Инструкция по применению Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием пцр в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией hrm
жүктеу/скачать 3.31 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫДНК, выделенная с использованием набора реагентов для выделения ДНК QIAGEN (Кат.№ 56404) из парафинизированных блоков опухолевой ткани, предварительно зафиксированной в забуференном формалине.
Протокол 1: Оценка проб Определение суммарной ДНК в пробах Перед началом работы прочитайте «Важные замечания. Перед тем, как начать работу по протоколу ознакомьтесь с инструкцией к прибору Rotor-Gene Q.
Перед каждым применением все реактивы должны быть полностью разморожены, перемешаны (переворачиванием пробирки, 10 раз) и кратковременно центрифугированы. Перед каждым применением убедитесь, что Taq ДНК-полимераза находится при комнатной температуре (15–25°C). Кратковременно центрифугируйте пробирку для локализации фермента на дне пробирки.
2. Приготовьте достаточное количество мастер-миксов (контрольная реакционная смесь (Ctrl) плюсTaq ДНК-полимераза (Taq)) для проб ДНК, одну реакцию положительного контроля и одну реакцию отрицательного контроля (ОК) в соответствии с объемами, * Все приборы должны быть поверены и откалиброваны в соответствии с рекомендациями производителя. приведенными в Таблице 7.1. Добавьте в расчет реактивы для 1 дополнительной пробы. Мастер-микс содержит все компоненты, необходимые для ПЦР за исключением образца. Не встряхивайте Taq ДНК-полимеразу (Taq) на вортексе, так как это может инактивировать фермент. Убедитесь, что Taq ДНК-полимераза перед использованием находится при комнатной температуре. Кратковременно центрифугируйте флакон, чтобы быть уверенным, что весь фермент находится у дна пробирки. Пипеткой отберите ДНК-полимеразу (Taq), размещая наконечник пипетки прямо под поверхностью жидкости во избежание обволакивания наконечника избытком фермента. Таблица 7.1. Приготовление контрольного мастер-микса
* При приготовлении мастер-микса готовьте так, чтобы хватило еще на 1 пробу. 3. Перемешайте мастер-микс, аккуратно втягивая и выпуская пипеткой. Сразу же добавьте 20 мкл мастер-микса в каждую пробирку Rotor-Gene. 4. В пробирки немедленно добавьте по 5 мкл образца, BRAF -положительного контроля (ПК) и воды, свободной от нуклеаз (H2O) (для ОК). 5. Закройте пробирки для ПЦР и разместите их в соответствующих положениях в диск Rotor-Disc™. Если ротор загружен неравномерно, уравновесьте его дополнительными пустыми пробирками Rotor-Gene Q.
Проследите, чтобы запирающее кольцо прибора Rotor-Gene Q размещалось на верхней части ротора для предотвращения случайного открывания пробирок при анализе. 7. Для оценки проб создайте температурный профиль в соответствии со следующими этапами.
Все спецификации относятся к программному обеспечению Rotor-Gene Q версии 2.0.2. Пожалуйста, найдите дальнейшие сведения по программированию приборов Rotor-Gene Q в руководстве по применению прибора. На иллюстрациях эти установки обведены толстыми черными рамками. Иллюстрации показаны для приборов Rotor-Gene Q. 8. Дважды щелкните значок программы Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2. На рабочем столе компьютера, присоединенного к прибору Rotor-Gene Q, выберете вкладку “Advanced” (Усложненный) в появившемся диалоговом окне “New Run” (Новый анализ). 9. Для создания нового шаблона выберите “Empty Run” (Холостой запуск), а затем нажмите “New” (Новый), чтобы ввести “New Run Wizard” (Мастер нового запуска). 10. Выберите 72-Well Rotor (72-гнездный ротор) в качестве типа ротора. Отметьте, что запирающее кольцо присоединено. Поставьте галочку в квадрате “Locking Ring Attached” (Запирающее кольцо присоединено) и нажмите “Next” (Далее) (Рис. 7.1). 
Рис. 7.1. Диалоговое окно «Мастер нового запуска. 11. Вставьте имя оператора, введите 25 мкл в качестве объема реакции и добавьте любые дополнительные примечания. Щелкните “Next” (Рис. 7.2). 
Рис. 7.2. Установка общих параметров анализа. 12. Щелкните кнопку “Edit Profile” (Редактировать профиль) в следующем диалоговом окне “New Run Wizard” (Рис. 7.3) и запрограммируйте температурный профиль в соответствии с информацией на следующих этапах. 
Рис. 7.3. Редактирование профиля 13. Щелкните кнопку “Insert after” («Ввести после») и выберите “New Hold at Temperature” («Новая выдержка при температуре») (Рис. 7.4). Щелкните “60”, чтобы изменить температуру на 95°C.
Рис. 7.4. Первоначальный этап инкубации при 95°C. 14. Щелкните “60°C” И замените “Hold Temperature” («Температура выдержки») на 95°C, щелкните “1” для замены “Hold Time” («Время выдержки») на 15 мин. Щелкните кнопку “Insert After” («Ввести после»), а затем выберите “New Cycling” («Новая амплификация») (Рис. 7.5). 
Рис. 7.5. Начальный этап инкубации при 95°C. 15. Установите число циклов на 40, нажав число. Выберите “95°C на 20 секунд”. Установите время “20 secs” («20 с») (Рис. 7.6). 
Рис. 7.6. Этап амплификации при 95°C. 16. Поместите засветку на “60°C for 20 secs”. Установите время до 60 секунд и температуру до 55°C. Выберите кнопку “Not Acquiring” («Не запрашивать») (Рис. 7.7). 
Рис. 7.7. Этап амплификации при 55°C. 17. В панели “Available Channels” («Доступные каналы») выберите “Yellow” («Желтый») и “Green” («Зеленый») каналы для запроса, подсвечивая их, а затем нажмите “>”, чтобы перенести их в панель “Acquiring Channels” («Запрашиваемые каналы») (Рис. 7.8).
Рис. 7.8. Запрос на этапе амплификации при 55°C. 18. Поставьте подсветку на “72°C for 20 secs” и удалите этот раздел, затем нажмите “OK” (Рис. 7.9). 
Рис. 7.9. Этап устранения расширения. 19. Щелкните “Next” для сохранения шаблона, выберите “Save Template” («Сохранить шаблон»), а затем сохраните шаблон в папку шаблонов. 20. Проверьте программирование и затем щелкните “Start Run” («Запустить анализ») для сохранения файла анализа и его запуска (Рис. 7.10). 
Рис. 10. Запуск анализа. 21. После запуска анализа появляется новое окно, в котором вы теперь можете либо ввести названия проб, либо щелкнуть “Finish” («Закончить») и ввести их позже. 22. Сохраните все данные в соответствующей папке. См. п.8. Анализ данных. 23. По окончании анализа проанализируйте данные. 24. Определите значения CT отрицательного контроля (ОК), чтобы убедиться в отсутствии загрязнения, дающего положительную амплификацию, в канале FAM (CT <40) или неудачного внутреннего контроля в канале HEX (значения CT <33 и> 37), указывающего на проблему с постановкой. Положительный контроль BRAF (ПК) давать контрольные значения CT (канал FAM) между 24.13–30.13. Данные анализа проб не должны учитываться, если хотя бы один из 2 контролей оказался неудачным. Значение контроля проб CT между CT 24.25–30.00: Это - приемлемый диапазон, присутствует достаточное количество ДНК для оптимальной работы набора реагентов. Значение контроля проб CT между >30.00–35.00: интерпретируйте с осторожностью, так как очень низкий уровень мутаций может не обнаруживаться. Значение контроля проб CT между >35.00–45.00: В таких пробах присутствует лишь несколько пригодных к амплификации копий ДНК, и мутации можно увидеть только если большинство копий мутировало. Примечания: Если проба дает позднее значение CT для контроля, внутренний контроль пробы CT должен сравниваться с отрицательным контролем. Если внутренний контроль пробы замедленный или отрицательный по сравнению с ОК, может происходит ингибирование реакции. Разведение пробы может снизить действие ингибитора, однако это также разбавит ДНК. Разведение пробы: Контроль CT <24,25 перегрузит анализы мутаций. Пробы с контролем CT <24,25 должны разбавляться. Чтобы увидеть каждую мутацию на низком уровне, концентрированные пробы должны разбавляться так, чтобы были в пределах >24,25 и <30.00, основываясь на том, что разбавление вдвое увеличит CT на 1. Протокол 2: Выявление мутаций в гене BRAF и анализ данных Выявление мутаций BRAF и анализ данных Перед началом работы прочитайте «Важные замечания». Перед тем, как начать работу по протоколу ознакомьтесь с инструкцией к прибору Rotor-Gene Q. Для эффективного использования набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)», образцы должны быть сгруппированы в партии 24. Меньший размер партии 12 также допустим, но постановка менее 12 реакций можно будет протестировать данным набором меньшее число проб. Для каждой пробы ДНК в одном и том же ПЦР-анализе должны ставиться контроль и проба на мутации во избежание вариаций от анализа к анализу.
Перед каждым применением все реактивы должны быть полностью разморожены, перемешаны (переворачивая 10 раз) и кратковременно центрифугированы. Перед каждым применением убедитесь, что Taq ДНК-полимераза находится при комнатной температуре (15–25°C). Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы собрать фермент на дне.
1. Разморозьте реакционные смеси и положительный контроль BRAF при комнатной температуре (15–25°C). Когда реакционные смеси и положительный контроль BRAF растают, перемешайте их, переворачивая каждую пробирку по 10 раз во избежание локального концентрирования солей. 2. Выполните предварительный запуск Rotor-Gene Q. Примечания: Можно не проводить данную процедуру, если прошло не более 90 минут после использования прибора. Предварительный запуск занимает приблизительно 42 минуты, см. п.8.5: Выполнение предварительного запуска”. 3. Приготовьте достаточное количество мастер-миксов (контрольная реакционная смесь (Ctrl) плюсTaq ДНК-полимераза (Taq)) для проб ДНК, одна реакция положительного контроля и одна реакция отрицательного контроля без матрицы в соответствии с объемами, приведенными в Таблице 7.2. Включите реактивы для 1 дополнительной пробы. Мастер-микс содержит все компоненты, необходимые для ПЦР за исключением пробы. Таблица 7.2. Приготовление контрольного мастер-микса
* При приготовлении мастер-микса готовьте так, чтобы хватило еще на 1 пробу. 4. Перемешайте аккуратно мастер-микс пипетированием. Сразу же добавьте по 20 мкл мастер-микса в каждую пробирку Rotor-Gene Q. 5. Немедленно добавьте по 5 мкл пробы, EGFR-положительного контроля и воды, свободной от нуклеаз для отрицательного контроля в каждую пробирку Rotor-Gene Q. Каждая проба ДНК должна сравниваться как с контролем, так и со всеми мутационными анализами. Расположение показано в Таблице 7.3. Таблица 7.3. Расположение контрольных (Ctrl) и мутационных анализов
* Бланк
6. Закройте пробирки Rotor-Gene Q и разместите их в соответствующих положениях в роторном диске. Если ротор загружен неравномерно, уравновесьте его дополнительными пустыми пробирками Rotor-Gene Q. 7. Сразу же поместите Rotor-Disc в прибор Rotor-Gene Q. Проследите, чтобы запирающее кольцо прибора Rotor-Gene Q размещалось на верхней части ротора для предотвращения случайного открывания пробирок при анализе. 8. Для оценки проб создайте температурный профиль в соответствии со следующими этапами.
Все спецификации относятся к программному обеспечению Rotor-Gene Q версии 2.0.2. Пожалуйста, найдите дальнейшие сведения по программированию приборов Rotor-Gene Q в руководстве по применению прибора. На иллюстрациях эти установки обведены толстыми черными рамками. Иллюстрации показаны для приборов Rotor-Gene Q. 8. Дважды щелкните значок программы Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2 на рабочем столе компьютера, присоединенного к прибору Rotor-Gene Q. Выберите вкладку “Advanced” («Усложненный») в появившемся диалоговом окне “New Run” («Новый запуск»). 9. Для создания нового шаблона выберите “Empty Run” («Холостой запуск»), а затем нажмите “New” («Новый»), чтобы ввести “New Run Wizard” («Мастер нового запуска»). 11. Выберите 72-Well Rotor (72-гнездный ротор) в качестве типа ротора. Отметьте, что запирающее кольцо присоединено. Поставьте галочку в квадрате “Locking Ring Attached” («Запирающее кольцо присоединено») и нажмите “Next” («Далее») (Рис. 7.11).
Рис. 7.11. Диалоговое окно «Мастер нового запуска». 12. Вставьте имя оператора, введите 25 мкл в качестве объема реакции и добавьте любые дополнительные примечания. Щелкните “Next (Рис. 7.12).
Рис. 7.12. Установка общих параметров анализа. 13. Щелкните кнопку “Edit Profile” («Редактировать профиль») в следующем диалоговом окне “New Run Wizard” (Рис. 7.13) и запрограммируйте температурный профиль в соответствии с информацией на следующих этапах. 
Рис. 7.13. Редактирование профиля. 14. Щелкните кнопку “Insert after” («Ввести после») и выберите “New Hold at Temperature” («Новая выдержка при температуре») (Рис. 7.14). Щелкните “60”, чтобы изменить температуру на 95°C. 
Рис. 7.14. Начальный этап инкубации при 95°C. 14. Щелкните “60°C” И замените “Hold Temperature” («Температура выдержки») на 95°C, щелкните “1” для замены “Hold Time” («Время выдержки») на 15 мин. Щелкните кнопку “Insert After” («Вести после»), а затем выберите “New Cycling” («Новая амплификация») (Рис. 7.15).
Рис. 7.16. Этап амплификации при 95°C. 17. Поместите подсветку на “60°C” на 20 секунд. Установите температуру 55°C и время 60 секунд. Выберите кнопку “Not Acquiring” («Не запрашивать») (Рис. 7.17). 
Рис. 7.17. Этап амплификации при 55°C. 18. В панели “Available Channels” (Доступные каналы) выберите “Yellow” (Желтый) и “Green” («Зеленый») - каналы для запроса, подсвечивая их, а затем нажмите “>”, чтобы перенести их в панель “Acquiring Channels” (Запрашиваемые каналы) (Рис. 7.18). Кликните «ОК»
Рис. 7.18. Запрос на этапе 60°C. 19. Поставьте подсветку на “72°C for 20 secs” и удалите этот раздел, затем нажмите “OK” (Рис. 7.19). 
Рис. 7.19. Этап удаления расширения. 20. Щелкните кнопку “Gain Optimisation” («Оптимизация результатов») (Рис. 7.20).
Рис. 7.20. Оптимизация результатов. 20. Щелкните “Next” для сохранения шаблона, выберите “Save Template” («Сохранить шаблон»), а затем сохраните шаблон в папку шаблонов. 21. Проверьте сводку и затем щелкните “Start Run” («Запустить анализ») для сохранения файла анализа и его запуска (Рис. 7.21). 
Рис. 7.21. Запуск анализа. 22. После запуска анализа появляется новое окно, в котором можно либо ввести название проб, либо щелкнуть “Finish” («Закончить») и ввести их позже. 23. Сохраните все данные в соответствующей папке. 24. По окончании анализа проанализируйте данные. Информацию об анализе данных см. п.8.
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
