы вычислить время вращательной корреляции перилена в этаноле при 20 °С, которое равно 0,092 нc. Для этих вычислений принимаем молярную массу равной 252 г/моль, плотность - 1,35 г/мл, л = 1,194 сП, Т = 293 К, V = 187 см³ /моль и R = 8,314 • 10 7 эрг/(моль • К). При r₀ = 0,36 и т = 6 нc получаем, что анизотропия должна быть равна 0,005. Если перилен растворен в пропиленгликоле при 25 °С (т) = 32 сП), анизотропия должна быть примерно 0,1. Это как раз та зависимость анизотропии от времени вращательной корреляции, которая является первопричиной широко распространенного применения этих измерений для изучения размеров и формы макромолекул, равно как и их динамических свойств в наносекундной временной шкале. Степень деполя­ризации можно связать со средним значением cos ²y, где у — угол,на который флуорофор поворачивается в течение времени нахождения в возбужденном состоянии:

(5.45)
Если вращения нет, то у = 0 и t = r₀. Анизотропия равна нулю, когда у = 54,7°. Однако, подчеркиваем, более точной интерпретацией условия r = 0 является равенство среднего значения cos²y = 1/3.

Уравнение Перрена часто записывают в другом виде. Наиболее типич­ные формы следующие:

(5.46)(5.47)

(5,48)

(5.49)
где R - скорость вращения флуорофора (φ^-1 = 6R); R_g - универсальная газовая постоянная; ρ - время вращательной релаксации (ρ = 3 < φ). Ясно, что выражения в единицах анизотропии проще, но уравнения (5.48) и (5.49) часто встречаются в литературе.
РАЗДЕЛЬНОЕ НАБЛЮДЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СКОРОСТЕЙ ВРАЩЕНИЯ ПУТЕМ подбора ДЛИНЫ ВОЛНЫ возбуждения. В нашем выводе уравнения Перрена мы предполагали, что затухание анизотропии флуоресценции, следующее за δ-импульсом возбуждения, подчиняется одноэкспоненциальному закону. Это предположение эквивалентно допущению, что деполяризационные вращения флуорофора симметричны или изотропны. Часто молекулы не симметричны, и следует ожидать различных скоростей вращения вокруг каждой молекулярной оси. Интересен в этом отношении перилен, дискообразная молекула которого (рис. 5.10) может вращаться вокруг оси, перпендикулярной к плоскости молекулы. Такое вращение называется вращением в плоскости (R_пл). Это вращение может происходить без заметного смещения ближайших молекул растворителя. И наоборот, перилен может вращаться так, что плоскость молекулы сместится; такое вращение называется внеплоскостным (R_вп). Возможны два типа таких движений, но для простоты они предполагаются равными. Внеплоскостное вращение требует большего смещения растворителя, чем плоскостное, и следовательно, ожидают, что скорость R_пл будет выше, чем R_вп. Можно получить оценку этих индивидуальных скоростей вращения, измеряя анизотропию при разных длинах волн возбуждения [10, 11].

В разд. 5.3. было указано, что значение r₀, измеренное в разбавленном стеклообразном растворе, служит мерой угла α между моментами перехода в поглощении и испускании. Так как r_o — функция длины волны возбуждения, то можно выбрать α путем подбора длины волны. Строго говоря, возбуждение при длинах волн, когда r₀ = 0,4, 0,1 и -0,2, позволяет оценить соответственно [10]. Это приближение в точности выполняется только для малых угловых смещений флуорофора. Выбор типов вращения иллюстрирует рис. 5.10. Рассмотрим, во-первых, возбуждение в длинноволновой области поглощения, где r₀ приближается к 0,4. Плоскостное вращение, так же как и одно из внеплоскостных вращений, смещает момент перехода, поэтому оба вращения активны в процессе деполяризации. Второе внеплоскостное вращение вокруг оси z не смещает диполь испускания и, таким образом, неактивно при деполяризации. Следовательно, наблюдаемая деполяризация связана только с двумя движениями, хотя считается, что существуют три возможных вращательных движения. Наблюдаемая скорость вращения < R > равна, таким образом, . Подобными рассуждениями можно показать, что при r₀ = -0,2 при деполяризации активно только R_пл. Для этого значения г₀ моменты поглощения и испускания находятся под углом 90° друг к другу. R_пл смещает момент испускания, и, таким образом, активно. Однако для α = 90° два внеплоскостных вращения неактивны. Вращение вокруг оси х не смещает Е. Вращение вокруг оси z неактивно потому, что благодаря симметрии популяция возбужденных молекул всегда случайно ориентирована вокруг оси z. В результате наблюдаемым типом вращения для r₀ = - 0,2 является R_пл.

И наконец, для r₀ = 0,1 только R_вп активно при деполяризации. Внеплоскостное вращение вокруг оси z снова неактивно из-за симметричного распределения возбужденных флуорофоров вокруг этой оси. Плоскостное вращение вокруг оси у неактивно потому, что для этого особого случая α = 45°, и популяция возбужденных флуорофоров снова симметрична относительно этой оси. Движением, которое смещает Е, является только вращение R_вп вокруг оси х. Следовательно, подбирая r₀, можно изучать анизотропию вращения флуорофора. Для симметрично вращающейся молекулы изменение r₀ не будет оказывать влияния на наблюдаемую скорость вращения. Однако, если деполяризующие вращения не изотропны, то вариации r₀ будут изменять кажущуюся скорость вращения. Еще раз отметим, что такое рассмотрение строго применимо только для малых степеней деполяризации, или, что то же самое, для самых малых угловых смещений.
5.7. Применения измерений анизотропии в биохимии

Измерение анизотропии флуоресценции широко используется в биохими­ческих исследованиях. Это происходит потому, что любые факторы, которые влияют на размер, форму и сегментальную гибкость макромолекулы, будут влиять на наблюдаемую анизотропию. Вышеперечисленные свойства макромолекул могут изменяться под воздействием рН, температуры, вязкости, денатурирующих агентов и из-за реакций ассоциации. В следующих разделах будет приведен ряд результатов, которые иллюстрируют использование и ин­терпретацию измерений анизотропии.

РИС. 5.10. Схема отбора плоскостных и внеплоскостных вращений путем выбора r0 или длины волны возбуждения на примере перилена.

5.7.1. Оценка микровязкости клеточных мембран

В предыдущем разделе указывалось, что анизотропия флуоресценции сильно зависит от вязкости раствора, в котором растворен флуорофор. Именно эта зависимость привела к использованию измерения анизотропии для оценки микровязкости в области ацильных боковых цепей клеточных мембран. Выбирают флуорофор, который распределяется в такое неполярное окружение. Как правило, для этой цели служат перилен, 9-винилантрацен, 2-метилантрацен [ 4, 12] и дифенилгексатриен [ 13]. Последнее из указанных веществ наиболее широко используется в настоящее время по соображениям, которые будут обсуждены ниже. Первоначально выбирают подходящий растворитель сравнения и строят градуировочную кривую — зависимость измеренных значений анизотропии флуоресценции от известной вязкости растворителя сравнения. Типичная градуировочная кривая приведена на рис. 5.11.

РИС. 5.11. Градуировочная кривая для оценки микровязкости мембран [12].

Приведены данные по анизотропии перилена (1), 2-метилантрацена (2) и 9-винилантрацена (3) в минеральном масле.

Затем измеряют анизотропию флуоресценции для того же флуорофора, распределенного в области ацильных боковых цепей липидного бислоя. Внутренняя вязкость бислоя оценивается при сравнении с градуировочной кривой. Для малых ароматических молекул, по-видимому, наиболее вероятно то, что их эффективный молекулярный объем V будет один и тот же в растворителе и в липидном бислое. В результате градуировочная кривая зависимости r от η в растворителе известной вязкости позволяет связать анизотропию мембранно-связанного флуорофора с микровязкостью мембраны.

Типичные результаты по микровязкости, полученные при использовании перилена, показаны на рис. 5.12. Яичный фосфатидилхолин представляет собой смесь ненасыщенных фосфолипидов, которые не претерпевают фазовых переходов в изученном температурном диапазоне. Кажущаяся микровязкость низка (кривая 2) и монотонно возрастает с изменением К^-1, Дипальмитоилфосфатидилхолин — насыщенный фосфолипид, фазовый переход которого отражается в резком уменьшении микровязкости, наблюдаемом вблизи 37 °С (кривая 1).



РИС. 5.12. Результаты определения микровязкости диспергированных фосфолипидных мембран по измерению анизотропии перилена [12].

Приведены кажущиеся микровязкости для дипальмитоилфосфатидилхопина (1), яичного фосфатидилхолина (2) и смесей DPPC + холестерин (3, 4), для которых указаны молярные соотношения.

Ниже температуры перехода липидные бислои, состоящие из насыщенных липидов, должны быть довольно вязкими. На рис. 5.12 также показана кажущаяся микровязкость смесей DPPC + холестерин (кривые 3, 4). Холестерин обычно увеличивает кажущуюся микровязкость мембран. Для определения микровязкостей, приведенных на рис. 5.11 для всех трех флуорофоров, в качестве растворителя сравнения было применено минеральное масло. Эквивалентные микровязкости были получены для каждой из этих систем, что увеличивает достоверность полученных значений. Однако было бы более желательно использовать три разных растворителя сравнения, чем изучать три разные системы, так как в этом случае эксперименты выявили бы связь между скоростью вращения флуорофоров и макроскопической вязкостью растворителей [14].

После этих начальных наблюдений измерения анизотропии флуоресценции стали широко использоваться для исследования динамики мембран. Некоторые благоприятные характеристики метода, а именно относительно простая теоретическая основа, несложное и сравнительно недорогое оборудование и высокая чувствительность измерений, способствовали его широкому распространению. Благодаря высокой чувствительности появилась возможность проведения экспериментов в разбавленных суспензиях мембран, содержащих только следовые количества зондов. Типичное молярное соотношение липид/зонд находится в диапазоне 200 : 1 — 2000 : 1, а типич­ная концентрация липидов составляет 0,1 - 10 мг/мл.

На протяжении последнего десятилетия наиболее широкоиспользуемым зондом для оценки вязкости мембран был DPH. Это, по-видимому, вызвано несколькими причинами. У DPH высокий коэффициент экстинкции (~80000 М^-1 . см^-1), что позволяет исследовать разбавленные растворы, а предельная анизотропия постоянна в диапазоне 320 — 380 нм, что определяет выбор длины волны возбуждения. Деполяризационные вращения DPH, по-видимому, изотропны. Вращение вокруг длинной оси молекулы может быть быстрым, но оно не смещает момента перехода, и, следовательно, такое вращение неактивно в деполяризации. (Искривления, заметные на рис. 5.11 для других зондов, происходят частично из-за анизотропных вращений несимметричных молекул.) И наконец, отчетливо проявляются фазовые переходы мембран. Этот факт иллюстрирует рис. 5.13, на котором приведены микровязкости, определенные с помощью DPH, для фосфолипидных везикул различного химического состава [15]. Из полученных данных видно, что кажущаяся микровязкость бислоев сильно зависит от их фазового состояния. Интересно отметить, что с другими флуорофорами, такими, как 12-антроилоксистеарат, 1-анилино-8-нафталинсульфонат, N-фенил-1-нафтил-амин, перилен и 9-винилантрацен, наблюдаются менее резкие изменения.

РИС. 5.13. Значения кажущейся микровязкости, полученные из измерений анизотропии DPH [15].

Приведены значения натурального логарифма кажущейся микровязкости от обратной температуры для малых однослойных везикул, приготовленных из DOPC (1), DMPC (2), DPPC (3), DSPC (4).

Очевидно, что измерения анизотропии флуоресценции могут значи­тельно расширить возможности изучения физико-химических свойств липидных бислоев. Однако важно понять и запомнить допущения, которые были сделаны при оценке микровязкости. Главное из них состоит в том, что градуировочная кривая, построенная при использовании изотропного растворителя сравнения, пригодна для флуорофоров, распределенных в анизотропное окружение липидных бислоев. Приходится принимать, что деполяризационные движения флуорофора идентичны в таком разном окружении. Это предположение было проверено несколькими другими методами (разд. 6.2.1), и в настоящее время известно, что оно некорректно: в липидных бислоях диффузионные движения флуорофоров обычно затруднены, т.е. флуорофоры не могут вращаться больше чем на определенный угол. В изотропном растворителе сравнения подобных угловых ограничений нет. Это не умаляет пользы измерений анизотропии для изучения клеточных мембран, но показывает, что нужно быть осторожным в интерпретации получаемых значений микровязкости.

5.7.2. Вращательная диффузия белков

Первым биохимическим применением метода поляризационной флуоресценции была оценка времен вращательной корреляции белков [ 16]. Общепри­нятым подходом является ковалентное маркирование белка внешним флуорофором. Флуорофор выбирают главным образом на основании времени зату­хания флуоресценции. Время затухания должно быть сравнимо с предпола­гаемым временем вращательной корреляции белка. Таким образом, анизотро­пия будет отражать изменение этого параметра [уравнения (5.44) и (5.49)]. Обычно поляризация флуоресценции определяется из ее зависимости от Т/η. Температуру изменяют обычным способом, а вязкость — путем добав­ления сахара. График строят в координатах либо (1/Р- 1/3), либо 1/r от Т/η (рис. 5.14). Экспериментально доступен только ограниченный диапазон значений T/η. При высокой температуре ограничение связано с нестабиль­ностью белков, а при низкой - с замерзанием и изменением растворимости. Отсекаемый отрезок на оси у должен быть равен (1/Р₀ - 1/3) или (1/r₀), где Р₀ и r ₀ — значения, получаемые для того же флуорофора в стеклообразном растворе. В первом приближении P_о(r_о) можно считать свойством флуорофора Ближайшее окружение может влиять на Р₀, но влияние обычно мало и срав­нимо по величине с влиянием растворителя на спектр поглощения флуорофо­ра. В следующем параграфе мы обсудим причины различий в экстраполиро­ванных значениях Р₀. Если время затухания флуоресценции известно, объем молекулы белка может быть вычислен из наклона и отсекаемого отрезка графика Перрена (рис. 5.14). Объем связан с временем вращательной корре­ляции белка уравнением (5.41).

Для глобулярных белков время вращательной корреляции приближенно связано с молекулярной массой М белка соотношением

(5.50)

где ν — удельный объем белка; h - величина гидратации (обычно 0,2 г Н₂0 на 1г белка).

РИС. 5.14. График Перрена для оценки молекулярных объемов. Штриховой линией показано влияние сегментальных движений зонда.

По уравнению (5.50) можно найти, что время корреляции гидратированного белка приблизительно на 12 % больше, чем предполагается для безводной сферы. Обычно наблюдаемые значения φ приблизительно в два раза больше, чем предполагаемые для безводной сферы [ 17]. Большие наблюдаемые значения являются, вероятно, результатом того, что боль­шинство белков имеет несферическую форму и эффективная оболочка растворителя больше для вращательной диффузии, чем для гидратации.

В реальных экспериментах часто получаются разные результаты в зави­симости от того, что именно варьируется - температура или вязкость. Ти­пичные результаты для иммуноглобулина G, маркированного диметиламино-нафталин-5-сульфохлоридом, приведены на рис. 5.15. Главным и в то же время вводящим в заблуждение свойством координат Перрена является увели­чение экстраполируемого значения 1/Р₀ (уменьшение значения Р₀) по мере увеличения температуры. Такое поведение обычно приписывают гибкости зонда на макромолекуле.

РИС. 5.15. Поляризация флуоресценции DNS-γ-иммуноглобулина [18].

а — прямые проведены через точки, полученные при одной и той же температуре. б— прямые проведены через точки, измеренные при разных температурах. На обо­их рисунках одни и те. же данные.
На вопрос, какое значение Р₀ следует использовать для вычисления вре­мени вращательной корреляции белка - экстраполированное (Р₀') или зна­чение для замороженного раствора (P₀),—полностью корректного ответа нет, и нужно рассматривать специфические особенности каждого отдельного экс­перимента. Обычно экстраполированное значение Р_о' дает лучшую оценку φ, поскольку в нем учитывается сегментальное движение зонда и частично вычи­тается влияние этого движения на вычисленное значение φ. Например, предпо­ложим, что сегментальное движение флуорофора значительно быстрее, чем вращательная диффузия белка. Тогда значение Р₀ эффективно снижается:

(5.51)

где штрихом отмечено экстраполированное значение, а β — угол, на который флуорофор свободно вращается (см. рис. 5.14). Подобным же образом сег­ментальные движения снижают экстраполированную анизотропию r'₀

(5.52)

РИС. 5.16. График Перрена для комплекса DNA с профлавином [24]

При очень быстром сегментальном движении (φ « τ) и наклон, и отсе­каемый отрезок на графике Перрена меняются. Член (1/Р₀' —1/3) сокращает­ся при расчете молекулярного объема, и вычисленное время корреляции отражает общую скорость вращения белка. Важно отметить, что если φ не намного меньше, чем τ, а это часто встречается, то кажущееся время корреляции может существенно изменяться под влиянием сегментальных движений [19, 20].

Не следует пренебрегать информацией, получаемой из сравнения зна­чений Р₀ и Р'₀. если P'₀ намного меньше, чем Р₀, то можно сделать вывод о существовании сегментальных движений зонда на макромолекуле. Протя­женность этих движений может быть оценена при использовании уравнений (5.51) - (5.52). Другое явление, часто встречающееся на графиках Перрена,— быстрое увеличение 1/Р- 1/3 при высоких температурах, как это показано на рис. 5.16 для денатурации двойной спирали DNA. Увеличение 1/Р обычно является результатом денатурации макромолекулы, приводящей к увеличению сегментальной подвижности флуорофора.

5,7.3. Реакции ассоциации

Измерение поляризации флуоресценции или анизотропии широко исполь­зуется для количественной оценки реакций ассоциации биологических макромолекул. Связывание антигена с антителом [21], ассоциация белков [ 22], ассоциации лигандов с белками и нуклеиновыми кислотами [ 23, 24] -вот только несколько примеров. Предположим, что флуорофор может нахо­диться либо в свободном виде, либо может быть связан с макромолекулой. Наблюдаемое значение анизотропии флуоресценции, когда присутствуют обе формы, дается выражением

(5.53)
Где rс_воб и r_связ— анизотропии свободного и связанного флуорофоров со­ответственно: f_СВОб и f_связ — доли от общей флуоресценции, соответствую­щие каждой форме флуорофора. Естественно, f _своб + f _связ = 1. Предполо­жим далее, что для данного случая квантовый выход флуорофора не изме­няется при связывании и f _своб и f _связ соответствуют долям от общего количества флуорофора, находящегося в свободном и связанном состоянии. Этой информации достаточно для вычисления константы диссоциации реак­ции.

Рассмотрим равновесие между лигандом L и белком Р.

(5.54)

Константа диссоциации для этой реакции записывается в виде

(5.55)

Доля связанного флуорофора равна

(5.56)
где [ L₀] = [ L] + [ Р - L] - общая концентрация лиганда или флуорофора. Уравнение (5.53) легко преобразовать к виду

(5.57)
В общем случае можно получить значения r_своб и r_связ, исследуя флуорофор в отсутствие белка и при высоких концентрациях белка, достаточных для полного связывания флуорофора. По измеренному значению r можно вычис­лить f_свнз и f_своб Эти значения затем используются для вычисления кон­станты связывания. Наиболее удобная форма уравнения связывания опреде­ляется спецификой анализируемого объекта.

Ценность измерения анизотропии для изучения реакций ассоциации сос­тоит в том, что нет необходимости в изменении интенсивности флуоресцен­ции или спектра испускания флуорофора. Фактически если происходят та­кие изменения, то необходимо более сложное выражение для вычисления f _связ из средних значений анизотропии. Если при связывании происходят изменения квантового выхода, анизотропия может изменяться значительно сильнее. Например, рассмотрим связывание профлавина с DNA [ 24]. Извест­но, что поляризация профлавина в воде почти равна нулю, а поляризация формы, связанной с DNA, близка к 0,37. Следовательно, даже если кванто­вый выход или спектр испускания профлавина при связывании остаются пос­тоянными, анизотропия по-прежнему может быть использована для вычисле­ния степени связывания.

Часто квантовый выход флуорофора при связывании изменяется. В этом случае необходимо использовать другую форму уравнения (5.57), учитывающую это изменение. Примем, что R = q_связ/q_своб - отноше­ние квантовых выходов связанной и свободной форм. Среднее значение анизотропии связано с долей от общего количества флуорофора, находящегося в связанном состоянии, выражением

(5.58)
При К = 1 это выражение сводится к уравнению (5.57). Если же при связывании происходят значительные изменения в квантовом выходе, то их можно использовать для количественной характеристики реакции ассо­циации. Когда изменения малы (в два раза или меньше), предпочтительнее использование анизотропии, особенно если при связывании сильно меняет­ся r. Более того, измерения анизотропии не зависят от общей интенсивнос­ти флуоресценции, благодаря чему можно использовать анизотропию в тех случаях, когда трудно измерить интенсивность из-за свойств образца или особенностей прибора.

СВЯЗЫВАНИЕ ЛУМАЗИНА (2,4-ПТЕРИДИНДОЛА) С ЛУМАЗИНОВЫМ БЕЛКОМ.

Для того чтобы проиллюстрировать влияние связывания белка с лигандом на анизотропию флуоресценции, воспользуемся некоторыми результатами из работы [ 23]. Авторы работы изучили связывание лумазина (L) с лума-зиновым белком (Р) с молекулярной массой 22 000, образующим комплекс (L -Р). При связывании лумазина с белком квантовый выход флуоресцен­ции лумазина увеличивается в~1,4 раза. В табл. 5.3 показаны стационар­ные анизотропии для комплекса L -P, измеренные при различных концен­трациях. Из приведенных данных ясно, что анизотропия флуоресценции раствора уменьшается при разбавлении образца, Это уменьшение объясня­ется диссоциацией комплекса на белок и свободный лумазин, поэтому дан­ные могут быть использованы для вычисления константы диссоциации комп­лекса. В этом частном случае концентрации L и Р равны. Ясно, что [LP] = [^р]oбщfсвяз и [L] = [Р] = [Р]oбщ(1 - fсвяз). где [Р]общ - общая концентрация белка.

Константа диссоциации, таким образом, равна:

(5.59)

Доля связанного лумазина может быть вычислена из данных табл. 5.3. Предположим, что при общей концентрации 5,44 мкМ весь лумазин связан с белком. Тогда r_связ = 0,153. Далее предположим, что анизо­тропия свободного лумазина была измерена и найдена равной 0,003. Это значение r_своб. Используя эти числа и другие значения анизотропии из табл. 5.3, вычислим К_дисс, Например, при концентрации 0,69 мкМ и 21°С анизотропия равна 0,047. Подстановка в уравнение (5.58) дает f_связ = 0,229, а при подстановке этого значения в уравнение (5.59) получим К_дисс = = 1,79 мкМ.

Концепции, описанные в предыдущем параграфе, приводятся в литературе в различных формах, обычно точно соответствующих конкретному набору экспериментальных условий. Не ставя целью рассмотрение сложности свя­зывания лиганда с белком, мы хотим проиллюстрировать возможность при­менения среднего значения анизотропии для определения относительных ко­личеств флуорофора в каждом из двух окружений. Если это известно, то вы­числение соответствующих констант можно провести по любому приемлемому выражению, описывающему связывание лиганда с белком.

Представляется также интересным обсудить влияние несвязанного флуорофора на кинетику затухания анизотропии флуоресценции. Теория кинетики затухания анизотропии будет описана более детально в следующей главе. Здесь рассмотрим флуорофор, находящийся в двух состояниях -свободном и связанном. Кинетика затухания анизотропии дается выражением

(5.60)

где φ_своб и φ_связ - времена вращательной корреляции для флуорофоров в свободном и связанном виде соответственно. Выражение (5.60) справедли­во только в том случае, если время жизни флуорофора одно и то же в обоих состояниях. Предположим, что φ_своб очень короткое (< 1 нс) из-за неболь­шого размера флуорофора. Тогда для наблюдаемого затухания можно за­писать:

(5.61)

Наблюдаемое затухание анизотропии будет одноэкспоненпиальным с временем, корреляции φ_связ. Несвязанный флуорофор не будет влиять на φ_связ но его присутствие будет сказываться па кажущемся значении r(t), равном г_оf_связ при t = 0, и понижать кажущееся значение начальной анизотропии.

Интересно проанализировать общий случай, когда время затухания флуоресценции флуорофора неодинаково в разных состояниях. Тогда кине­тика затухания флуоресценции описывается уравнением

(5.62)

где α_свобτ_своб = f_свое и α_связτ_связ = f_связ Кинетика затухания анизотро­пии равна

(5.63)

Это выражение иллюстрирует потенциальную сложность природы r (t) при наличии двух классов флуорофоров. Например, примем, что время зату­хания связанной формы т_связ больше, чем время затухания свободной формы τ_своб, что типично для зонда,чувствительного к растворителю в области гидрофобного связывания. При длительных временах после импуль­са возбуждения r(t) увеличивается из-за увеличения доли вклада интенсив­ности связанных форм флуорофора. Кинетика увеличения r(t) часто интер­претируется как результат анизотропного вращения флуорофора. Действи­тельно, анизотропные вращения могут определять кинетику увеличения r(t), но, прежде чем давать такую интерпретацию необходимо убедиться, что причиной не является гетерогенность.

5.7.4. Денатурация DNA

В качестве заключительного примера использования метода поляриза­ции приведен температурный график Перрена для комплекса профлавин — DNA [24] (рис. 5.16). Профлавин встраивается между парами оснований двойной спирали DNA. При такой локализации его вращательное движение строго ограничено. Наблюдаемое значение поляризации ~0,36 при Р₀ = 0,474 показывает, что профлавин практически неподвижен, когда он связан с DNA. Наиболее отличительной чертой этих данных является рез­кое увеличение 1/Р — 1/3, наблюдаемое при 60 °С, которое вызвано терми­ческой денатурацией DNA, сопровождающейся высвобождением связанного профлавина.