Методическое пособие к малому практикуму по биохимии и молекулярной биологии
Работа 11. Исследование некоторых свойств ферментов
жүктеу/скачать 1.21 Mb. Pdf көрінісі
|
| Работа 11. Исследование некоторых свойств ферментов
1. В л и я н и е р е а к ц и и с р е д ы н а а к т и в н о с т ь а м и л а з ы . Влия- ние рН на активность ферментов связано с изменением состояния иониза- ции фермента, субстрата или комплекса фермента и субстрата. Ход исследования В три пробирки наливают по 1 мл буферного раствора с заданным рН (5,0; 7,0; 9,0) соответственно, по 1 мл 0,1 %-ного раствора крахмала и по 1 мл слюны, разведенной в 100 раз (источник амилазы). Перемешивают и тотчас замечают время. Пробирки ставят в термостат с температурой 37 ºС. Через каждые 2 мин отбирают по 5 капель смеси из каждой пробир- ки в чистую пробирку и смешивают с каплей реактива Люголя до появле- ния в одной из пробирок желтого окрашивания, свидетельствующего о гидролизе крахмала. Затем в каждую пробирку с оставшейся смесью до- бавляют по 1 капле реактива Люголя. Объяснить полученные результаты и оформить в виде таблицы. Продолжительность реакции, мин Окраска в контрольной реакции при рН 5 7 9 2 Фиолетовая Фиолетовая Синяя 4 и т.д. 2. В л и я н и е т е м п е р а т у р ы н а с к о р о с т ь ф е р м е н т а т и в н о й р е- акции . Поскольку ферменты имеют белковую природу, они являются термолабильными соединениями. Оптимальное для работы ферментов значение температуры лежит в физиологических пределах, а снижение или повышение температуры приводит к снижению скорости катализируемой реакции. Ход исследования Перед началом работы в отдельной пробирке прокипятить 2 мл рас- твора амилазы (1 мл слюны, разведѐнной в 100 раз). Затем в четыре про- нумерованные пробирки вносят по 1 мл 0,1% раствора крахмала. В про- бирки 1, 2 и 4 добавляют 0,5 мл раствора амилазы, в 3 – 0,5 мл прокипя- ченного раствора амилазы. Пробирку 1 помещают в стакан с холодной во- дой (или на ледяную баню), пробирки 2 и 3 – в стакан с теплой водой 28 (38…40 °С), пробирку 4 – в кипящую водяную баню. Периодически через каждые 5 мин из пробирки 2 отбирают небольшое количество раствора пипеткой (2−3 капли), переносят на чистое предметное стекло и добавляют по капле реактива Люголя. Когда получена отрицательная проба на при- сутствие крахмала (раствор не окрашивается в синий цвет, т.к. прошел гидролиз крахмала), во все пробирки добавляют по одной капле реактива Люголя. Полученные данные представить в виде таблицы: № пробир- ки Температура, при кото- рой проводили реак- цию, ºС Окраска в контрольной реакции при продолжи- тельности реакции, мин 2 4 и т.д. 1 0 – +4 Фиолетовая Фиолетовая Синяя 2 38 – 40 3 100 (амилаза), 38 – 40 4 100 Сделать вывод по результатам проведѐнной работы. 3. В л и я н и е к о л и ч е с т в а с у б с т р а т а на с к о р о с т ь ф е р м е н т а - ти вной реа кции . При низких концентрациях субстрата наблюдается от- четливая линейная зависимость между его концентрацией и скоростью ре- акции. С увеличением количества субстрата скорость ферментативной ре- акции возрастает только до определенного значения: при избытке субстра- та скорость реакции постоянна и называется максимальной скоростью (V max ). Ход исследования В три пробирки вносят по 1 мл слюны, разведенной в 100 раз. Затем в первую пробирку добавляют 0,5 мл крахмала, во вторую – 1 мл, в третью – 5 мл. Замечают время и ставят в термостат с температурой 37 ºС. Из каж- дой пробирки через каждые 2 мин отбирают небольшое количество рас- твора чистой пипеткой (2−3 капли), переносят на чистое предметное стек- ло и смешивают с каплей реактива Люголя. Если реакция во всех вариан- тах положительна (синий цвет свидетельствует о присутствии крахмала), содержимое пробирок инкубируют еще две минуты и т.д. до отрицатель- ной реакции (желтый цвет) в двух вариантах. Затем в каждую пробирку с оставшейся смесью добавляют по капле реактива Люголя. Полученные ре- зультаты объяснить и оформить в виде таблицы. Продолжительность реакции, мин Окраска в контрольной реакции при разном количестве субстрата 0,5 мл 1,0 мл 5,0 мл 2 Фиолетовая Фиолетовая Синяя 4 и т.д. 29 4. В л и я н и е к о л и ч е с т в а ф е р м е н т а н а с к о р о с т ь ф е р м е н т а- ти вной реакции . Начальная скорость ферментативной реакции при условии избытка субстрата пропорциональна концентрации фермента: v=kE, где v – скорость реакции, k – константа скорости реакции, E – кон- центрация фермента. При графическом отражении этой зависимости полу- чается прямая линия, выходящая из начала координат. Ход исследования В три пробирки вносят по 1 мл крахмала. Затем в первую пробирку наливают 0,1 мл слюны, разведенной в 100 раз (источник амилазы), во вторую – 0,5 мл, в третью – 1 мл. Замечают время и ставят на водяную ба- ню или в термостат с температурой 37 ºС. Из каждой пробирки через каж- дые 2 мин отбирают небольшое количество раствора пипеткой (2−3 капли), переносят на чистое предметное стекло и смешивают с каплей реактива Люголя. Если реакция во всех вариантах положительна (синий цвет свиде- тельствует о присутствии крахмала), содержимое пробирок инкубируют еще две минуты и т.д. до отрицательной реакции (желтый цвет) в двух ва- риантах. Затем в каждую пробирку с оставшейся смесью добавляют по капле реактива Люголя. Полученные результаты объяснить и оформить в виде таблицы. Продолжительность реакции, мин Окраска в контрольной реакции при разном количестве фермента 0,5 мл 1,0 мл 5,0 мл 2 Фиолетовая Фиолетовая Синяя 4 и т.д. 5. А к т и в а т о р ы и и н г и б и т о р ы ф е р м е н т о в . Механизм действия активаторов и ингибиторов бывает очень сложным, но обычно сводится к их взаимодействию с функциональными группами активного центра или с аллостерическим центром. Ингибирование активности также может быть вызвано денатурацией молекулы белка-фермента. Ход исследования В три пробирки наливают по 1 мл слюны, разведенной в 100 раз. За- тем в первую пробирку наливают 1 мл 2 %-ного раствора NaCl, во вторую – 1 мл дистиллированной воды, в третью – 1 мл 2 %-ного раствора CuSO 4 . Содержимое пробирок хорошо перемешивают и добавляют по 1 мл крах- мала. Замечают время и ставят на водяную баню или в термостат с темпе- ратурой 37 ºС. Из каждой пробирки через каждые 2 мин отбирают неболь- шое количество раствора пипеткой (2−3 капли), переносят на чистое пред- 30 метное стекло и смешивают с каплей реактива Люголя. Если реакция во всех вариантах положительна (синий цвет свидетельствует о присутствии крахамала), содержимое пробирок инкубируют еще две минуты и т.д. до отрицательной реакции (желтый цвет) в одном из вариантов. Затем в каж- дую пробирку с оставшейся смесью добавляют по капле реактива Люголя. Полученные результаты объясняют и оформляют в виде таблицы. 4. С п е ц и ф и ч н о с т ь д е й с т в и я ф е р м е н т о в . Отличительным свойством ферментов служит их высокая специфичность. Она заключается в том, что каждый фермент действует на определенный субстрат или груп- пу субстратов, сходных по своему строению. Степень специфичности у разных ферментов проявляется по-разному. жүктеу/скачать 1.21 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|