Программа спецкурса «Биоинженерия»

ГБОУ ВПО НижГМА Минздравсоцразвития России,

1. 
   Структура ДНК и РНК. Пуриновые и пиримидиновые основания. Комплементарные взаимодействия. структурная модель ДНК. A-, B- и Z-формы ДНК. Путь реализации генетической информации. Центральная догма молекулярной биологии. Изменение структуры хроматина при считывании генетической информации. Современная концепция гена. Структурные элементы гена. Модули, контролирующие транскрипцию, в эукариотических генах, кодирующих белки. Понятие о коровом промоторе, энхансерах, сайленсерах, инсуляторах и проксимальной промоторной области. Пост-транскрипционная модификация РНК. Альтернативный сплайсинг.
   

2. 
   Плавление и гибридизация ДНК. Факторы, влияющие на температуру плавления ДНК. Факторы, влияющие на скорость гибридизации. Кинетика гибридизации нуклеиновых кислот в растворе. Понятие о сложности ДНК. Связь между временем полуреассоции и сложностью ДНК. Кривая реассоциации ДНК, содержащей повторяющиеся элементы.
   

3. 
   Сложность генома. Размеры геномов. Определение термина «Геном». Корреляция между размером эукариоического генома и биологической сложностью видов. Повторяющиеся элементы в геноме. Определение терминов «Генотип» и «Фенотип». Связь между геномом и протеомом. Подходы к изучению генов, белков и геномов. Сложность анализа функции генов на уровне организма.
   

4. 
   Понятие о векторе. Основные компоненты вектора. Векторы на основе хромосомы фага λ. Космиды и их емкость. Использование космид и векторов на основе хромосомы фага λ. искусственные хромосомы BAC и YAC. Их емкость и применение. Приготовление библиотеки геномной ДНК. Виды геномных библиотек. Частичное расщепление ДНК рестриктазами. Репрезентативность библиотеки ДНК. Упорядоченные библиотеки ДНК.
   

5. 
   Отбор клонов из библиотек ДНК. Использование изотопов для мечения нуклеотидов. Приготовление гибридизационных зондов (ник-трансляция, амплификация со случайного праймера, мечение олигонуклеотидов с помощью полинуклеотидкиназы бактериофага T4, достраивание концов с помощью фрагмента Кленова).
   

6. 
   Секвенирование ДНК по методу Сэнгера. Дидезоксинуклеотиды. Ферменты, используемые для секвенирования по методу Сэнгера. Стратегия секвенирования больших геномов методом shotgun. Современные платформы секвенирования: 454, Solexa, soLid.
   

7. 
   Полимеразная цепная реакция. Основные компоненты ПЦР. Типичная программа ПЦР. Температура отжига праймеров. Влияние различных компонентов на эффективность ПЦР. Контроли, используемые при постановке ПЦР. Основные проблемы, возникающие при постановке ПЦР.Разновидности ПЦР: ПЦР с «горячим стартом», Multiplex PCR, Nested PCR, Амплификация длинных фрагментов ДНК. Термостабильные ДНК полимеразы. Использование смесей термостабильных полимераз. Количественный ПЦР (ПЦР в реальном времени). Принципы детекции сигнала. Типы зондов. Специфичность зондов. Оценка количественного сигнала – пороговый метод, метод анализа формы кривой. Области применения количественного ПЦР.
   

8. 
   Стратегия поиска генов в случаях, когда известна частичная последовательность белка или известен ряд гомологов из других организмов. ПЦР с вырожденным праймером. селективная супрессия ПЦР (ССП). Параметры, влияющие на ССП-эффект. Введение инвертированных концевых посторов в структуру ДНК с помощью лигирования. Регуляция средней длины cложных продуктов ПЦР с помощью ССП. Амплификация фрагментов ДНК фланкирующих участок с известной последовательностью. Inverse PCR. Vectorette PCR. Схема метода амплификации концевых фрагментов ДНК с использованием селективной супрессии ПЦР.
   

9. 
   Особенности выделения РНК. Выделение мРНК эукариот. Визуализация РНК на гель-электрофорезе. Нозерн блот. Обратные транскриптазы. Синтез кДНК обратной транскриптазой. Обратная транскрипция-ПЦР. Синтез кДНК. Схема приготовления двухцепочечной кДНК. Обогащение полноразмерными последовательностями кДНК. Методы Capture, Cap-trapper, Oligo-Capping. методы приготовления кДНК из небольших количеств биологического материала. Marathon метод получения амплифицированной кДНК. Недостатки технологии Marathon. Репрезентативность образцов кДНК. Приготовление кДНК по технологии SMART. Амплификация образцов кДНК. Регуляция длины амплифицированной кДНК. Источники фоновой амплификации при приготовлении кДНК по технологии SMART. Репрезентативность образцов кДНК.
   

Лукьянов С.А.