Допинг контроль. Лабораторная экспресс-диагнос-тика бета-адреномиметиков. Кленбутирол. Сальбутамол. Сальметерол
Биосенсорный анализ определения кленбутирола в волосах
жүктеу/скачать 6.12 Mb.
|
| Биосенсорный анализ определения кленбутирола в волосах
Экстракция: Образцы волос помещают в стеклянные пробирки на 50 мл и дважды промывают деионизированной водой и один раз этанолом, после чего их сушат в вакууме при комнатной температуре . Высушенные волосы разрезают на кусочки по 1 см, и 200 мг волос помещают в стеклянную пробирку, в которую был добавлен 2,5 мл экстракционного раствора (100 мМ NaOH). Образцы встряхивают и инкубируют в водяной бане при 100° С в течение 30 мин, затем дают остыть до комнатной температуры. Экстракты очищают центрифугой микрофильтрации ультрафильтрацией с отсечкой 3000 Дальтон (120 мин, 14 000 / г) до биосенсорного анализа. Биосенсорный анализ Многоразовый чип с покрытием из кленбутерола, использованный в текущем эксперименте, был приготовлен путем ковалентной иммобилизации кленбутерола на поверхности сенсорного чипа CM5 с использованием аминосцепления, опосредованного тиофосгеном, как описано Johansson and Hellenäs ( 2001 ). Образцы и калибровочные стандарты в объединенных экстрактах волос смешивали (1 + 1) с антисывороткой, разбавленной до 1/1000, в проточном буфере двойной силы [20 мМ HEPES (рН 7,5) с 1 М NaCl, 6,8 мМ ЭДТА и 0,01% Р20] до анализ. Вторичное козлиное анти-кроличье антитело (z421) разбавляли рабочим буфером до 37,5 мкг мл -1 . Сенсорный чип с покрытием из кленбутерола помещали в биосенсор. Рабочий буфер [10 мМ HEPES (рН 8,2) с 0,5 М NaCl, 3,4 мМ ЭДТА и 0,005% Р20] прокачивали по поверхности при непрерывном потоке 30 мкл мин -1 . Образец, смешанный с первичным антителом, инъецировали в течение 120 с, а затем через 60 с вводили вторичное антитело через 60 с. В конце каждого цикла поверхность регенерировали двумя 30-секундными импульсами регенерационного раствора (10 мМ глицин / HCl pH 1,5 с 20% ДМФА и 100 мМ NaOH соответственно) Одной из целей этого исследования была разработка анализа, позволяющего проводить прямой анализ без необходимости очистки образца. Мягкие методы экстракции были исследованы для получения экстрактов образцов с минимумом мешающих соединений. Образцы волос экстрагировали карбонатным буфером и растворами NaOH в диапазоне 50–200 мМ, чтобы найти оптимальные условия для максимизации извлеченного количества кленбутерола без разложения волос. РН экстрактов волос варьировался от рН 9 при экстракции карбонатным буфером до рН 12 при экстракции 200 нМ NaOH. Все концентрации NaOH давали экстракты с более высоким выходом кленбутерола, чем экстракты карбонатного буфера.Экстракция 100 мМ NaOH дает приемлемое восстановление кленбутерола без добавления большого количества продуктов гидролиза в экстракте волос. При использовании более высокой концентрации NaOH волосы полностью разлагались, и фон в экстрактах заметно увеличивался. жүктеу/скачать 6.12 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|