Введение в флуоресценцию

Введение в флуоресценцию

В веществах, проявляющих значительную флуоресценцию, электроны в основном делокализованы и формально расположены на сопряженных двойных связях.

*Правильнее было бы сказать, что спины этих электронов спарены. Спаренны­ми обычно называют электроны, находящиеся на одной и той же орбитали, — Прим. Ред.

** Мультиплетностью состояния называют величину т= 2s + 1, где s — суммар­ный электронный спин данного состояния. Так, для синглетных состояний т= 1 и s = 0, для триплетных — т= 3 и s = 1 — Прим.ред.

РИС. 1.1. Структуры типичных флуоресцирующих соединений.

*Автор здесь имеет в виду ионы различных элементов. — Прим. рец.

РИС. 1.2. Спектры поглощения и испускания флуоресценции перилена и хинина (по данным [2]).

Спектры испускания не могут быть правильно изображены одновременно в шка­ле длин волн и в шкале волновых чисел. В данном случае использовано правильное изображение в шкале волновых чисел. Длины волн приведены для удобства (см. гл. 2).

Единственным заметным исключением является группа элементов, обычно называемых лантаноидами [ 1]. Флуоресценция ионов европия и тербия выз­вана переходами электронов между f-орбиталями, которые экранированы от растворителя более высокими заполненными орбиталями.

Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции — это зависимость интенсивности флуоресценции от длин волн (в нанометрах) или волновых чисел (в см^-1). Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены на рис, 1.2. Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от хими­ческой структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуорофор растворен. Спектры некоторых соединений, таких, как перилен, име­ют четкую структуру, обусловленную отдельными колебательными уров­нями энергии основного и возбужденного состояний *. Другие соединения, такие, как хинин, имеют спектры без колебательной структуры.

*Колебательная структура спектров испускания определяется колебательными подуровнями основного, а не возбужденного электронного состояния (подробнее см„ ниже). — Прим.. peд,

Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уров­ней энергии, предложенная Яблонским [ 3], Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S₀, S, и S₂ соответственно (рис. 1.3), Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебатель­ных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Влияние раство­рителя во внимание не принимается, оно будет подробнее рассмотрено в гл. 7. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется, чтобы наглядно показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происхо­дит примерно за 10^-15 с, время, слишком короткое для заметного смеще­ния ядер (принцип Франка - Кондона).

Энергетическая щель между различными колебательными уровнями энергии видна из спектра испускания перилена (см. рис. 1.2). Отдельные максимумы испускания (а следовательно, и колебательные уровни энергии) отстоят друг от друга примерно на 1500 см^-1. Относительное число мо­лекул перилена, находящихся в колебательных состояниях 0 и 1, описыва­ется распределением Больцмана:

Отношение R числа молекул в двух сос­тояниях с разностью энергий Е дается выражением

R = e^-E/kT (1.1)

где k - константа Больцмана; Т - абсолютная температура, К. При ком­натной температуре 300 К отношение R равно~0,01. Следовательно, боль­шинство молекул будет находиться в самом нижнем колебательном сос­тоянии; именно такие молекулы и поглощают свет.

РИС. 1.3. Диаграмма Яблонского.

За поглощением света обычно следует несколько других процессов. Возбуждение флуорофора, как правило, происходит до некоторого высшего колебательного уровня состояний (S₁ либо S₂). 3а некоторыми редкими ис­ключениями, для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая релаксация на самый нижний колебательный уровень состояния S₁. Этот процесс называется внутренней конверсией и происходит большей частью за 10^-12 с. Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки к 10^-8 с, внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается до про­цесса испускания. Следовательно, испускание флуоресценции чаще всего осуществляется из термически равновесного возбужденного состояния. Аналогично поглощению обратный переход электронов на самый нижний электронный уровень также приводит к колебательно возбужденному сос­тоянию (рис. 1.3). Термическое равновесие достигается за время порядка 10^-12 с. Интересным следствием из такого рассмотрения является то, что спектр поглощения молекулы отражает колебательную структуру возбуж­денных электронных состояний, а спектр испускания - колебательную струк­туру основного электронного состояния. В большинстве случаев электрон­ное возбуждение не сильно изменяет расположение колебательных уровней энергии. В результате этого колебательные структуры, проявляющиеся в спектрах поглощения и испускания, сходны.

Молекулы в состоянии S ₁ могут также подвергаться конверсии в пер­вое триплетное состояние Т_1. Испускание из Т₁ называемое фосфоресценцией, обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из S₁ в Т₁ называется интеркомбинационной конверсией. Переход из Т₁ в основное состояние запрещен, в результате чего константа скорости такого испускания на несколько порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции. На ис­пускание флуоресценции могут влиять и другие факторы, не показанные в явном виде на рис. 1.3: влияние растворителей, релаксация растворителя, тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях. Все они будут рассмотрены детально в последующих разделах книги.
1.2 Характеристики испускания флуоресценции

Для явления флуоресценции известно несколько основных характе­ристик. Существуют и исключения, но они редки. Если какая-либо из ниже­ перечисленных характеристик отсутствует у данного флуорофора, можно сделать вывод о некоторых особых свойствах этого соединения,

1.2.1. Стоксов сдвиг

Как правило, всегда наблюдается сдвиг испускания относительно пог­лощения в сторону больших длин волн, т.е. потеря энергии (исключение — атомы в газовой фазе). Это явление впервые наблюдал Стоке в 1852 г. в Кембридже [ 4], используя при этом аппаратуру, принцип действия которой изображен на рис. 1.4. Источником ультрафиолетового возбуждения слу­жил солнечный свет, пропущенный через пластинку из голубого стекла. Пе­ред приемником в качестве желтого фильтра стоял стакан с вином, Флуоресценция хинина лежит в области 450 нм и поэтому хорошо заметна невоору­женным глазом. В настоящее время для определения величины стоксова сдвига используют другие методы.

Потери энергии между возбуждением и испусканием неизменно наблю­даются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая релаксация на нижний колебательный уровень состояния S₁. К тому же обычно происходит переход на возбужденные колебательные уровни состояния S₀ (см. рис. 1.3), что приводит к дополнительной потере колебательной энергии.

РИС. 1.4. Схема первой установки для обнаружения стоксова сдвига.

Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния .S₁. Эта релаксации про­исходит за время порядка 10^-12 с и является, по-видимому, результатом сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания. Существуют исключения (например азулен), когда испускание может происходить как из S₂-, так и из S₁-состояния. Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ве­дет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обус­ловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно воз­можно для тех флуорофоров, которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем.

Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зер­кальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу изS₀ в S_1. Это особенно наглядно в случае перилена (см. рис. 1.2). Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение, и испускание обусловлены одними и теми же перехода­ми, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний S₀ и S₁. Для многих молекул различное распределение электронов в сос­тояниях S₀ и S₁ существенно не влияет на эти уровни энергии. Согласно принципу Франка - Кондона, все электронные переходы происходят без из­менения межъядерного расстояния. В результате, если данная вероятность перехода (фактор Франка - Кондона) между нулевым и вторым колебатель­ными уровнями максимальна при поглощении, соответствующий переход будет наиболее вероятен также и в испускании (рис. 1.5).

РИС. 1.5. Правило зеркальной симметрии и факторы Франка - Кондона.

Необходимым условием для зеркальной симметрии является представ­ление спектров поглощения и испускания в соответствующих единицах. Наи­лучшая симметрия должна существовать между модифицированными спек­трами (v)/v и F(v)/v³, где  (v) - коэффициент поглощения, соответствую­щий волновому числу v, a F(v) - относительный поток фотонов в интерва­ле волновых чисел Δ v [ 5]. Соответствие между такими спектрами обычно наблюдается для полиядерных ароматических углеводородов.

Несмотря на то, что правило зеркальной симметрии часто выполняет­ся, из него существует множество исключений. В качестве примера на рис. 1.6 приведены спектры флуоресценции дифенила. В спектре испуска­ния видна колебательная структура, которая отсутствует в спектре погло­щения. Такое отклонение от правило зеркальной симметрии обычно указы­вает на различное геометрическое расположение ядер в основном и возбужденном состояниях.

РИС. 1.6. Спектры поглощения и испускания дифенила.

Кроме геометрических перегруппировок отклонение от правила зеркальной симметрии могут вызвать также реакции в возбужденных состояниях. Так, например, для фенола и тирозина наблюдается по две полосы испускания, причем длинноволновое испускание более заметно при высоких концентрациях акцепторов протона (см, рис, 11,18). Величина рК_а фенольной гидроксильной группы уменьшается от 11 в основном состоянии до 4 в возбужденном состоянии.

РИС. 1.7. Спектры испускания пирена и его эксимера (по данным [6]).

Относительная интенсивность в максимуме флуоресценции эксимера (470 нм) уменьшается при понижении концентрации пирена от 6x10^-3 М (верхняя кривая) до 0,9x10^-1 М (нижняя кривая).
Вслед за возбуждением фенольный протон переходит к акцепторам про­тона в растворе. В зависимости от концентрации этих акцепторов в спектре испускания может преобладать флуоресценция либо фенола, либо фенолята. Примечательно то, что, даже несмотря на отсутствие активных групп, мно­гие полиядерные ароматические углеводороды также вступают в реакции в возбужденных состояниях. Так, например, молекулы пирена в возбужденном состоянии объединяются в комплексы, называемые эксимерами (сокращение от excited dimers — возбужденные димеры). Испускание эксимеров смешено в длинноволновую область по сравнению с испусканием мономеров пирена, в нем отсутствует колебательная структура (рис.1.7), Такие полиядерные ароматические углеводороды, как пирен, перилен и антрацен, образуют с ами­нами комплексы с переносом заряда. Комплексы, образующиеся в возбужден­ном состоянии, называют эксиплексами.
1.3. Времена затухания и квантовые выходы флуоресценции

Часто измеряют времена затухания и квантовые выходы флуоресцирую­щих соединений. Смысл этих параметров хорошо виден из модифицированной диаграммы Яблонского (рис. 1.8). На этой диаграмме мы не указываем по­дробно отдельные процессы релаксации, приводящие к релаксированному состоянию S₁, а обращаем большое внимание на процессы, которые ответст­венны за возвращение в основное состояние. В частности, нас интересует константа скорости излучательной дезактивации флуорофора (Г) и константа скорости безызлучательной дезактивации в состояние S₀(k).

Q = Г/(Г+k) (1.2)

Квантовый выход близок к единице в том случае, если константа скорости безызлучательной дезактивации много меньше константы скорости испуска­ния, т. е. k « Г. Заметим, что энергетический выход флуоресценции всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь. Для удобства мы сгруппировали все возможные процессы безызлучательной дезактивации в одну константу скорости k.

РИС. 1.8. Модифицированная диаграмма Яблонского.

Время жизни возбужденного состояния определяется как среднее время, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Обычно время затухания флуоресцен­ции -10 нс, Для флуорофора, описываемого диаграммой Яблонского (рис. 1.8), время затухания равно

τ = 1/(Г +k) (1.3)

τ ₀ = 1/Г (1.4)

Q= τ / τ₀ (1.5)

Квантовый выход и время жизни могут изменяться под действием лю­бых факторов, влияющих на константы скорости. Например, молекула может оказаться неспособной флуоресцировать из-за большой скорости внутренней конверсии либо малой скорости испускания. Сцинтилляторы обычно выбира­ют за их высокие квантовые выходы, которые являются результатом боль­ших значений Г. Им обычно соответствуют короткие времена жизни, поряд­ка 1 нс. Флуоресценция ароматических соединений, содержащих группы N0₂, обычно слаба, в первую очередь из-за большой величины k. Переход триплет— синглет запрещен по симметрии, и константы скорости спонтанного испус­кания составляют ~10³ с-¹ или меньше **. Поскольку значения k близки к 10⁹ с-¹, квантовые выходы фосфоресценции малы при комнатной температу­ре. Из уравнения (1.2) можно получить квантовые выходы фосфоресценции, равные 10 ^-6.

*Правильнее называть его радиационным (излучательным) временем жизни. — Прим. ред.

**Автор приводит слишком большое значение k для внутримолекулярной безызлучательной дезактивации триплетных состояний, которая встречается редко — лишь для молекул, претерпевающих химические превращения (в частности, изомеризацию). Из-за спинового запрета безызлучательный интеркомбинационный переход Т₁ → S₀ для большинства молекул имеет константы скорости k < 10³ с^-1. Однако в жидких растворах вследствие тушения триплетных состояний примесями (особенно кислородом), присутствующими даже в ничтожных концентрациях (< 10^-5 М), времена жизни триплетных состояний обычно составляют 10^-6 — 10^-4 с. Поэтому квантовые выхо­ды фосфоресценции в жидких растворах обычно меньше 10^-3,. При очень тщательной очистке растворителей удается наблюдать фосфоресценцию и в жидких растворах, например кетонов в воде. Для некоторых соединений (например, диацетила), имею­щих повышенные константы скорости испускания фосфоресценции и малые констан­ты скорости тушения триплетных состояний кислородом, наблюдается фосфоресценция и в жидких растворах в обычных условиях. — Прим. ред.
1.4. Анизотропия флуоресценции

Флуорофоры преимущественно поглощают те фотоны, электрические век­торы которых направлены параллельно моменту перехода флуорофора. Момент перехода имеет определенную ориентацию в молекуле флуорофора. В изотроп­ных растворах молекулы флуорофоров ориентированы случайным образом. При возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются те моле­кулы флуорофора, для которых дипольный момент перехода при поглощении параллелен электрическому вектору возбуждающего света (см. разд. 5.2.1). Такое селективное возбуждение частично ориентированного набора флуоро­форов (фотоселекция) приводит к частично поляризованному испусканию флу­оресценции. Для каждого флуорофора моменты перехода для поглощения и испускания имеют фиксированную ориентацию, и угол между ними определя­ет максимальную измеряемую анизотропию r₀, см. уравнение (5.20)]. Ани­зотропия ( r) и поляризация (Р) флуоресценции выражаются уравнениями

гдегде I _|| и I _┴ интенсивности флуоресценции вертикально (II) и горизонталь­но (_┴) поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикаль­но поляризованным светом. Анизотропия и поляризация - это выражения од­ного и того же явления, поэтому их можно взаимозаменять, используя урав­нения (5.3) и (5.4). Некоторые факторы могут уменьшать измеряемую вели­чину анизотропии до значений ниже максимального. Самый распространен­ный из них — вращательная диффузия, которая происходит за время жизни возбужденного состояния и смещает испускающий диполь флуорофора. Из­мерение этого параметра дает информацию об относительном угловом сме­шении флуорофора в интервале между поглощением и испусканием. Перенос энергии возбуждения между флуорофорами также приводит к уменьшению анизотропии.

Предположим, что единственным существенным процессом, приводящим к уменьшению анизотропии, является вращательная диффузия. Тогда измеряемая анизотропия определится выражением

,

где r₀ - анизотропия, которая должна была бы измеряться в отсутствие вра­щательной диффузии, а φ - время корреляции для процесса диффузии, опре­деляемое как

φ =ηV/kТ (1.9)

где η - вязкость раствора; k - константа Больцмана; Т - абсолютная темпе­ратура; V -объем вращающегося фрагмента. Рассмотрим белок с молеку­лярной массой 50 000. Поскольку удельный объем белков составляет 0,73 мл/г, можно легко подсчитать, что при 25° С в водном растворе (n = 0,00894 П) ожидаемое время корреляции составляет 13 нc для безводной сферы. Поскольку белки гидрагированы, фактическое время корреляции, по-видимому, должно быть больше. Однако существенным является то, что вре­мена вращательной корреляции для большинства белков сравнимы с типич­ными временами затухания флуоресценции. Поэтому результаты измерения анизотропии флуоресценции зависят от всех факторов, влияющих на скорость вращательной диффузии. По этой причине измерения поляризации флуорес­ценции широко используют для изучения гидродинамических свойств макро­молекул.

Флуоресцентная спектроскопия - эффективный метод исследования ди­намических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Такая возможность связана в первую очередь с временем жизни возбужден­ных состояний. Вследствие принципа Франка - Кондона абсорбционная спек­троскопия может дать информацию только об усредненных характеристиках основного состояния молекул, поглотивших свет. Поскольку только те мо-иекулы растворителя, которые непосредственно соседствуют с поглощающими частицами, будут влиять на их спектр поглощения, абсорбционная спектро­скопия может дать информацию лишь о некоторой средней сольватной оболоч­ке растворителя, соседствующей с хромофором, и не отражает молекуляр­ную динамику. •

В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными функциями всех процессов, протекающих за вре­мя жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участ­вовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до 100 А от флуорофора. Хотя может показаться, что 10 нс - слишком корот­кий промежуток времени, фактически это большое время по сравнению с временем движения малых молекул в жидком растворе. Вращательная диффу­зия связанных с белками и мембранами флуорофоров также укладывается в этот временной диапазон.

Тушение флуоресценции молекулярным кислородом по механизму стол­кновений является показательным примером размеров пространственного и временного диапазонов, представляемых временем затихания флуоресцен­ции. Если флуорофор, находящийся в возбужденном состоянии, сталкивает­ся с молекулой кислорода, он возвращается в основное состояние без испус­кания фотона. Коэффициент диффузии кислорода в воде при 25°С равен 2,5 •10^-3 см²/с. Среднее расстояние [(Δх²)^1/2], на которое может диффун­дировать молекула кислорода за 10^-3 с, определяется уравнением Эйнштейна:

Δ x² = 2Dτ (1.10)

Расстояние [ ( Δх²)^1/2] составляет ~ 70 Å, что сравнимо с толщиной биологи­ческой мембраны или диаметром белка. Для некоторых флуорофоров време­на жизни достигают 400 нc, поэтому можно наблюдать диффузию молекул кислорода на расстояния свыше 450 А. Напротив, измерения поглощения дают сведения лишь о непосредственном окружении флуорофора и, следова­тельно, о мгновенном усредненном окружении.

Влияние молекулярной динамики на спектры флуоресценции также обна­руживается при рассмотрении энергий. Органические молекулы, как правило, поглощают свет в диапазоне длин волн 200 - 500 нм, что соответствует энергиям от 140 до 60 ккал/ моль. Вслед за поглощением у флуорофора из­меняется (обычно возрастает) дипольный момент. Если молекулы растворителя также имеют дипольные моменты, они переориентируются во­круг диполя возбужденного состояния, понижая тем самым его энергию. Этот процесс называется релаксацией растворителя и происходит в жидких растворах за 10^-12 с. Релаксация растворителя может приводить к значи­тельным стоксовым сдвигам. В белках триптофановые остатки поглощают свет с длиной волны 280 нм, а испускают флуоресценцию при —350 нм. Таким образом, за несколько наносекунд, проходящих до процесса испус­кания, расходуется 20 ккал/моль.

В основе любого эксперимента лежат измерение некоторой величины и корреляция полученных результатов с явлением, представляющим интерес для исследователя. Временной диапазон между поглощением света и после­дующим его испусканием достаточен для протекания нескольких процессов, каждый из которых приводит к ослаблению наблюдаемых спектральных ха­рактеристик флуоресценции. К таким процессам относятся столкновения с тушителями, вращательная и поступательная диффузия, образование комп­лексов с растворителями или с растворенными веществами и переориента­ция окружения молекулы в возбужденном состоянии с измененным дипольным моментом. Эти динамические процессы могут влиять на анизотропию флуоресценции, квантовые выходы, времена жизни и спектры испускания. В результате спектральные характеристики флуорофоров могут дать большую информацию о динамических процессах, протекающих за время испускания флуоресценции.

Из большого числа молекул биологических веществ многие являются природными, или естественными, флуорофорами. Мы кратко суммируем ин­формацию о широко известных флуорофорах, что дает основу для последую­щих глав. Такое конспективное изложение не является исчерпывающим.

БЕЛКИ Триптафан - наиболее интенсивно флуоресцирующая аминокисло­та в белках. Около 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено триптофановыми остатками. 'Этот природный флуорофор крайне чувствителен к полярности окружающей среды. Спектральные сдвиги часто являются след­ствием нескольких явлений, среди которых можно выделить связывание лигандов, ассоциацию белок - белок и денатурацию. Кроме того, максиму­мы испускания белков отражают среднюю доступность их триптофановых остатков в водной фазе. Белки поглощают свет вблизи 280 нм, а максимумы спектров флуоресценции лежат в области 320 —350 нм. Времена затухания флуоресценции триптофановых остатков лежат в диапазоне 1-6 нс.

Тирозин интенсивно флуоресцирует в растворе, однако в белках его флу­оресценция значительно слабее. Денатурация белков обычно усиливает ис­пускание тирозина. Как и для фенола, рК_а тирозина очень сильно уменьшает­ся при возбуждении, и может происходить ионизация в возбужденном состоя­нии.

нуклеиновые кислоты Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты обычно не флуоресцируют. Тем не менее существуют некоторые исключения. tRNA^Phe из дрожжей содержит интенсивно флуоресцирующее основание, известное как Y-основание, которое имеет максимум испускания вблизи 470 нм, а вре­мя жизни ~6 нc.

Кофакторы NADH флуоресцирует сильно, и максимумы его поглощения и испускания находятся при 340 и 450 нм соответственно. NAD⁺ не флуорес­цирует. Время затухания флуоресценции NADH в водном буфере составля­ет примерно 0,4 нс. Флуоресцирующей группой является восстановленное никотинамидное кольцо, причем его флуоресценция частично потушена за счет столкновений с остатком аденина. При связывании NADH с белками квантовый выход его флуоресценции увеличивается обычно в четыре раза. Такое увеличение выхода обычно интерпретируют как следствие связывания NADH в вытянутой конформации, что подтверждается изучением дифракции рентгеновских лучей на гидрогеназах.

РИБОФЛАВИН И FAD. Рибофлавин, FMN (флавинмононуклеотид) и FAD (флавинадениндинуклеотид) поглотают свет в видимой области (-450 нм) и испускают в области 515 нм. Типичные времена жизни для FMN и FAD сос­тавляют 4,7 и 2,3 нс соответственно. Как и для NADH, флуоресценция флавина динамически тушится аденином. Далее, FAD также образует комплек-сымссоциаты, в которых флуоресценция флавнна потушена аденином (ста­тическое тушение). Флагопротеины в основном не флуоресцируют, однако опять же существуют исключения.

1.6.2. Искусственные фпуорофоры

Часто естественные флуоресцентные свойства макромолекул не позволя­ют получить из эксперимента желаемую информацию. Так, например, флуо­ресценция белка и даже поляризация этой флуоресценции не отражают явле­ние, которое хотят охарактеризовать количественно, В таком случае выби­рают флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемой системе, но имеют лучшие спектральные свойства,

ИЗОЦИАНАТЫ И ИЗОТИОЦИАНАТЫ ФЛУОРЕСЦЕИНА И РОДАМИНА. Эти краси­тели широко используют в качестве меток для белков. Меченные флуоресцеином иммуноглобулины - коммерческие реактивы; их часто используют в флуоресцентной микроскопии. Именно эти вещества выбирают из-за вы­соких квантовых выходов и устойчивости к фото обесцвечиванию. Кроме того, благодаря большим длинам волн поглощения и испускания (рис. 1,9) сведена к минимуму проблема фоновой флуоресценции биологических об­разцов и можно избежать применения кварцевой оптики. Изоцианатная или изотиоцианатная группы находятся либо в мета-, либо в параположении по отношению к карбокси-группе (см. рис, l.l). Коммерческие меченые реа­генты представляют собой смесь изомеров. Эти красители реагируют в первую очередь с лизиновым или цистеиновым участком белков. Времена затухания флуоресценции красителей около 4 нс, а их спектры испускания мало чувствительны к полярности растворителя. Эти красители очень под­ходят для количественного определения степени ассоциации небольших ме­ченых молекул с белками на основании изменения поляризации флуоресценции.

ДАНСИЛХЛОРИД. Дансилхлорид (DNS-C1) широко используют в качестве метки для белков (рис. 1.10), особенно в тех случаях, когда проводят изме­рения поляризации. Это вещество давно известно [ 8] и имеет удобное вре-ся жизни флуоресценции (~ 10 нс). На спектр испускания дансильной груп­пы сильно влияет полярность растворителя.

РИС. 1.9. Спектры возбуждения и испускания бычьего γ-глобулина. меченного зотиоцианатом флуоресцеина (по данным [ 7]).

РИС. 1.10. Часто используемые искусственные флуорофоры.

Гидрофобные мембранные зонды. Липиды обычно не флуоресциру­ют. Мембраны часто метят такими зондами, как перилен, 9-винилантраЦен и 1,6-дифенилгексатриен (DРН) (рис. 1.10). Эти зонды нерастворимы в во­де и встраиваются в гидрофобные участки мембран. Незамещенные много­ядерные ароматические углеводороды и DPH малочувствительны к поляр­ности растворителя. Их используют в первую очередь для оценки внутрен­ней вязкости двойных слоев по измерениям поляризации их флуоресценции (разд. 5.7.1). Путем целенаправленного изменения химического строения зонды могут быть локализованы на избранных участках мембраны. Одним из таких примеров является триметиламмониевая соль DPH (ТМA-DPH). Полагают, что заряженный атом азота приводит к локализации ТМА-DPH в области липидно-водной границы мембран [ 14].

Другие зонды, как, например PATMAN (рис. 1.11), очень чувствитель­ны к фазовому состоянию липидных бислоев [ 9]. При температуре перес­тройки мембран спектр испускания PАTМAN сжигается на 40 нм в длинноволновую область: от 425 до 465 нм. По-видимому, этот зонд реагирует на релаксацию мембраны вокруг диполи возбужденного состояния флуорофора (разд. 8.6). Были предложены и другие зонды. Чувствительность к потенциалу мембраны может быть связана с изменением ориентации зонда или его локальной концентрации в мембране [10], а также с влиянием электри­ческого поля т электронное распределение в зонде [ 11]. И наконец, можно выделить зонды, которые подвергаются реакциям в возбужденном состоянии. В возбужденном состоянии зонд Р₂ -С₃, может образовывать внутримоле­кулярный эксимер, и доля образовавшихся эксимеров определяет вязкость в их ближайшем окружении.

Нуклеиновые кислоты. При введении этиленового мостика флуорес­ценция АТР и его производных становится более интенсивной [ 12]. Такие производные ε-АТР (рис. 1.11) чувствительны к вязкости растворителя, имеют высокую предельную поляризацию флуоресценции, и времена затухания их флуоресценции близки к 23 нс. Нуклеотидные аналоги активны во многих реакциях, катализируемых ферментами. Кроме того, были синтези­рованы такие аналоги нуклеотидов с вытянутой конформацией, как лин-бен-зо-АМР, Эти аналоги флуоресцируют [ 13] и сохраняют способность к обра­зованию водородных связей не модифицированных нуклеотидов.