Биология пособие для поступающих в вузы под редакцией М. В. Гусева и Л. А. Каменского Издательство Московского университета 2002 Москва мир 2002

Пути повышения продуктивности сельскохозяйственных растений. В результате фотосинтеза на Земле ежегодно образуется более 250 млрд т органического вещества (в сухом весе), энергетический потенциал которого более чем в 20 раз превышает используемую энергию полезных ископаемых. В атмосферу при этом выделяется около 200 млрд т свободного кислорода. Несмотря на высокую эффективность фотосинтеза, в виде органических соединений запасается только около 1% энергии падающего на Землю солнечного света. Потери связаны в первую очередь с неполным поглощением света, ограничениями на биохимическом и физиологическом уровнях, а также с энергозатратами на обеспечение жизнедеятельности растений. Поэтому для повышения продуктивности фотосинтеза используют целый ряд агротехнических мероприятий. Растениям обеспечивают оптимальный световой режим за счет определенной густоты посевов, правильных сроков посадки, искусственного освещения в теплицах и т.д., а также оптимальный температурный режим. Важную роль играет содержание влаги в почве, которое можно регулировать с помощью искусственного полива или, наоборот, осушения. Для получения высоких урожаев необходимо вносить в почву достаточное количество органических и минеральных удобрений, а в теплицах следить за содержанием углекислого газа в воздухе.

Огромное значение в повышении продуктивности сельскохозяйственных растений играет создание новых сортов с повышенной эффективностью фотосинтеза, устойчивых к болезням и вредителям, засухе и морозам, способных расти на засоленных и бедных почвах и т.д. В последние годы для этих целей все более широко используют методы генетической и клеточной инженерии. Уже созданы устойчивые к заболеваниям сорта картофеля, декоративных и ягодных культур, древесные породы и культурные растения, не чувствительные к гербицидам ╫ веществам, используемым для борьбы с сорняками. Предпринимаются попытки создать новые растения, например злаки, способные фиксировать атмосферный азот. В конце XX в. в США, Китае и ряде других стран новые сорта растений, созданные генноинженерным путем, занимали миллионы гектаров сельскохозяйственных угодий.

487
БИОСИНТЕЗ БЕЛКА

Ген и его роль в биосинтезе белка. Код ДНК. Белки являются важнейшими компонентами живого, так как они составляют самую большую по массе часть органических веществ клетки и обеспечивают уникальность ее химического состава, структурной организации и функциональной активности. Практически все химические процессы в клетке осуществляются белками-ферментами, белки входят в состав плазматической мембраны и мембран клеточных органоидов и т.д. Каждая клетка имеет свой специфический набор белков, характерный именно для нее. Он отличается от набора белков, характерного для клеток другого организма и для клеток других тканей данного организма, поскольку в каждой клетке осуществляется синтез специфичных для нее белков. Информация о том, какие белки должны синтезироваться в клетках данного организма, хранится в ядре и в ДНК-содержащих органоидах (митохондриях и пластидах), она записана в виде последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК. Часть молекулы ДНК, последовательностью нуклеотидов в которой определяется последовательность аминокислот в индивидуальном белке, называется геном. В молекуле ДНК в зависимости от эволюционного пути организма может содержаться от сотен до десятков тысяч генов.

Каким же образом последовательность нуклеотидов определяет последовательность аминокислот? Молекула ДНК построена из четырех типов нуклеотидов, т.е. вся информация, закодированная в ДНК, записана всего четырьмя "буквами" (А, Г, Т, Ц). Согласно математическим расчетам, для кодирования одной аминокислоты требуется более одной "буквы" (одного нуклеотида), так как в белках обнаруживается 20 различных аминокислот. Поскольку из 4 нуклеотидов можно составить лишь 16 различных комбинаций по два нуклеотида (4^2=16), что меньше 20, то "слово", кодирующее определенную аминокислоту, должно состоять более чем из двух "букв". Если записывать кодирующее "слово" сочетанием трех "букв" (нуклеотидов), то число различных вариантов будет составлять 4^3=64. Этого количества комбинаций более чем достаточно для кодирования 20 аминокислот. Действительно, у всех живых организмов код ДНК триплетный: каждая аминокислота "записывается" комбинацией из трех нуклеотидов (триплетом).

Сочетания из трех нуклеотидов, кодирующие определенные аминокислоты, называются кодом ДНК, или генетическим кодом. В настоящее время код ДНК полностью расшифрован, т.е. известно, какие конкретно триплетные сочетания нуклеотидов кодируют входящие в состав белка 20 аминокислот. Пользуясь комбинацией, состоящей из трех нуклеотидов, можно сделать значительно большее количество кодирующих "слов", чем это необходимо

488
для кодирования 20 аминокислот. Оказалось, что одна аминокислота может кодироваться более чем одним триплетом, т.е. генетический код вырожден. Так, например, аминокислоты лейцин и аргинин кодируются не одним, а шестью разными триплетами. Только две аминокислоты (триптофан и метионин) кодируются одним триплетом. Нужно отметить, что термин "вырожденный" не означает "неточный", так как один триплет не может кодировать две аминокислоты. Триплеты в молекуле иРНК, кодирующие определенные аминокислоты, называются кодонами.

Существенная особенность генетического кода заключается в том, что в нем отсутствуют сигналы, отделяющие одно кодирующее трехбуквенное "слово" от другого. Именно поэтому считывание информации должно начинаться с правильного места молекулы ДНК (или иРНК) и продолжаться последовательно от одного кодона к другому в пределах так называемой "рамки считывания". В противном случае последовательность нуклеотидов окажется измененной во всех кодонах. Это подтверждается обнаружением мутаций, при которых из последовательности либо выпадает (делеция), либо встраивается в нее (вставка) один или два нуклеотида. При этих мутациях в результате сдвига рамки считывания с молекулы иРНК синтезируется дефектный белок с совершенно другой первичной структурой. В том случае, если выпадает или встраивается три нуклеотида, синтезируется белок, который отличается от нормального отсутствием одной аминокислоты (в случае делеции трех нуклеотидов) или появлением дополнительной аминокислоты (в случае вставки трех нуклеотидов).

Еще одна особенность генетического кода заключается в том, что три триплета (УАА, УАГ и УГА) кодируют не аминокислоты, а своеобразные "знаки препинания". Они являются стоп-сигналами, которые сигнализируют об окончании синтеза полипептидной цепи, и называются бессмысленными кодонами, или стоп-кодонами.

Генетический код универсален, т.е. триплеты, кодирующие одну и ту же аминокислоту, одинаковы у всех живых существ: один и тот же кодон кодирует определенную аминокислоту как у человека, так и у вируса, бактерии или растения. Таким образом, генетический язык одинаков для всех видов, т.е. с одной молекулы иРНК будет синтезироваться одинаковый белок и в клетках человека, и в клетках мыши, и в клетках растений, грибов или бактерий. Универсальность генетического кода свидетельствует о том, что он возник в процессе эволюции почти в том виде, в котором существует и сегодня.

Эта важнейшая особенность генетического кода широко используется в последнее время в одном из направлений биотехнологии ╫ генетической (генной) инженерии. Генетическая инженерия ╫ это раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых

489
комбинаций генетического материала. Искусственно созданный генетический материал способен размножаться в клетке-хозяине и обеспечивать синтез закодированных в нем белковых продуктов. Возникновение генной инженерии стало возможно благодаря развитию молекулярной биологии, генетики, биохимии и микробиологии.

Метод генной инженерии включает три основных этапа:

╒ получение нужного гена (выделение гена из природного источника или его искусственный синтез);

╒ включение этого гена в молекулу ДНК-переносчика ╫ получение рекомбинантной (гибридной) молекулы ДНК (рекДНК);

╒ введение рекДНК (с включенным в нее новым геном) в бактериальную клетку или в клетку растения или животного (трансформация), где она встраивается в генетический аппарат.

Гибридная ДНК имеет обычно вид кольца и называется плазмидой. Она содержит нужный ген (или несколько генов) и вектор. Вектор ╫ это фрагмент ДНК, обеспечивающий проникновение и размножение гибридной ДНК в клетке-хозяине и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы ╫ белков. Большая часть векторов получена на основе фагов, вирусов, плазмид дрожжей и различных бактерий. После введения рекДНК в клетку-хозяина активируется синтез белка с расположенных на ней генов. Наиболее часто в качестве клетки-хозяина используют кишечную палочку, однако применяют и другие бактерии, дрожжи, животные или растительные клетки.

Ключевую роль в конструировании гибридной ДНК играют два типа ферментов: рестриктазы рассекают молекулу ДНК на фрагменты по строго определенным местам, аДНК-лигазы сшивают фрагменты ДНК в единое целое. Только после выделения таких ферментов создание искусственных генетических структур стало технически выполнимой задачей.

Гены, подлежащие клонированию (т.е. выделению, очистке от примесных фрагментов ДНК и дальнейшему размножению и практическому использованию), могут быть получены в составе фрагментов путем дробления молекулы ДНК. Но многие гены приходится либо синтезировать химически, либо получать в виде ДНК-копии (или кДНК) с иРНК, соответствующих избранному гену, с помощью фермента обратной транскриптазы. При получении рекДНК чаще всего образуется несколько структур, из которых нужна только одна. Поэтому обязательно проводят селекцию трансформированных клеток для отбора клонов, содержащих нужную рекДНК.

В результате интенсивного развития методов генетической инженерии получены клоны микроорганизмов, продуцирующих инсулин и другие пептидные гормоны человека, интерферон человека и многие другие белки. Это позволило создавать штаммы бактерий, производящих многие биологически активные вещества, используемые в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности. Инсулин человека, полученный с помощью рекДНК, уже допущен для лечебного применения.

Реакции матричного синтеза. Синтез белка осуществляется на рибосомах в цитоплазме клетки. В то же время информация о последовательности аминокислот в белке хранится в ДНК (в ядре). Как говорилось выше, перед началом синтеза определенного белка в ядре образуется иРНК ╫ посредник, переносящий информацию от ДНК к рибосомам. Молекула иРНК синтезируется с ис-

490
Рис.Х.ЗЗ. Реакции матричного синтеза при реализации генетической информации. На участке молекулы ДНК (гене), как на матрице, синтезируется молекула иРНК (транскрипция), а затем на этой молекуле иРНК, как на матрице, происходит синтез молекулы белка (трансляция)

пользованием в качестве матрицы определенного участка ДНК (гена). Затем молекула иРНК покидает ядро (в случае клеток эукариот) и перемещается в цитоплазму. Связываясь с рибосомами, она в свою очередь служит матрицей, на которой происходит синтез белка (рис.Х.ЗЗ).

Синтез иРНК осуществляется в ядре с помощью фермента, называемого ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Вновь синтезированная иРНК имеет нуклеотидный состав, коплементарный нуклеотидному составу использованной для копирования нити ДНК, и является точной копией второй нити с той лишь разницей, что остаткам аденина во второй нити ДНК-матрицы соответствуют остатки урацила в синтезированной иРНК. Таким образом, информация, имеющаяся в гене, в процессе синтеза иРНК "переписывается" на нее. Этот процесс называется транскрипцией (переписыванием).

Процесс транскрипции вместе с реакцией самоудвоения ДНК (репликацией ╫ см. выше) относят к реакциям матричного синтеза, т.е. реакциям, которые идут с использованием матрицы. Матрица ╫ это готовая структура, в соответствии с которой осуществляется синтез новой структуры. При синтезе ДНК (репликации) и синтезе иРНК в качестве матрицы используется одна из нитей ДНК, на которой образуется комплементарная ей нить (см. рис.Х.28). Таким образом, в результате реакций матричного синтеза образуются структуры, построенные по строго определенному плану. Реакции матричного синтеза характерны лишь для живой природы, в результате их осуществления становится возможным передача информации от одного поколения живых существ к потомству, а также синтез молекул белков в соответствии с информацией, заложенной в генетическом материале. Для синтеза

491
белковых молекул необходимо осуществление двух типов реакций матричного синтеза: транскрипции, которая обеспечивает перенос генетической информации от гена в молекуле ДНК на иРНК, и трансляции.

Термином трансляция (перевод) в биологии обозначают реакции, в результате которых в рибосомах с использованием иРНК в качестве матрицы синтезируется полипептидная цепь. Это также реакция матричного синтеза. Полипептидная цепь удлиняется в процессе синтеза путем последовательного присоединения отдельных аминокислотных остатков, начиная с N-концевого. Для того чтобы понять, каким образом осуществляется образование пептидной связи между соответствующими аминокислотами, необходимо рассмотреть структуру рибосом и транспортных РНК (тРНК), участвующих в процессе трансляции.

Рибосомы эукариот имеют диаметр около 22 нм и молекулярную массу около 4 млн дальтон. Рибосомы прокариот, а также рибосомы митохондрий и пластид более мелкие. Каждая из них состоит из двух неравных субъединиц (большой и малой), причем субъединицы могут отделяться друг от друга. В состав каждой субъединицы входят рибосомальная РНК (рРНК) и большое количество разных белков. Некоторые белки рибосом выполняют каталитические функции, т.е. являются ферментами.

Молекулы тРНК невелики: в их состав входит 75╫90 нуклеотидов, молекулярная масса составляет 23000╫30000 дальтон. В процессе синтеза полипептидной цепи тРНК приносят в рибосомы определенные аминокислоты, при этом каждая аминокислота имеет соответствующие транспортные тРНК (рис.Х.34). Все молекулы тРНК способны образовывать характерную конформацию ╫ конформацию клеверного листа. Она возникает потому, что в структуре молекулы тРНК имеется значительное количество зон, областей (по 4╫7 нуклеотидов в одном участке), комплементарных друг другу. Внутримолекулярное спаривание таких нуклеотидов за счет образования водородных связей (формирование "шпилек") и приводит к образованию такой структуры.

У верхушки клеверного листа располагается триплет нуклеотидов, который комплементарен соответствующему кодону иРНК. Этот триплет различен для тРНК, переносящих разные аминокислоты, и соответствует именно той аминокислоте, которая переносится данной тРНК. Он называется антикодоном. У основания клеверного листа находится участок, в котором связывается аминокислота. Связывание аминокислоты с тРНК осуществляется за счет образования связи между карбоксильной группой аминокислоты и OH-группой остатка рибозы аденилового нуклеотида, располагающегося в концевой части молекул всех тРНК. Таким образом, молекула тРНК не только переносит определенную аминокислоту, она имеет в своей структуре запись о том, что она пере-

492
носит именно эту аминокислоту, причем запись сделана на языке генетического кода.

Реакцию связывания аминокислот с тРНК катализируют специальные ферменты ╫ аминоацил-тРНК-синтетазы. Эта реакция требует затрат энергии и сопровождается расщеплением АТФ, причем от молекулы АТФ в этой реакции отщепляются сразу два остатка фосфорной кислоты ╫ пирофосфат, который быстро расщепляется специальным ферментом на два остатка фосфорной кислоты. Таким образом, для "активации" одной аминокислоты, т.е. для ее присоединения к молекуле тРНК с образованием аминоацил-тРНК, требуется энергия двух макроэргических связей молекулы АТФ. В общем виде реакцию присоединения аминокислоты к тРНК можно записать в следующем виде:

аминокислота + тРНК + АТФ ? аминоацил-тРНК + АМФ + 2ФН.

Рибосомы способны связывать иРНК, несущую информацию об аминокислотной последовательности синтезируемого белка, тРНК, несущие аминокислоты, и, наконец, синтезируемую полипептидную цепь. Малая субъединица рибосомы обеспечивает "расшифровку" генетической информации: она связывает иРНК и тРНК, несущую первую (N-концевую) аминокислоту полипептидной цепи. После этого связывается большая субъединица и образуется функционирующая (работающая) рибосома. Затем в рибосому поступает вторая молекула аминоацил-тРНК. Большая субъединица рибосомы катализирует образование пептидной связи между аминокислота-

493
ми, принесенными в рибосому двумя молекулами тРНК (реакцию транспептидации).

Процесс синтеза белка можно условно разделить на три фазы: начало синтеза белка (инициацию), т.е. присоединение к малой субъединице иРНК первой аминоацил-тРНК и большой субъединицы, удлинение белковой цепи (элонгацию) за счет последовательного продвижения рибосомы по молекуле иРНК и переноса синтезируемого полипептида на вновь прибываемые молекулы аминоацил-тРНК, и окончание синтеза (терминацию), когда рибосома встречает в молекуле иРНК стоп-кодон (сигнал об окончании синтеза) и освобождает молекулу синтезированного белка.

По мере сборки полипептидной цепи рибосома передвигается вдоль нитевидной молекулы иРНК. Одновременно на одной молекуле иРНК может находиться несколько рибосом, каждая из которых осуществляет синтез полипептидной цепи, закодированной этой иРНК. Такую структуру называют полисомой. Чем дальше по цепи иРНК продвинулась рибосома, тем больший по длине фрагмент молекулы белка будет синтезирован. Когда рибосома достигает конца рамки считывания молекулы иРНК, синтез белка заканчивается и рибосома распадается на субъединицы, освобождает вновь синтезированный белок, после чего малая субъединица покидает молекулу иРНК. Считывание информации с молекулы иРНК возможно только в одном направлении.

Следует отметить, что как для инициации трансляции (связывания с малой субъединицей рибосомы иРНК, первой аминоацил-тРНК и большой субъединицы), так и для терминации трансляции (освобождения рибосомой синтезированного белка, и РНК и ее разделения на две субъединицы) необходимы специальные белки ╫ факторы инициации и факторы терминации. Эти белки содержат связанную молекулу ГТФ, которая гидролизуется до ГДФ и Фн при их взаимодействии с рибосомой. Таким образом, начало и окончание трансляции требуют затрат энергии.

Еще в процессе синтеза вновь образованный конец полипептидной цепи может связываться со специальными белками шаперонами, обеспечивающими ее правильную укладку, а затем белок транспортируется к аппарату Гольджи, где он может дополнительно модифицироваться, или в те органоиды и участки клетки, где он будет работать. Рибосома, которая освободилась от иРНК и синтезированной полипептидной цепи, диссоциирует (распадается) на субъединицы, после чего малая субъединица, связавшись с новой молекулой иРНК, может связать большую субъединицу и образовать активную рибосому, способную начать синтез нового (или того же самого) белка.

Активный центр рибосомы, в котором осуществляется образование пептидной связи между двумя соседними аминокислотами, устроен таким образом, что в нем одновременно могут находиться два соседних кодона (триплета) иРНК.

494
На первом этапе синтеза белка тРНК связывается с иРНК за счет взаимодействия кодон-антикодон (см. рис.Х.24). Поскольку антикодон, расположенный на тРНК, и кодон, находящийся на иРНК, комплементарны, между входящими в их состав азотистыми основаниями образуются водородные связи. На втором этапе аналогичным образом осуществляется связывание с соседним кодоном второй молекулы тРНК. При этом молекулы тРНК ориентируются в активном центре рибосомы таким образом, что карбоксильная группа первого аминокислотного остатка, связанного с первой тРНК, оказывается поблизости от свободной аминогруппы аминокислотного остатка, входящего в состав второй тРНК. Таким образом, за счет взаимодействия кодон-антикодон между последовательно расположенными кодонами иРНК и соответствующими антикодонами тРНК рядом оказываются именно те аминокислоты, которые последовательно закодированы в иРНК.

На следующем этапе в результате взаимодействия свободной аминогруппы, входящей в состав аминокислотного остатка вновь пришедшей (второй) тРНК, с этерифицированной карбоксильной группой С-концевого аминокислотного остатка первой аминокислоты происходит реакция. Она осуществляется путем замещения, причем уходящей группой является молекула первой тРНК. В результате такого замещения вторая молекула тРНК, несущая уже дипептид, оказывается связанной с рибосомой. Для катализа этой реакции требуется фермент, называемый пептидилтрансферазой, который входит в состав большой субъединицы рибосомы.

На следующем этапе рибосома перемещается по молекуле иРНК "на один шаг" так, что тРНК со связанным пептидом оказывается в том участке рибосомы, в котором была связана первая молекула тРНК. Этот процесс перемещения является результатом изменения конформации рибосомы. При этом в активном центре рибосомы оказывается следующий кодон иРНК, к которому присоединяется следующая молекула тРНК, после чего описанные выше события повторяются.

Процесс удлинения полипептидной цепи (элонгация) также требует определенных затрат энергии. Для связывания с рибосомой аминоацил-тРНК и для удаления из активного центра рибосомы свободной тРНК требуется взаимодействие с рибосомой двух специальных белков ╫ факторов элонгации. Эти белки способны связывать молекулы макроэргического соединения ╫ ГТФ, а их взаимодействие с рибосомой сопровождается гидролизом ГТФ до ГДФ и Фн. Таким образом, каждый "шаг" рибосомы, т.е. удлинение полипептидной цепи на одну аминокислоту, сопровождается затратой энергии двух макроэргических связей. Освобождаемая при этом энергия затрачивается не на образование пептидной связи (для этого достаточно энергии, "запасенной" в молекуле аминоацил-тРНК), а на изменение конформации рибосомы, что значительно ускоряет связывание с ней аминоацил-тРНК и диссоциацию свободных тРНК. Поэтому синтез белка в отсутствие факторов элонгации и ГТФ может протекать только с очень низкой скоростью.

495
В нормальных условиях синтез белка осуществляется с высокой скоростью. Так, у прокариот скорость трансляции составляет от 10 до 15 триплетов в секунду, т.е. белок, состоящий из 600 аминокислот, синтезируется менее чем за 1 минуту. У эукариот скорость трансляции варьирует в более широких пределах: от 1 до 10 триплетов в секунду в зависимости от типа клеток, их физиологического состояния и природы транслируемой иРНК.

Как было показано выше, все процессы синтеза, в результате которых из более простых молекул образуются более сложные, осуществляются с затратой энергии. Биосинтез белка представляет собой цепь реакций, протекающих с затратой энергии. Так, для связывания самой аминокислоты с тРНК требуется энергия двух макроэргических фосфатных связей. Кроме того, при образовании самой пептидной связи используется энергия еще двух макроэргических фосфатных связей. Таким образом, для образования одной пептидной связи в молекуле белка требуется такое количество энергии, которое запасено в четырех макроэргических связях молекул АТФ и ГТФ. Энергия затрачивается также на стадии инициации и терминации трансляции.

ВЗАИМОСВЯЗЬ ПРОЦЕССОВ ПЛАСТИЧЕСКОГО И ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА

Итак, процесс биосинтеза белка ярко демонстрирует, что пластический и энергетический обмен неразрывно связаны. Они представляют собой две стороны одного процесса ╫ обмена веществ. Биосинтез белка, синтез нуклеиновых кислот, углеводов и жиров требует затрат энергии в виде макроэргических связей АТФ. Накапливается АТФ в процессе энергетического обмена. С другой стороны, для протекания разных стадий энергетического обмена необходимы белки-ферменты и различные внутриклеточные структуры, например мембраны митохондрий для окислительного фос-форилирования, которые являются продуктами пластического обмена. Поскольку внутриклеточные органоиды и различные белки в результате жизнедеятельности постепенно разрушаются, пластический обмен должен протекать постоянно для их непрерывного обновления. Это, в свою очередь, требует непрерывного поддержания высокого уровня АТФ в клетке, что достигается в результате постоянного протекания реакций энергетического обмена. В организме человека, например, в течение суток образуется и расходуется около 50 кг АТФ.