Реттілік днқ молекуласындағы нуклеотидтердің нақты орналасу ретін анықтау процесі деп аталады
жүктеу/скачать 20.49 Kb.
|
|
Кіріспе Реттілік ДНҚ молекуласындағы нуклеотидтердің нақты орналасу ретін анықтау процесі деп аталады. Өткен ғасырдың 70-ші жылдарында Сэнгер мен Максам – Гилбер - том ашқан жаңалықтар биология ғылымдары әлемінде төңкеріс жасауға мүмкіндік берді, бұл реттілік биология, медицина, криминалистика және т. б. саласындағы көптеген тергеушілердің жұмыс құралы болды. соңғы 40 жыл ішінде ДНҚ секвенциясы аспаптық тұрғыдан айтарлықтай дамыды жабдықтар, құралдар және секвенирлеу әдістері. Заманауи әдістер қолдану ауқымын кеңейтуге, дәлдікті, өнімділікті және реттіліктің сенімділігін арттыруға мүмкіндік береді. Секвенирлеудің қол жетімділігі әртүрлі биологиялық объектілер туралы білім көлемінің едәуір артуына әкелді. Жартылай ақпарат мәліметтер базасын толтырады, дос- дүние жүзіндегі көптеген зерттеушілер үшін мылқау. Бүгінгі таңда әртүрлі салалардың зерттеушілері мен мамандары бұл деректерді көптеген мақсаттарда пайдаланады, соның ішінде ауылшаруашылық дақылдарының, мал шаруашылығының сапасы мен өнімділігін жақсарту, диагностиканы жақсарту, көптеген күрделі ауруларды болжау және емдеу, сот сараптамасындағы прогресс және т. б. арқылы қанағаттанарлық қауіпсіздікті қамтамасыз ету. Бірқатар мақалалар ДНҚ секвенирлеу шараларын үш аспект бойынша қарастыруды көздейді: секвенирлеудің әртүрлі ұрпақтарының технологиялық тарихы, деректер хаттамалары және био - информатика құралдары. Бұл мақалада бірінші буын секвенирлеуінен (first generation sequencing (FGS)) үшінші буын секвенциясына (third generation sequencing (TGS)) дейінгі технологиялық тарих қарастырылады. 1. ДНҚ СЕКВЕНИРЛЕРІНІҢ ҰРПАҚТАРЫ ДНҚ секвенциясы - тірі жасушада жұмыс істейтін әртүрлі ақуыздарды кодтайтын полинуклеотидте нуклеин қышқылдарының (A, T, G және C) негіздерінің дәйекті орналасуын анықтаудың эксперименттік әдісі. Адамның ДНҚ - сындағы кодтау және кодтамайтын тізбектердің толық жиынтығы геном деп аталады. Геном организмнің қалыпты өмір сүруі үшін қажетті барлық ақуыздар туралы ақпаратты тасымалдайды. Био-логикалық тізбектер бір - біріне ұқсастықтың күрделі үлгілерін көрсетеді. Мұны кейінге қалдыру арасындағы ұқсастықтарды іздеу арқылы анықтауға болады. Ол үшін біз организмнің бүкіл геномдық тізбегін білуіміз керек. Максам мен Гилберт ұсынған химиялық деградация әдісінің технологиялары, 1977 жылы сангер командасы жасаған тізбекті дезокси-терминациялау әдісі және 1990 жылдары флуоресценциямен белгіленген Автоматты реттілік. Салыстырмалы қарапайымдылығының арқасында Сэнгер әдісі FGS-те басым ме-Тод болды. Сэнгер секвенциясы шамамен 5375 нуклеотидті ұстайтын phix 174 бактериофагын ретке келтіруге мүмкіндік берді. Бұл зерттеу 1977 жылы 2003 жылы бірінші толық реттелген геном болды. Адам геномы консорциумының (hgp) халықаралық жобасы әлемнің көптеген зертханаларында 13 жылдық зерттеулерден кейін аяқталған бүкіл адам геномын сәтті ретке келтірді және картаға түсірді. Екінші ұрпақ секвенциясы (SGS) немесе келесі ұрпақ секвенциясы (NGS) миллиондаған немесе миллиардтаған ДНҚ тізбегін реттей алатын жоғары өнімді ДНҚ секвенирлеу технологияларына жатады. Сонымен қатар, тізбекті анықтау процесі ферментативті репликация немесе күшейту арқылы жүреді, бұл айтарлықтай өткізу қабілеттілігін және мақсатты аймақтардың бірнеше рет реттілігін қамтамасыз етеді. Үшінші буын секвенциясы (TGS) ұзақ және дәл секвенирлеу нәтижелерін алу үшін нуклеотидтерді бір - бірден қосу арқылы реттеледі, ал күшейту технологиясы қолданылмайды. Бір жасушалы реттілік TGS технологиясына да тән. 2. БІРІНШІ БУЫН СЕКВЕНЦИЯСЫ 1970 жылдардың аяғы мен 1980 жылдар генетика мен геномика үшін маңызды кезең болды. Полимеразды тізбекті реакцияның (ПТР) өнертабысы ДДҰ жасады- ДНҚ-ны күшейтуге және бүкіл геномды ретке келтіретін алғашқы ДНҚ секвенирлеу технологияларын жасауға болады. Бірінші буын секвенирлеу әдістері ретінде қарастырылған Сангер секвенциясы және Максам - Гилберт секвенциясы геномикада 40 жылға жуық уақыт бойы басым болды. Олар кейінгі секвенирлеу технологияларына жол ашты. 2.1 Максам-Гилберт реттілігі 2.1.1. Тарих Максам-Гилберт (Максам – Гилберт) [1, 2] сек - венация — ДНҚ секвенирлеуінің алғашқы платформаларының бірі. Бұл реттілік әдісі әдетте химиялық ыдырау әдісі ретінде белгілі. Оны 1977 жылы Гарвард университетінің студенті Аллан Мак-сам Уолтер Гилбертпен бірге жасаған және ДНҚ - ны әртүрлі химиялық агенттермен өңдеу кезінде нук-леотидке тән химиялық деградацияға негізделген. Әдіс өзінің техникалық күрделілігіне байланысты өзектілігін жоғалтты. 2.1.2. Принципі 1976 жылы А. Максам мен В. Гилберт бір шетінен алынған ДНҚ фрагментінің ерекше химиялық деградациясына негізделген секвенирлеу әдісін жасады (сурет. 1). Химиялық деградация арқылы ДНҚ секвенирлеу әдісі арнайы реагенттердің әсерінен таңбаланған ДНҚ фрагментінің шектеулі бөлінуіне негізделген. Бұл әдіспен реттіліктің міндетті шарты-тек бір ұшында ДНҚ фрагментінің болуы. Ұзындығы тек бір нуклеотидке дейін өзгеретін ДНҚ фрагменттерін бөлуге қабілетті жоғары ажыратымдылықтағы полиакриламидті гельдегі жоғары вольтты электрофорез арқылы деградация өнімдерінің мөлшері бойынша бөлінуі және гельдің кейінгі радиоавтографиялық графикасы ДНҚ нуклеотидтер тізбегін анықтауға мүмкіндік береді. Химиялық деградация реакциясын жүргізудің алғашқы қадамы-белгілі бір нуклеотидтердің әртүрлі химиялық агенттермен шектеулі модификациясы. Агенттің концентрациясы және оның ДНҚ молекулаларына әсер ету ұзақтығы әр молекулада тек бір нуклеотүз өзгертілетіндей етіп таңдалады. Нуклеотидтердің әр түрі немесе олардың комбинациясы үшін шектеулі модификация мен сандық бөлінудің жеке реакциялары жасалады. Осылайша, реакциялар тізбегі олигонуклеоид молекулаларының қоспасын шығарады, олардың мөлшері бір нуклеоид үшін әр түрлі болады және бір ұшында белгі (әдетте радиоактивті) болады. Таңбаланған молекулалардан басқа, олигонуклеотидті фрагменттер де реакция қоспасында болады, олар тегтерді көтермейді, бірақ радиоавтографиялық кезеңде олар көрінбейтін болады. Реакция өнімдерін денатурациялаушы полиакрил - МИД гелі секвенирлеуінің көрші жолдарында және радиоавтография сатысында бөлгеннен кейін рентген-новская пленкада ДНҚ жолақтарынан баспалдақ көрінеді, оның оқылуы ДНҚ нуклеотидтер тізбегін қалпына келтіруге мүмкіндік береді. 2.1.3. Артықшылықтары мен кемшіліктері Максам - Гилбертті секвестрлеу процедурасының негізгі тартымдылығы-бұл әдісте қолданылатын ДНҚ үлгісі Бір тізбекті немесе екі тізбекті болуы мүмкін. Максам-Гилберт әдісі белгілі бір уақытта Сэнгер әдісіне артықшылық берді, өйткені Сэнгер әдісі санаудың әр басталуы үшін Бір тізбекті ДНҚ-ны клондауды қажет етті- лау. Максам-Гилберт әдісін ДНҚ ақуызының өзара әрекеттесуін және ДНҚ - ның эпигенетикалық модификацияларын талдау үшін де қолдануға болады. Максам-Гилберттің реттілігінің негізгі шектеуі зиянды химиялық заттарды және рентген сәулелері мен радиоактивті белгілер сияқты әдістерді қолдану болды. Осы әдістерді кеңейту мен қолданудағы еңбек, сондай - ақ белгілі нейротоксин гидрасын қолдану қажеттілігі әдісті тиімсіз етті және технологияны одан әрі дамыту процесінде аз қолданылады. 2.2. Сэнгер секвенирлеу әдісі 2.2.1. Тарих Сэнгер секвенциясы [4-6] ДНҚ секвенирлеудің алғашқы әдістерінің бірі болып табылады. Фредерик Сангер өзінің әріптестерімен бірге инсулиннен, содан кейін РНҚ-дан, содан кейін ДНҚ-дан секвенирлеу технологиясын жасау бойынша зерттеулерін жүргізді. Оның зерттеулері мето - Ду секвенирлеуге немесе Сэнгер тізбегін үзуге жол ашты, 1977 ж.1980 ж. Сэнгер химия бойынша екінші Нобель сыйлығын алды, бұл оны бір санатта екі рет алған екі нобель сыйлығының лауреаттарының біріне айналдырды. Технологияны Applied Biosystems коммерцияландырды. Бұл әлемнің көптеген зертханаларында жүздеген Sanger секвенирлеріне негізделген Адам геномы жобасында бүкіл адам ДНҚ - сын ретке келтіру үшін қолданылатын әдіс болды. 2.2.2. Принципі Химиялық реакция әрқайсысында шаблондық ДНҚ, праймерлер, ДНҚ полимераза және төрт dNTP бар төрт реакциялық түтікте жүзеге асырылады, олардың біреуі ра - диоактивті түрде белгіленген. ДНҚ үлгісі барлық төрт стандартты дезоксинуклеотидті (datp, dGTP, dCTP және dTTP) және ДНҚ полимеразасын қамтитын жеке реттілік реакцияларына бөлінеді. Әрбір реакцияға дидеоксинуклеотидтердің төрт рехінің біреуі ғана қосылады (ddATP, ddGTP, ddCTP немесе ddTTP), ал басқа қосылған нуклеотидтер жиі кездеседі. Денатурадан кейін және праймерді күйдіргеннен кейін ДНҚ полимераза ферменті жаңадан синтезделген ДНҚ тізбегіне dNTP қоса бастайды және ddNTP қосылса, реакция тоқтайды. Бұл барлық төрт реакциялық түтіктерде әртүрлі мөлшердегі ДНҚ жіптерін бөлек жинауға әкеледі. Содан кейін жеке реакцияның нәтижесі поли - акриламидті гельдің жеке ұңғымаларына орналастырылады. Радиоактивті дақ белгілі бір позицияға енгізілген DDNTP бар ДНҚ фрагменттерін көрсетеді. Кейін нуклеотид-бөлгіш гельдегі дәлдік төменнен жоғарыға қарай анықталады, ал Терминатордың әртүрлі жолақтарындағы нуклеотидтер тізбегі нук-леотидтер тізбегінің үлгісін береді (сурет. 2). 2.2.3. Артықшылықтары мен кемшіліктері Сэнгер секвенциясы зерттеушілерге мутацияларды және генетикалық аурулардың негізгі себебін анықтауға көмектесті. Бұл қысқа тандемді қайталауды анықтаудың және жеке гендерді секвестрлеудің ең жақсы әдісі. Алайда, бұл әдістің ең үлкен кемшілігі-оның өткізу қабілеттілігінің төмендігіне байланысты тұтынатын уақыт мөлшері. Әдіс бір уақытта салыстырмалы түрде қысқа ДНҚ - ны (300-1000 негізгі жұпқа дейін) өңдей алады. 2.3. Automated DNA Sequencing 2.3.1. Тарих Екі әдіс те: Сангер мен Максам – Гилберт — көп уақытты қажет ететін және күрделі болды. 1986 жылы, Leroy Hood және оның әріптестері радиоактивті белгілердің орнына флуоресцентті белгілерді қолдану арқылы Сэнгердің се - квенирлеу әдісін жетілдірді. Нуклеотидті праймерлерді белгілеу үшін төрт флуоресцентті бояғыштардың бірі қолданылады. Әрбір бояғыш төрт ddNTP біреуімен бөлек реттілік реакциясында қолданылады. Секвенирлеу реакциялары аяқталғаннан кейін барлық төрт реакция полиакриламидті гельдің бір жолағында (lane) араласады және талданады. IC-таңбаланған төрт түрлі ddNTP пайдалану төрт түрлі толқын ұзындығы бар флуоресцентті затбелгі төрт бөлек реакцияның орнына бір түтікте секвенирлеу реакциясын жүргізуге мүмкіндік береді. Бұл әдіс 1990 жылдардың басында Harold Swerdlow және оның әріптестері ДНҚ секвенирлеу әдісінде капиллярларды қолданған кезде жетілдірілді. Бұл капиллярлар өте кішкентай (ішкі диаметрі 50 мкм) және жұмыс уақытын азайту үшін жоғары кернеулермен жұмыс істейді. 1993 жылы B. L. Karger полиакриламидті тұтқырлығы төмен бөлу матрицасымен алмастырды; кейінірек, 1995 ж. Zhang жоғары сапалы нуклеотидтер тізбегін алу үшін 60 °C температурада да тұрақты болатын кросс-сілтеме жасалмаған полимерді жасады. 2.3.2. Принципі Бұл секвенирлеу әдісінің негізгі принциптері Сангердің секвенирлеуіне ұқсас [8], бірақ процедура автоматтандырылған және реакциялар барлық төрт диде - зоксинуклеотидтрифосфаты бар бір түтікте жүзеге асырылады, олардың әрқайсысы белгілі бір толқын ұзындығында жарық шығаратын төрт түрлі флуоресцентті бояғыштарды пайдаланады. Алынған дәйектілік деректері компьютердің көмегімен жиналады және талданады (сурет. 3). 2.3.3. Артықшылықтары мен кемшіліктері Автоматтандырылған ДНҚ секвенерлері қымбатқа түседі, сонымен қатар тізбектің қайталанатын бөліктерін ретке келтіру қиын. Қарамастан қосулы келесі тізе секвенирлерінің жаңа ашылулары, Сен-Гера бойынша автоматты секвенирлеу дәлдігі мен оқу ұзындығына байланысты әлі де "алтын стандарт - том" болып саналады. Сонымен қатар, жаппай пайдалану үшін бұл секвенирлеу әдісі баяу және қымбат. 2.4. Пиросеквенция 2.4.1. ДНҚ СЕКВЕНИРЛЕУ ӘДІСТЕРІНІҢ ҰРПАҚТАРЫ 7 а б в Сурет. 3. Автоматты ДНҚ секвенциясы. а-капиллярлық электрофорез жүйесі; б-флуоресцентті белгілерді лазерлік анықтау; В - ДНҚ тізбегінің электрофо-реграммасы [9] Пиросеквенция 1987 жылы ДНҚ полимераза белсенділігін үздіксіз бақылау үшін қолданылатын әдіс ретінде (Nyren, Lundin). 1988 жылы Эдвард Химан ДНҚ секвенирлеу әдісін құру бойынша жұмысын жалғастырды. 1996 жылы Пиросеквенирлеу платформасын Ronaghi et al. 10 жылға жуық уақыттан кейін, 2005 жылы, Ротберг және оның әріптестері 1996 жылы жасалған пиросеквенирлеу тәсілінің негізінде қол жетімді келесі буынның алғашқы коммерциялық секвенирін ұсынды.кейінірек 454 Life Sciences содан бері Roche Diagnostics сатып алған параллель пиросеквенирлеу сенімін жасады. 2.4.2. Принципі Осы технологияға сәйкес [10, 11] нуклеотидтердің төрт түрінің ерітінділері ДНҚ фрагменттерінің реттілігі процесінде біртіндеп қосылады және әр реакциядан кейін жуылады. Келесі нуклеотид дайындалған комплементарлы тізбекке қосылған кезде Бір тізбекті ДНҚ шаблоны босатылған пирофосфаттың детекторы оны люцифераза ақуызымен байланыстыру және нәтижесінде жарық сигналын алу арқылы жүреді. Реакция барысында ДНҚ-ның комплементарлы тізбегі аяқталады, ал нуклеотидтердің реттілігі пирограммадағы шыңдар түріндегі жарық сигналдары бойынша анықталады, олардың қарқындылығы келесі реакция қоспасынан ДНҚ тізбегіне енгізілген бір түрдегі нуклеотидтердің санына пропорционалды (сурет. 4). 454 Life Sciences модификациясының негізі яви-бұлан оларды ретке келтіру үшін көптеген мың ДНҚ фрагменттерін бір уақыттық параллель дайындаумен эмульсиялық ПТР қолдану (сурет. 5). Сынама дайындаудың барлық алдын ала кезеңдерін жүргізгеннен кейін, басқа пиросеквенирлеу реактивтерімен араласқан нуклеотидтердің төрт түрінің әрқайсысы микросфералармен толтырылған бірнеше миллиард тесіктері бар (бір тесік - бір микросфера) субстрат орналастырылған ағынды камераға беріледі. Әрбір микросферада ПТР - дан кейін бастапқы ДНҚ фрагменттерінің бірінің көптеген жүздеген мың ко-пийлері болады. Егер ұңғымаға ДНҚ шаблонының Бір тізбекті тізбегіндегі кезекті нуклеотидке қосылатын нуклеотидтер түрі түссе, онда полимераза осы нуклеотидтерді енгізеді, бұл реакциялар каскады арқылы Пи - рофосфаттың бөлінуіне және ұңғымадан жалпы жарық сигналының пайда болуына әкеледі. 2.4.3. Артықшылықтары мен кемшіліктері Пиросеквенцияның басты артықшылығы-уақытты үнемдеу, сондықтан процедураны уақыт режимінде жасауға болады. Геномдық матрица тізбегінің ондаған килобазаларын қамтитын жұптық оқу арқылы гаплотиптерді фазалауды және құрылымдық генетикалық вариацияларды анықтауды жеңілдетеді. Алайда, әдістің негізгі кемшілігі - оқуда жүйелік қателіктерге әкелетін кадрларды ауыстырудың маңызды қателіктерінің болуы (frameshift errors) [13]. Сондай - ақ, осы әдісті қолдана отырып, бір нуклеотидтен тұратын кеңейтілген аймақтарды бір секундқа бөлу мүмкін емес. Әдіс салыстырмалы түрде қысқа ұзындықтағы оқуларды ғана алуға мүмкіндік береді. 3. ЕКІНШІ БУЫН СЕКВЕНЦИЯСЫ Сангер секвенциясы ашылғаннан кейін шамамен 30 жыл бойы қолданылып келеді. Бұл процедура барысында шығындар мен уақыт шығындары үлкен проблема ретінде таныла бастады. Екінші буын секвенциясы деп аталатын секвенирлеу технологиясының келесі толқыны, жүктеу/скачать 20.49 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|