Қазақстан республикасының білім және ғылым министірлігі
жүктеу/скачать 3.94 Mb.
|
Выводы: 1). В ходе выполненной работы выявлен вирус высокопатогенного гриппа птиц типа А методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. 2). Дифференцирован (идентифицирован) субтип Н5 высокопатогенного вируса гриппа птиц типа А.
1. Lvov D.K. // Sov. Med. Rev. E. Virol. Rev. 1987. стр.15-37. 2. «ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ГРИППА ПТИЦ» статья Кологоров А.И., Караваева Т.Б. 3. Львов Д.К., Ямникова С.С., Забережный А.Д. и др. // Вопр. вирусол. 2005. №4. С.4-11. 4. Capua I., Marangon S. (2000). The avian influenza epidemic in Italy, 1999-2000: a review. Avian Pathol. 29(4): 289-294 5. Т.В. Гребенникова, Д.Е. Киреев, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер «Разработка средств молекулярной диагностики гриппа А» НПО НАРВАК. 6. Хлыстунов А.Г. Правила отбора патматериала для исследования на грипп птиц / А.Г. Хлыстунов, А.В. Шматова. – Красноярск, 2006. – С. 1-2. 7. Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование 1.3 Эпидемиология, Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. Методические указания МУ 1.3 1794-03 8. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей «Инструкция по применению тест-системы ГРИПП-ЭФА для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции» Санитарный кодекс наземных животных (МЭБ), ГЛАВА 2.1.14. «ВЫСОКОПАТОГЕННЫЙ ГРИПП ПТИЦ». 9. Guo Y, Wang M, Kawaoka Y, Gorman O, Ito T, Saito T, Webster RG. Characterization of a new avian-like influenza A virus from horses in China. Virology. 1992 May;188(1):245-55.) 10. Swayne DE, Perdue ML, Garcia M, Rivera-Cruz E, Brugh M. Pathogenicity and diagnosis of H5N2 Mexican avian influenza viruses in chickens. Avian Dis. 1997 Apr-Jun;41(2):335-46.). УДК 61.056.829 ВЫЯВЛЕНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ BRCA1 У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ МЕТОДОМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ А.П. Кравченко, студентка 4 курса ЕНУ им. Л.Н Гумилева, г.Астана Научный руководитель: к. м. н А. Р. Акильжанова
В мире интенсивно изучается спектр мутаций в генах BRCA-семейства, который сильно разнится между отдельными популяциями. Знание спектров мутаций, характерных для страны или региона, позволяет с помощью ДНК-диагностики выявлять группы риска развития заболевания [4]. В России сведения о мутациях BRCA-генов сравнительно скудны, однако немногочисленные публикации позволяют рассматривать мутацию в гене BRCA1 5382insC как преобладающую в Российской популяции [1,2]. В Казахстане ДНК-диагностика находится на стадии развития и совершенствования. В данной работе описываются методы ДНК-диагностики и результаты поиска мутаций в гене BRCA1 у женщин Казахстана больных раком молочной железы. Целью работы является освоение методики выявления мутаций в гене BRCA 1 у больных раком молочной железы методом секвенирования для дальнейшего внедрения современных методов комплексной оценки генетических факторов в клиническую практику Казахстана. Научная новизна и практическая ценность. В настоящее время в Казахстане не проводится диагностика предрасположенности к раку молочной железы. Практическая ценность работы заключается в необходимости выявления предрасположенности к раку молочной железы, как и других заболеваний, на ранней стадии развития, а обнаружение взаимосвязи между риском рака груди и генами BRCA1 и BRCA2 приведет к новым методам снижения риска, выявления и лечения рака груди у таких больных. Материалы исследования: Исследования по выявлению мутаций в гене BRCA1 методом секвенирования были проведены на 10 образцах ДНК женщин с раком молочной железы, выделенных из лейкоцитов крови и 5 образцах ДНК здоровых людей для контрольной группы, выделенных из букальных клеток. Кровь и букальные клетки были получены у пациентов Онкологического Центра г.Астаны с их информированного согласия. Методы исследования:
Результаты и обсуждение: Изображение геля показывает высокую концентрацию ДНК в 10 исследуемых пробах крови (Рис.1). Это говорит о том, что выделение ДНК из крови было проведено методически правильно, и образцы готовы для постановки ПЦР. Электрофоретический анализ ДНК на 10 проб крови. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Рисунок 1 Концентрацию 5 образцов ДНК из букальных клеток для контрольной группы измеряли с помощью прибора Nano Drop1000 (рис.2), так как концентрация ДНК, выделенной из букальных клеток, низкая и с помощью электрофоретического анализа наличие или отсутствие ДНК в супернатанте зафиксировать трудно.
В данном исследовании изучали 2 и 20 экзоны гена BRCA1, так как в данных генах часто встречаются мутации «founder mutation», во втором экзоне 185delAG мутация, в двадцатом экзоне 5382insC. Электрофоретический анализ на наличие ампликонов в 10 образцах ДНК 20 экзона гена BRCA1 после ПЦР (1,5 % агарозный гель, напряжение 120 V,время 25 мин) М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 К+ К- 
Рисунок 3 М – маркер молекулярного веса от 2000 до 100 п.н К+ положительный контроль К- отрицательный контроль После очистки сиквенс-ПЦР-продуктов расшифровку нуклеотидной последовательности интересующих нас экзонов исследуемого гена проводили в секвенаторе 3730xI DNA Analyzer, на котором заранее задается программа секвенирования. Время секвенирования 40 минут, после чего данные анализируются с помощью пакета программ Seq Analysis 5.3.1 Applied Biosystems. Обнаруженные мутации во 2 и 20 экзонах BRCA1 исследуемой и контрольной группах.
Номенклатура мутаций согласно обозначению в GenBank референсной последовательности гена BRCA1, номер U14680(BRCA1). В результате наших исследований мы обнаружили 9 гомозиготных полиморфизмов ДНК, все они представлены заменой оснований (95g>T, 5397a>G, 170t>K и т.д), функциональные исследования данных полиморфизмов не проводились и в базе данных Breast Cancer Information Core (BIC) не значимы. Идентификация мутаций важна не столько для заболевших раком пробандов, сколько для их родственников, у которых еще не возникли или не диагностированы опухоли. Внимательное отношение к состоянию молочной железы у родственниц пробандов с мутациями позволяет намного раньше выявить и удалить опухоль, что нередко спасает им жизнь [6]. Выводы
Список литературы: 1. Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Логинова А.Н., Хомич Е.В., Будилов А.В., Сергеев А.С., Захарьев В.М., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и яичников// Доклады Академии наук. - 2002. - Т. 383. N 12. - С.706-709 2. Online Mendelian Inheritance in Man. 113705*. Breast Cancer, Type 1; BRCA1 3. Bell G.I., Karam J.H., Rutter W.J. Polymorphic DNA region adjacent to the 5' end of the human insulin gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1981. - V.78. - P.5759-5763. 4. Gayther S.A., Harrington P., Russell P., Kharkevich G., Garkavtseva R.F., Ponder B.A. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia // Am. J. Hum. Genet. - 1997. - V. 60. N 5. - P.1239-1242. 5. Piccart M.J., Awada A., Hamilton A. Integration of new therapies into management of metastatic breast cancer// ASCO 1999 Educational book.Atlanta.1999.P.526539. 6. Reddy V.B., Thimmappaya B., Dhar R., Subramanian K.N., Zain B.S., Pan J., Ghosh P.K., Celma M.L., Weissman S.M. The genome of simian virus 40. (1978) Science, 200(4341), 494-502.
Научный руководитель: к.м.н., с.н.с. ННЛБКП НЦБ РК Кожамкулов У.А. Стремительный рост числа больных туберкулезом в последние десятилетия XX века и первые годы XXI во всем мире стимулировал научно-исследовательские работы по изучению генетических структур возбудителя и полному определению нуклеотидной последовательности его генома. Заболеваемость в Республике Казахстан в 2008г. составляла 125,5 на 100 тысяч населения (в 2007г. - 126,4; 2006г. - 132,1; 2005г. - 147,3), а смертность в 2008г. составляла 17,2 на 100 тысяч населения (2007г. – 18,1; 2006г. – 20,4; 2005г. - 20,8). В 2006 году в Республике Казахстан было выявлено около 20000 новых заболеваний туберкулезом, 3000 человек погибло от данного заболевания. Целью данной работы являлось генотипирование мультирезистентных штаммов M.tuberculosis на основе MIRU-VNTR анализа. Материалы и методы: в работе было использовано 40 клинических штаммов M.tuberculosis от больных с областей Республики Казахстан, а именно СКО (721, 649, 652, 655, 736, 696, 641), ЗКО(2326, 2382, 1193, 232, 1668, 158, 2420, 5150), ЮКО (2814, 1917) и ВКО (745, 698, 767, 762, 760, 754, 673, 755, 765, 741, 718, 704, 768, 675, 742, 680, 757, 672, 693, 763, 749, 751, 689). Выделение ДНК. Выделение ДНК M.tuberculosis осуществлялось следующим образом: ресуспендировали колонии микобактерий, выращенных на твердых носителях (например, Левенштейна-Йенсена) или гранулы микобактерий, полученных из жидких культур в 200мкл ТЕ-буфера (Трис-HCl и 1mM EDTA). Затем центрифугировали гранулы, полученные из жидких культур 5 мин при 15000об/мин, после удалили супернатант и снова добавили 200мкл ТЕ-буфера (Трис-HCl и 1mM EDTA). Инкубировали в течение 15 мин при 950С, затем центрифугировали при 15000об/мин в течение 1 мин. Разбавили полученный продукт в концентрации 1:50 в дистиллированной воде. Полученный ДНК хранили в холодильнике при -200С и использовали по мере необходимости. Амплификацию фрагментов генома штаммов Mycobacterium tuberculosis проводили в реакционной смеси, содержащей dH2O, dNTP (дезоксинуклеотид трифосфат), буфер (Литех), primer R(праймер обратный),primer F (праймер прямой), DMSO 5% (диметилсульфоксид), Taq- полимераза мутированная, ДНК. Смесь dNTP представляет собой водный раствор смешанных солей dATP, dCTP, dGTP каждый в концентрации 1.5 mM и dUTP в концентрации 4.5 mM. Диметилсульфоксид используется в ПЦР для ингибирования спаривания исходных молекул ДНК. Он добавляется к ПЦР смеси перед началом реакции, где он взаимодействует с комплементарными участками ДНК, препятствуя их спариванию и уменьшая количество побочных процессов. Молекулярная формула - C2H6OS. Термостабильный фермент Taq-полимеразу получают из грамотрицательной палочковидной экстремально термофильной бактерии рода Thermus – Thermus aquuaticus. Буфер для проведения ПЦР амплификации состоит из: NaCl 500mM, TrisCl (pH7.9) 100mM, MgCl2 100mM, DTT 10mM Реакцию проводили в амплификаторе Tetrad 2 Biorad. Был использован универсальный профиль амплификации, адаптированный для максимального выхода ПЦР-продукта всех исследуемых локусов генома: 950С – 5 мин, 950С – 30c, 950С - 660С – 10c, 720С – 1мин- 30 циклов, 720С – 7мин. Визуализацию продуктов амплификации осуществляли путем электрофореза в 1,5% агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием. 
Рис.1. Визуализация продукта ПЦР-амплификации локуса MIRU 26. На рисунке 1 изображен результат электрофореза продуктов ПЦР-амплификации в 1,5%-ном агарозном геле. М- это маркер, DNA ladder. А1-D12 – это изоляты. Два ярких сигнала на маркере – соответственно 500 и 1000 пар нуклеотидов. Существует специальная программа Quantity One для анализирования полученных электрофорезных рисунков. В данной работе мы использовали два способа анализа: на программе Quantity One на компьютере, и, проверяли визуальным подсчетом. 
Рисунок 2. Анализирование электрофорезных рисунков на программе Quantity One. В ходе выполнения работ по этапу, был проведен VNTR-MIRU анализ числа тандемных повторов в 12 локусах для 40 штаммов M. Tuberculosis. Для каждого штамма получен аллельный профиль, представленный набором аллельных вариантов по 12 MIRU локусам, где номер аллельного варианта соответствовал числу тандемных повторов в данном локусе. После подсчета числа повторов в каждом локусе, по данным анализа построено филогенетическое древо при помощи web-ресурса MIRU-VNTR-plus (http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/). Необходимо отметить, что получение цифрового профиля имеет огромное значение, так как позволяет судить о схожести штаммов Mycobacterium tuberculosis, или же об абсолютной уникальности штаммов, циркулирующих на территории Казахстана. Схожесть профиля говорит об одном источнике заражения. Более того, цифровой профиль дает возможность определять штаммы по семействам. Для определения количества тандемных повторов мы сравнивали полученный ПЦР-продукт изолята с ожидаемым выходом длины ПЦР-продукта для референсного штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Длину ПЦР-продукта мы получали после проведения гель-электрофореза на компьютере с помощью программы Quantity One. В таблицах 1 и 2 по горизонтали расположены локусы MIRU, по вертикали – количество тандемных повторов. В ячейках – размер продукта, в нуклеотидах. Таблица 1. Определение количества тандемных повторов по длине ПЦР-продукта для локусов MIRU2, MIRU4, MIRU10, MIRU16, MIRU20 и MIRU23.
Таблица 2. Определение количества тандемных повторов по длине ПЦР-продукта для локусов MIRU24, MIRU26, MIRU27, MIRU31, MIRU39 и MIRU40.
Таблица 3. Цифровой профиль по изученным 8 изолятам из ЗКО.
Таблица 4. Цифровой профиль по изученным 2 изолятам из ЮКО.
Таблица 5. Цифровой профиль по изученным 7 изолятам из СКО.
Таблица 6. Цифровой профиль по изученным 23 изолятам из ВКО.
Рис.3. Дендрограмма, иллюстрирующая степень сродства 40 исследованных штаммов M.tuberculosis. Результаты: из 40 выявленных MIRU-профилей 8 оказались уникальными, а остальные 32 образовали 3 кластера, включающие от 2 до 23 изолятов. Первый кластер состоит из 7 изолятов: 1193, 232, 652, 721, 741, 742, 754 и имеет следующий цифровой профиль: 2 2 3 3 3 1 13 1 5 3 4 3. Второй кластер значительно больше и включает 23 изолята, а именно: 158, 1668, 1917, 2326, 2420, 5150, 641, 673, 675, 680, 689, 693, 696, 698, 704, 718, 736, 745, 757, 762, 763, 765 и 767, которые имеют цифровой профиль 2 2 3 3 3 2 13 1 5 3 4 3. Третий же кластер состоит всего из двух изолятов: 2814 и 749 с цифровым профилем: 2 2 3 3 3 2 13 1 7 3 4 3. Уникальными оказались следующие: 2382, 655, 672, 768, 751, 760, 649 и 755. ВЫВОД: Проведен анализ числа тандемных повторов в 12-ти локусах генома клинических изолятов по методике, признанной стандартом молекулярно-генетического типирования M.tuberculosis, предложенной P.Supply и коллегами. Все полученные результаты анализировались и сравнивались с базой данных www.miru-vntrplus.org. Наиболее полиморфными для данной выборки оказался локус MIRU 20, индекс его полиморфизма равняется 0,3. По результатам сполиготипирования 85% штаммов, циркулирующих на территории Республики Казахстан принадлежат семейству Beijing, который демонстрирует повышенную лекарственную устойчивость. На основании полученных MIRU профилей определены 3 генотипа, 8 штаммов имеют уникальный профиль, остальные объединены в 3 кластера, включающие от 2 до 23 изолятов. С помощью метода MIRU-VNTR-анализа впервые получена информация о молекулярно-генетическом разнообразии клиничеких штаммов M.tuberculosis, что дало возможность определить клинико-эпидемиологическое значение тех или иных штаммов, циркулирующих на территории Республики Казахстан. Список литературы: 1. Медицинская микробиология / Гл.ред. В.И.Покровский, О.К.Поздеев - М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 1200с. 2. Murray J. F. A Century of Tuberculosis// Am.J.Respir.Crit.Care Med. - 2004. - Vol.169. - P. 1181-1186 3. Определитель бактерий Берджи/Гл.ред.Дж.Хоулт, Н.Криг,П.Снит. - М: Мир, 1997.-317с. 4. Tortoli E. The new mycobacteria: an update // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2006. - Vol.48. - P. 159-178 5. Туберкулез. Руководство для врачей/Ред. А.Г.Хоменко. М: Медицина, 1996. - 496с. УДК: 576.3.312:14 РНҚ ИНТЕРФЕРЕНЦИЯСЫНЫҢ ӨСІМДІКТЕРДЕГІ ВИРУСТАРМЕН СУПРЕССИЯЛАНУЫНЫҢ БИОХИМИЯЛЫҚ МЕХАНИЗМДЕРІ. Омаров Р.Т, Мырзабаева М.Т, Абдираимова А.Ж, Молдакимова Н.Ж Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университеті Қазақстан Республикасы, Астана қаласы Эукариоттарда ген экспрессиясының регуляциясында маңызды биологиялық рөлді РНК интерференция молекулалық үрдісі атқарады (RNA interference (RNAi)). RNAi бұрыннан өсімдіктерде геннің пост транскрипциондық тыныштығы (post-transcriptional gene silencing(PTGS)) деген атпен белгілі және ол тірі ағзалардағы ген экспрессиясының реттелуінде негізгі рөлді ойнайтын молекулалық механизм болып табылады. RNAi жоғары өсімдіктерде табиғи молекулалық тұрақтылық негізі. Сонымен қатар ол вирусты таңдаулы түрде анықтап, оның кезекті деградацияға ұшырауын қамтамасыз етеді. RNAi-дың бастапқы механизмі, ұзын қос тізбекті РНК молекуласының (dsRNA) синтезі болып табылады (1). Келесі RNAi-дың функционалды қадамы Dicer (Dicer-like DCL) -(РНКаза III тобының мүшелері) ферментінің әсері. Ол өз кезегінде өзіне қысқа РНК молекуласын интерференциялайтын (short interfering RNAs(siRNAs)) және микро РНҚ-ның (microRNAs) 3' жабысқақ ұшы 20-30 нуклеотидтің) әрекетін катализдейді (2). Бұл шағын РНК молекулалары вирустық РНК-ның ұзын репликативті формаларының, және де трансген мен транспозондардың, энзиматикалық гидролиз нәтижесінде түзілуі мүмкін (3). Өсімдіктің вирусы жағдайында, siRNAs тікелей вирустық геномнан түзілуі мүмкін, бірақ соңғы дәлелдеулер, сонымен қатар, РНК тәуелді РНК полимеразаның (RNA dependent RNA polymerases) қатыматынын анықтады. Өсімдіктерде жүргізілген соңғы зерттеулерде көрсетілгендей, siRNAs-ның ферменттік метилденуі бұл молекулалық олигоурдилация үрдісінен оның келесі деградациялануына дейінгі оның тұрақтылығын сақтауда негізгі рөль атқарады (4). siRNAs-тың метилденуі 3' ұшында болады және бұл ферментативтік модификация метил трансферазамен HUA ENHANCER1 (HEN1) катализденеді (5,6). Келесі кезекте RNAi, қос тізбекті siRNAs молекулалары ажырайды және тізбектің біреуі көп компонентті эффекторлы комплекске орналасады (RNA-induced silencing complex (RISC)). Ерекше транскриптің оның кезекті ферментативті гидролизі немесе трансляциондық репрессияның комплементарлы нуклеотидтер тізбегін табу үшін siRNA RISC –ке қосылып «іздеуші матрица» қызметін атқарады (3). siRNA нуклеотиді мен берілген РНК арасындағы комплементарлы қосылу қажетті мақсатты табуда тиімділікпен қамтамасыз етеді. Тәжірибелік мәліметтер, siRNAs және Argonaute(AGO) туқымдасының ақуыздары RISC–ң универсальді компоненттері болып табылатынын айтуға болатынын көрсетіп отыр (7). AGO ақуыздары ерекше консерванты PAZ және PIWI деп аталатын доменнің болуымен сипатталады (8). Құрылымдық зерттеулер, домен PAZ AGO –да тікелей siRNA –мен өзара әрекеттесетінін дәлелдеді (9). Бұған қоса PAZ домен siRNAs – тің 3' ұшымен өзара әрекеттесетіні де белгілі болды. Домен PIWI AGO ақуызында негізгі каталитикалық орталық болып табылады, өйткені ол эндонуклеаздық белсенділікке ие (7). RNAi әрекетіне қарсы жауап ретінде вирустар өсімдіктердің иммундық тұрақтылығының молекулалық механизміне қарсы ерекше стратегия тапты. RNAi-ға қарсы ең тиімді және қолданбалы контрмера болып молекулалық –иммундық механизмінің вирустық супрессиясы болып табылады. Мысалы, көптеген вирустар RNAi-ды тиімді тоқтатып қоя алатын ерекше ақуыз супрессорларды кодтайды (viral supressors of RNAi(VSR)). Өсімдіктердің қорғаныс жүйесіне қарсы тұру үшін вирустық VSR экспрессиясы себепті болжамдар қозғауда. Ол болжамдар RNAi-дың бастапқы қызметі өсімдіктердегі патогенге қарсы тұру болып табылады (10). Қазіргі көптеген вирустық ақуыздар VSR деген атпен белгілі, себебі олар бастапқыдан патогендік немесе вируленттіктің факторы ретінде белгілі болды, өйткені олардың экспрессиясы вирустық аурудың түзілуімен белгілер амплитудасын анықтайды (11). Көбіне бұл ақуыздардың экспрессиясы вирустық репликациялардың негіздеуші факторы емес. Бірақ вирустық супрессорлар тиімді аккумуляция және инфекция барысында вирустардың таралуы үшін қажет (12). Қазіргі кезде супрессорлық белсенділікке ие көптеген вирустық ақуыздар табылды. Бірақ олардың жұмысының биохимиялық механизмі әдебиеттерде жақын арада пайда болды. Соңғы молекулалық, биохимиялық және құрылымдық әр түрлі VSR зерттеулер RNAi супрессиясының механизмін толық қарауға мүмкіндік берді. Барлық вирустық супрессорлардың ортақ қасиеті болып RNAi-дың әр түрлі кезеңінде оның қорғаныштық жүйесіне қарсы әсер ету болып табылады. Бұл қарсылық әрекеті вирус пен өсімдік арасында күрделі және қиын «эволюциялық күрестің» интенсивті мысалы бола алады (13). Вирустық супрессор мен өсімдіктердің RNAi механизмі арасындағы коэволюция, сонымен қатар, өсімдіктің қорғаныс жүйесіне вирустың бейімделуінің қиныдылығын дәлелдеп отыр. Қазіргі шолудың мақсаты молекулалық және биохимиялық RNAi супрессиясының өсімдік вирустарымен байланысын жаңа ғылыми мәліметтерді негізге ала отырып, жалпылау болып табылады.
HC-Pro биохимиялық зерттеулері, оның димерлер мен мультимерлерді қалыптастыру қабілеті RNAi супрессор ретінде функциясына критикалық екендігін көрсетті (15). Сонымен қатар, HC-Pro супрессордың функциясы siRNA тұрақтылығының төмендеуімен байланысты болуы мүмкін, себебі ақуыздың трансгендік экспресссиясы 5' –ұшының siRNAs 21 нт вирустың модификациясының төмендеуіне әкеледі (17). Және де HC-Pro mi/siRNA функционалды метилденуі (17) мен ds siRNA байланысуына кедергі жасайды (33). Жақындағы зерттеулер, FRNK аймағының қызметтік рөлін тапты, яғни HC-Pro құрылымында ақуызбен siRNA байланысуы. Және де бұл қызмет miRNAs селективті байланысуы мен вирустық аурудың белгілерінің амплитуда деңгейімен байланысы белгілі болды (16). Cucumovirus 2b HC-Pro секілді, Cucumovirus тұқымдасымен кодталатын ақуыз 2b RNAi супрессорның алғашқы табылғандардың бірі. GFP трансгенімен тәжірибелерде 2b экспрессиясы RNAi қарсы әсер ететіні көрсетілді (17). Кейінгі, темекінің суспензиялық жасушамен және бүтін өсімдіктермен жүргізілген зерттеулер 2b құрылымында ядро жасушасында ақуыздың орналасуына жауапты ядролық сигнал локализациясына(nuclear localization signal (NLS) бай аргининді тапты. NLS мутация ақуыздың супрессорлық белсенділігін төмендетіп,супрессор функциясын іске асыру үшін 2b ядролық локализациясының қажеттілігін көрсетеді (18). Кейінгі зерттеулер, 2b RNAi жасушаның сигналының жасушааралық таралуын ұстайтын s және ядрода ДНК метильдену үрдісін ингибирлейтінін дәлелдеді (18). Қызықтысы, 2b салицил қышқылының көмегімен өсімдіктердің вирусқа төзу механизмін тоқтатуға болатыны анықталды. Бірақ, бұл жағдайдың ақуыздың супрессорлық функциясына қандай қатысы бар екені әзір белгісіз (19). Соңғы зерттеулер siRNAs типінің 2b экспрессия генерациясы DCL4, DCL2, DCL3 ферментерімен катализденетін 21, 22 және 24 нт жиналуын төмендетеді (ә3). Соңғы зерттеулер, басқа көптеген белгілі вирустардың супрессорларға қарағанда, 2b тікелей AGO1 in vitro және in vivo жағдайында RISC комплексінің каталитикалық орталығы болып табылатын өзара әсерлесетінін дәлелдеді (20). Сонымен қатар, 2b мен AGO1 арасында өзара әсерлесу РНК-ның нуклеаздық комплекстің ферментативті гидролизінің ерекше ингибирленуіне алып келеді. Вирустық супрессорларға қатысты соңғы жаңа молекулалық және биохимиялық зерттеулер RNAi супрессиясының вирустық стратегиясы туралы біздің білімімізді кеңейтуге септігін тигізді. Вирустық супрессорлар RNAi –мен әр түрлі кезеңінде бұл қорғаныс жүйесімен күресуге қажет кең спектрлі биохимиялық қасиеттерге ие. Вирустық супрессорлардың келесі толық молекулалық, биохимиялық және құрылымдық зерттеулер ағзаның қорғаныш жүйесі мен вирус арасында молекулалық қарым –қатынас механизмін толық зерттеу үшін қажет. Уақыт өткен сайын вирустық патогенге төзімді өсімдіктерді шығарудың тиімді жолын табу үшін бұл саладағы зерттеулердің маңызы өте зор. Қолданылған әдебиеттер: 1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811. 2. Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K. D., Carrington, J. C., and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313, 68-71. 3. Ding, S. W., and Voinnet, O. (2007) Antiviral immunity directed by small RNAs. Cell 130, 413-426. 4. Diaz-Pendon, J. A., and Ding, S. W. (2008) Direct and indirect roles of viral suppressors of RNA silencing in pa thogenesis. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 303-326. 5. Moissiard, G., Parizotto, E. A., Himber, C., and Voinnet, O. (2007) Transitivity in Arabidopsis can be primed, requires the redundant action of the antiviral Dicer-like 4 and Dicer-like 2, and is compromised by viral-encoded suppressor proteins. RNA 13, 1268-1278. 6. Vaistij, F. E., and Jones, L. (2009) Compromised virus-induced gene silencing in RDR6-deficient plants. Plant Physiol. 149, 1399-1407. 7. Li, J., Yang, Z., Yu, B., Liu, J., and Chen, X. (2005) Methylation protects miRNAs and siRNAs from a 3'-end uridylation activity in Arabidopsis. Curr. Biol. 15, 1501-1507. 8. Park, W., Li, J., Song, R., Messing, J., and Chen, X. (2002) CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol. 12, 1484-1495. 9. Yang, Z., Vilkaitis, G., Yu, B., Klimasauskas, S., and Chen, X. (2007) Approaches for studying microRNA and small interfering RNA methylation in vitro and in vivo. Methods Enzymol. 427, 139-154. 10. Rand, T. A., Ginalski, K., Grishin, N. V., and Wang, X. (2004) Biochemical identification of Argonaute 2 as the sole protein required for RNA-induced silencing complex activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 14385-14389. 11. Cerutti, L., Mian, N., and Bateman, A. (2000) Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the Piwi domain. Trends Biochem. Sci. 25, 481-482. 12. Song, J. J., Liu, J., Tolia, N. H., Schneiderman, J., Smith, S. K., Martienssen, R. A., et al. (2003) The crystal structure of the Argonaute2 PAZ domain reveals an RNA binding motif in RNAi effector complexes. Nat. Struct. Biol. 10, 1026-1032. 13. Song, J. J., Smith, S. K., Hannon, G. J., and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305, 1434-1437. 14. Li, F., and Ding, S. W. (2006) Virus counterdefense: diverse strategies for evading the RNA-silencing immunity. Annu. Rev. Microbiol. 60, 503-531. 15. Brigneti, G., Voinnet, O., Li, W. X., Ji, L. H., Ding, S. W., and Baulcombe, D. C. (1998) Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J. 17, 6739-6746. 16. Scholthof, H. B. (2005) Plant virus transport: motions of functional equivalence. Trends Plant Sci. 10, 376-382. 17. Scholthof, H. B. (2007) Heterologous expression of viral RNA interference suppressors: RISC management. Plant Physiol. 145, 1110-1117. 18. Cronin, S., Verchot, J., Haldeman-Cahill, R., Schaad, M. C., and Carrington, J. C. (1995) Long-distance movement factor: a transport function of the potyvirus helper component proteinase. Plant Cell 7, 549-559. жүктеу/скачать 3.94 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
